本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能有效從人新鮮肺癌標(biāo)本組織培養(yǎng)原代肺癌細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

最新研究報(bào)告顯示，惡性腫瘤已成為僅次于心血管疾病的全世界第二大死因，是全球公共健康問題。而肺癌的發(fā)病率及死亡率占所有惡性腫瘤之首。盡管近年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究者利用各種肺癌細(xì)胞系在肺癌的發(fā)病機(jī)制及治療等方面取得了突破性進(jìn)展，但由于遺傳背景的差異，不同患者發(fā)病的分子機(jī)制及治療均存在個(gè)體化的特點(diǎn)。因此，僅利用公用細(xì)胞系對(duì)肺癌進(jìn)行分子機(jī)制及治療研究，存在很大缺陷。

通過腫瘤患者自體的腫瘤組織培養(yǎng)的原代腫瘤胞能表現(xiàn)出腫瘤原來的特性，是腫瘤在體外研究的重要手段。肺癌細(xì)胞原代培養(yǎng)是指從肺癌患者體內(nèi)取出的腫瘤組織或細(xì)胞的首次培養(yǎng)，由于原代培養(yǎng)離體時(shí)間短，遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似，適于做細(xì)胞形態(tài)、功能、分化及藥物治療等研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可以有效地從人新鮮肺癌組織標(biāo)本分離腫瘤細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)至原代腫瘤細(xì)胞系的方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種有效地從新鮮肺癌組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

(1)收集肺癌患者手術(shù)切除半小時(shí)內(nèi)的新鮮組織標(biāo)本，并進(jìn)行無菌、切割處理；

(2)將經(jīng)過無菌、切割處理后的肺癌組織塊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

(3)對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行篩選、篩選后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的過程中一直進(jìn)行篩選處理，一直培養(yǎng)至≥50代。

(4)對(duì)50代以上的細(xì)胞進(jìn)行he染色、mts增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，如呈現(xiàn)惡性增殖現(xiàn)象，則證明建系成功。

進(jìn)一步的，所述的步驟(1)中無菌處理包含如下步驟：

收取肺癌患者手術(shù)切除半小時(shí)內(nèi)的新鮮組織標(biāo)本，置于含雙抗(100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)、10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的50ml離心管中，離心管置于冰上，無菌條件下轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)間；

在生物安全柜中將肺癌組織取出，置于6cm培養(yǎng)皿中，用含2x雙抗的pbs反復(fù)沖洗、浸泡肺癌組織10分鐘；

將浸泡后的肺癌組織轉(zhuǎn)移至一新的6cm培養(yǎng)皿中，加入約1ml含10％fbs的dmem/f12將肺癌組織濕潤(rùn)。

進(jìn)一步的，所述的步驟(1)中切割處理為：用無菌手術(shù)刀片、眼科剪將無菌處理后的肺癌組織切割成直徑小于1mm的小碎塊，并用剪掉尖部的1ml槍頭反復(fù)吹打肺癌組織塊。

進(jìn)一步的，所述的步驟(2)中的細(xì)胞培養(yǎng)過程如下：

收集經(jīng)過步驟(1)處理的肺癌組織塊及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至一新的6cm培養(yǎng)皿或t25培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中僅加入1ml完全培養(yǎng)1基濕潤(rùn)腫瘤組織，置于37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

每隔2-3天觀察細(xì)胞貼壁情況，并適量補(bǔ)充完全培養(yǎng)基，直至有大量細(xì)胞貼壁并形成小克隆團(tuán)后，更換完全培養(yǎng)基2；

培養(yǎng)至含有大量貼壁細(xì)胞時(shí)，1ml槍頭輕輕吹打，將組織塊吹打脫離培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基底部后丟棄，并加入完全培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)；

進(jìn)一步的，所述的步驟(3)中篩選的方法為在相差顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)，挑選出腫瘤細(xì)胞，其中細(xì)胞形態(tài)為大小不等、細(xì)胞核大且多核、堆疊生長(zhǎng)，則為腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)梭型、細(xì)胞核小則為成纖維細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)為規(guī)則圓形，細(xì)胞核小且排列整齊生長(zhǎng)，則為內(nèi)皮細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述的步驟(3)中細(xì)胞傳代培養(yǎng)及篩選細(xì)胞的方法如下：將挑選出的腫瘤細(xì)胞放入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中加入5ml完全培養(yǎng)基2，繼續(xù)培養(yǎng)至大量細(xì)胞克隆團(tuán)，如成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞較少，則不需特殊處理；如含大量成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，則需在顯微鏡下降肺癌細(xì)胞團(tuán)挑選出后進(jìn)行消化。

消化時(shí)，先用復(fù)溫至常溫的pbs沖洗2遍，后加入稀釋2倍的含edta的0.25％的胰酶1ml，顯微鏡先觀察待細(xì)胞變圓、變亮后加入完全培養(yǎng)基2終止消化，反復(fù)吹打至貼壁細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿底壁，收集細(xì)胞至15ml離心管中，1200rpm離心5mins，棄上清，用完全培養(yǎng)基2重懸細(xì)胞，置于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿至85％瓶壁時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)和篩選細(xì)胞。

