本發(fā)明屬于天然藥物提取技術領域，尤其是一種從牛血中提取sod的方法。
背景技術：
sod是superoxidedismutase縮寫，中文名稱超氧化物歧化酶，是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內，如動物，植物，微生物等；sod具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質，sod在生物體內的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標；現(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達60多種，它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機制中sod的地位越來越重要。
目前，從動物血液中提取sod的方法有很多，其中專利cn201010241815.0公開了一種大規(guī)模工業(yè)化從牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，將新鮮的牛血液或羊血液經過抗凝、低滲溶血、超濾、通過帶有熱源/冷源的攪拌機快速升降溫、沉淀、3級溫度處理：第一級：45-55℃；第二級：55-60℃；第三級：60-65℃、鹽析、超濾及濃縮、冷凍干燥等生產步驟處理后得到純度較高的sod，但提取過程過于復雜，耗時長，成本高。
技術實現(xiàn)要素：
為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種從牛血中提取sod的方法。
具體是通過以下技術方案得以實現(xiàn)的：
一種從牛血中提取sod的方法，包括以下步驟：
(1)預處理：取新鮮牛血，加入抗凝劑攪拌破碎，離心得紅細胞；
(2)清洗：采用0.1～0.5％的生理鹽水清洗紅細胞，洗滌1～3次；
(3)溶血：洗滌后加入溶膜劑，調節(jié)溫度并攪拌，再放入超聲波中處理20～30s，得溶血液；
(4)加熱：溶血液中添加氯化銅和氯化鋅，攪拌均勻，離心后得到粗提液；
(5)一次離心：將粗提液加入0.3～0.4倍體積的氯仿-乙醇混合攪拌，離心棄沉淀，得到粗酶液；
(6)二次離心：向粗酶液中加入0.6～0.8倍體積的溶劑，離心取上清液；
(7)冷凍干燥：將上述上清液進行離心，得到沉淀加入緩沖液溶解，脫鹽后冷凍干燥即可。
所述抗凝劑為檸檬酸、肝素、edta、枸櫞酸鹽、草酸鉀中任一種。
所述溶膜劑的加入量為溶血液體積的15～20％。
所述溶膜劑按體積計算為10～20％的甲苯、5～10％的四氯化碳、余量為蛋清的混合液，
所述步驟(3)中調節(jié)溫度分為兩個階段，第一階段控制溫度為-10～-2℃，持續(xù)時間為8～10h，第二階段控制溫度為70～80℃，持續(xù)時間為6～8h。
所述氯化銅的用量為溶血液體積的2～3％，氯化鋅的用量為溶血液體積的1～2％。
所述超聲波的處理頻率為20～30khz。
所述溶劑為濃度75～80％的硫酸銨溶液。
本發(fā)明有益效果：
本發(fā)明中通過加入一定的溶膜劑，能夠克服采用機械方式破碎效果不佳的弊端，同時結合兩段溫度的控制，使得蛋白質的活性受到抑制，在結合超聲波的處理，進而使得紅細胞膜膜能夠完全被破碎，促使sod能夠從紅細胞中溶出，提高sod的提取率；本發(fā)明采用氯仿-乙醇和硫酸銨溶液進行兩次離心，提高sod的分離純化效果；因為有機溶劑的使用容易造成sod中銅離子和鋅離子的喪失，導致蛋白質的結構發(fā)生變化，通過添加氯化銅和氯化鋅后，可以為sod補充銅離子和鋅離子，使cu-zn-sod的結構穩(wěn)定，進而保證sod的酶活性。
本發(fā)明通過預處理、清洗、溶血、一次離心、二次離心、冷凍干燥共六個步驟完成牛血sod的提取，工藝簡單、提取效果顯著、產品純度高。
具體實施方式
下面結核具體的實施方式來對本發(fā)明的技術方案做進一步的限定，但要求保護的范圍不僅局限于所作的描述。
實施例1
一種從牛血中提取sod的方法，包括以下步驟：
(1)預處理：取新鮮牛血，加入抗凝劑攪拌破碎，離心得紅細胞；
(2)清洗：采用0.1％的生理鹽水清洗紅細胞，洗滌1次；
(3)溶血：洗滌后加入溶膜劑，調節(jié)溫度并攪拌，再放入超聲波中處理20s，得溶血液；
(4)加熱：溶血液中添加氯化銅和氯化鋅，攪拌均勻，離心后得到粗提液；
(5)一次離心：將粗提液加入0.3倍體積的氯仿-乙醇混合攪拌，離心棄沉淀，得到粗酶液；
(6)二次離心：向粗酶液中加入0.6倍體積的溶劑，離心取上清液；
(7)冷凍干燥：將上述上清液進行離心，得到沉淀加入緩沖液溶解，脫鹽后冷凍干燥，即可得到高純度的sod。
所述抗凝劑為檸檬酸。
所述溶膜劑的加入量為溶血液體積的15％。
所述溶膜劑按體積計算為10％的甲苯、5％的四氯化碳、余量為蛋清的混合液，
所述步驟(3)中調節(jié)溫度分為兩個階段，第一階段控制溫度為-10℃，持續(xù)時間為8h，第二階段控制溫度為70℃，持續(xù)時間為6h。
所述氯化銅的用量為溶血液體積的2％，氯化鋅的用量為溶血液體積的1％。
所述超聲波的處理頻率為20khz。
所述溶劑為濃度75％的硫酸銨溶液。
實施例2
一種從牛血中提取sod的方法，包括以下步驟：
(1)預處理：取新鮮牛血，加入抗凝劑攪拌破碎，離心得紅細胞；
(2)清洗：采用0.5％的生理鹽水清洗紅細胞，洗滌3次；
(3)溶血：洗滌后加入溶膜劑，調節(jié)溫度并攪拌，再放入超聲波中處理30s，得溶血液；
(4)加熱：溶血液中添加氯化銅和氯化鋅，攪拌均勻，離心后得到粗提液；
(5)一次離心：將粗提液加入0.4倍體積的氯仿-乙醇混合攪拌，離心棄沉淀，得到粗酶液；
(6)二次離心：向粗酶液中加入0.8倍體積的溶劑，離心取上清液；
(7)將上述上清液進行離心，得到沉淀加入緩沖液溶解，脫鹽后冷凍干燥，即可得到高純度的sod。
所述抗凝劑為肝素。
所述溶膜劑的加入量為溶血液體積的20％。
所述溶膜劑按體積計算為20％的甲苯、10％的四氯化碳、余量為蛋清的混合液，
所述步驟(3)中調節(jié)溫度分為兩個階段，第一階段控制溫度為-2℃，持續(xù)時間為10h，第二階段控制溫度為80℃，持續(xù)時間為8h。
所述氯化銅的用量為溶血液體積的3％，氯化鋅的用量為溶血液體積的2％。
所述超聲波的處理頻率為30khz。
所述溶劑為濃度80％的硫酸銨溶液。
實施例3
一種從牛血中提取sod的方法，包括以下步驟：
(1)預處理：取新鮮牛血，加入抗凝劑攪拌破碎，離心得紅細胞；
(2)清洗：采用0.4％的生理鹽水清洗紅細胞，洗滌3次；
(3)溶血：洗滌后加入溶膜劑，調節(jié)溫度并攪拌，再放入超聲波中處理25s，得溶血液；
(4)加熱：溶血液中添加氯化銅和氯化鋅，攪拌均勻，離心后得到粗提液；
(5)一次離心：將粗提液加入0.3倍體積的氯仿-乙醇混合攪拌，離心棄沉淀，得到粗酶液；
(6)二次離心：向粗酶液中加入0.7倍體積的溶劑，離心取上清液；
(7)將上述上清液進行離心，得到沉淀加入緩沖液溶解，脫鹽后冷凍干燥，即可得到高純度的sod。
所述抗凝劑為檸檬酸、肝素、edta、枸櫞酸鹽、草酸鉀中任一種。
所述溶膜劑的加入量為溶血液體積的18％。
所述溶膜劑按體積計算為15％的甲苯、8％的四氯化碳、余量為蛋清的混合液，
所述步驟(3)中調節(jié)溫度分為兩個階段，第一階段控制溫度為-5℃，持續(xù)時間為9h，第二階段控制溫度為75℃，持續(xù)時間為7h。
所述氯化銅的用量為溶血液體積的3％，氯化鋅的用量為溶血液體積的2％。
所述超聲波的處理頻率為30khz。
所述溶劑為濃度75％的硫酸銨溶液。
試驗例4
一種從牛血中提取sod的方法，包括以下步驟：
(1)預處理：取新鮮牛血，加入抗凝劑攪拌破碎，離心得紅細胞；
(2)清洗：采用0.3％的生理鹽水清洗紅細胞，洗滌2次；
(3)溶血：洗滌后加入溶膜劑，調節(jié)溫度并攪拌，再放入超聲波中處理24s，得溶血液；
(4)加熱：溶血液中添加氯化銅和氯化鋅，攪拌均勻，離心后得到粗提液；
(5)一次離心：將粗提液加入0.4倍體積的氯仿-乙醇混合攪拌，離心棄沉淀，得到粗酶液；
(6)二次離心：向粗酶液中加入0.8倍體積的溶劑，離心取上清液；
(7)將上述上清液進行離心，得到沉淀加入緩沖液溶解，脫鹽后冷凍干燥，即可得到高純度的sod。
所述抗凝劑為檸檬酸、肝素、edta、枸櫞酸鹽、草酸鉀中任一種。
所述溶膜劑的加入量為溶血液體積的16％。
所述溶膜劑按體積計算為12％的甲苯、8％的四氯化碳、余量為蛋清的混合液，
所述步驟(3)中調節(jié)溫度分為兩個階段，第一階段控制溫度為-8℃，持續(xù)時間為9h，第二階段控制溫度為72℃，持續(xù)時間為6h。
所述氯化銅的用量為溶血液體積的2.5％，氯化鋅的用量為溶血液體積的1.5％。
所述超聲波的處理頻率為28khz。
所述溶劑為濃度76％的硫酸銨溶液。
實施例5
一種從牛血中提取sod的方法，包括以下步驟：
(1)預處理：取新鮮牛血，加入抗凝劑攪拌破碎，離心得紅細胞；
(2)清洗：采用0.2％的生理鹽水清洗紅細胞，洗滌3次；
(3)溶血：洗滌后加入溶膜劑，調節(jié)溫度并攪拌，再放入超聲波中處理27s，得溶血液；
(4)加熱：溶血液中添加氯化銅和氯化鋅，攪拌均勻，離心后得到粗提液；
(5)一次離心：將粗提液加入0.3倍體積的氯仿-乙醇混合攪拌，離心棄沉淀，得到粗酶液；
(6)二次離心：向粗酶液中加入0.6倍體積的溶劑，離心取上清液；
(7)將上述上清液進行離心，得到沉淀加入緩沖液溶解，脫鹽后冷凍干燥，即可得到高純度的sod。
所述抗凝劑為檸檬酸、肝素、edta、枸櫞酸鹽、草酸鉀中任一種。
所述溶膜劑的加入量為溶血液體積的17％。
所述溶膜劑按體積計算為13％的甲苯、6％的四氯化碳、余量為蛋清的混合液，
所述步驟(3)中調節(jié)溫度分為兩個階段，第一階段控制溫度為-3℃，持續(xù)時間為8h，第二階段控制溫度為76℃，持續(xù)時間為6h。
所述氯化銅的用量為溶血液體積的3％，氯化鋅的用量為溶血液體積的1％。
所述超聲波的處理頻率為22khz。
所述溶劑為濃度80％的硫酸銨溶液。
根據(jù)實施例1～實施例5的方案，分別對牛血進行sod的提取，對照組采用專利cn201010241815.0的提取方案，結果如下表：
由試驗結果可知，采用本發(fā)明方案提取的sod活性和產率均顯著高于對照組，其中以實施例3方案的提取方案為最優(yōu)選，其sod活性達到6852u/mg，sod產率達到0.252％。
試驗例1
本發(fā)明為探究氯化銅和氯化鋅對提取效果的影響，分別制定三組試驗，第一組只采用氯化銅，第二組只采用氯化鋅，第三組采用氯化銅和氯化鋅，提取方法參照實施例1；試驗結果如下：
由試驗結果可知，采用氯化銅和氯化鋅進行提取，其提取效果顯著優(yōu)于單獨添加氯化銅或氯化鋅。
在此有必要指出的是，以上實施例和試驗例僅限于對本發(fā)明的技術方案做進一步的闡述和理解，不能理解為對本發(fā)明的技術方案做進一步的限定，本領域技術人員作出的非突出實質性特征和顯著進步的發(fā)明創(chuàng)造，仍然屬于本發(fā)明的保護范疇。