進(jìn)一步的，如果經(jīng)過多次傳代后仍含有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，則運(yùn)用有限稀釋法稀釋細(xì)胞后種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，盡量保證每個(gè)孔中僅含有1個(gè)細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基2進(jìn)行培養(yǎng)5-7天，顯微鏡下觀察，選取單克隆團(tuán)消化后，種于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞細(xì)胞鋪滿至85％瓶壁時(shí)反復(fù)傳代于12孔板、6孔板、培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，使用的完全培養(yǎng)基1為：dmem/f12+15％fbs+20ng/mlegfr，使用的完全培養(yǎng)基2為含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)至超過50代而沒有衰老跡象，收集細(xì)胞進(jìn)行he染色、mts增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，如呈現(xiàn)惡性增殖現(xiàn)象，則證明建系成功。

附圖說明

圖1顯微鏡明場(chǎng)及he染色觀察培養(yǎng)原代肺癌細(xì)胞的形態(tài)，確定為惡性腫瘤細(xì)胞；

圖2mts實(shí)驗(yàn)測(cè)原代肺癌細(xì)胞系增殖曲線；

圖3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原代肺癌細(xì)胞系的克隆形成能力；

圖4裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)測(cè)原代肺癌細(xì)胞系在體內(nèi)成瘤情況；

具體實(shí)施方式1

患者晏xx，男，47歲，于2014年12月10行“右肺上葉腫塊切除術(shù)”，術(shù)后病理診斷為：肺腺癌。術(shù)后半小時(shí)將新鮮組織標(biāo)本置于含雙抗(100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)、10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的50ml離心管中，離心管置于冰上，無菌條件下轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)間；在生物安全柜中將肺癌組織取出，置于6cm培養(yǎng)皿中，用含2x雙抗的pbs沖洗肺癌組織10分鐘；將浸泡后的肺癌組織轉(zhuǎn)移至一新的6cm培養(yǎng)皿中，加入約1ml含10％fbs的dmem/f12將肺癌組織濕潤(rùn)；用無菌手術(shù)刀片將肺癌組織切割成直徑小于1mm的小碎塊，并用剪掉尖部的1ml槍頭反復(fù)吹打肺癌組織塊；收集肺癌組織塊及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至一新的6cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中加入1ml完全培養(yǎng)基1濕潤(rùn)腫瘤組織(完全培養(yǎng)基為：dmem/f12+15％fbs+20ng/mlegfr)，置于37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天觀察細(xì)胞貼壁情況，并適量補(bǔ)充完全培養(yǎng)基；第5天見有大量細(xì)胞貼壁并形成小克隆團(tuán)，更換完全培養(yǎng)基2(完全培養(yǎng)基2為含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基)；第10天,含有大量貼壁細(xì)胞，1ml槍頭輕輕吹打，將組織塊吹打脫離培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基底部后丟棄，并加入完全培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)；

第12天，相差顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)，見大部分細(xì)胞為大小不等、細(xì)胞核大且多核、堆疊生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，少量成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞；每個(gè)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中加入5ml完全培養(yǎng)基2，繼續(xù)培養(yǎng)至大量細(xì)胞克隆團(tuán)，少量成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞；第15天，細(xì)胞融合至90％左右時(shí)，先用復(fù)溫至常溫的pbs沖洗2遍，后加入稀釋2倍的含edta的0.25％的胰酶1ml，顯微鏡先觀察待細(xì)胞變圓、變亮后加入完全培養(yǎng)基2終止消化，反復(fù)吹打至貼壁細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿底壁，收集細(xì)胞至15ml離心管中，1200rpm離心5mins，棄上清，用完全培養(yǎng)基2重懸細(xì)胞，置于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；第18天，細(xì)胞鋪滿至85％瓶壁時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，運(yùn)用有限稀釋法稀釋細(xì)胞后種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，盡量保證每個(gè)孔中僅含有1個(gè)細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基2進(jìn)行培養(yǎng)5-7天，顯微鏡下觀察，選取單克隆團(tuán)消化后，種于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿至85％瓶壁時(shí)反復(fù)傳代于12孔板、6孔板、培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)；以后每2-3天消化傳代1次，細(xì)胞傳代培養(yǎng)至超過50代而沒有衰老跡象，收集細(xì)胞進(jìn)行he染色、mts增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。he染色(圖1)見細(xì)胞大小異型性明顯，核漿比例倒置，核仁清晰、多個(gè)，病理診斷為肺癌細(xì)胞；mts實(shí)驗(yàn)(圖2)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖3)示200個(gè)以上細(xì)胞培養(yǎng)2周即可在六孔板中形成較多克隆，說明細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)(圖4)表明細(xì)胞可在裸鼠體內(nèi)惡性增殖、生長(zhǎng)成瘤。

具體實(shí)施方式2

患者凡xx，女，53歲，于2015年06月18行“右肺上葉腫塊切除術(shù)”，術(shù)后病理診斷為：肺腺癌(低分化)。術(shù)后半小時(shí)將新鮮組織標(biāo)本，置于含雙抗(100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)、10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的50ml離心管中，離心管置于冰上，無菌條件下轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)間；在生物安全柜中將肺癌組織取出，置于6cm培養(yǎng)皿中，用含2x雙抗的pbs反復(fù)沖洗、浸泡肺癌組織10分鐘；將浸泡后的肺癌組織轉(zhuǎn)移至一新的6cm培養(yǎng)皿中，加入約1ml含10％fbs的dmem/f12將肺癌組織濕潤(rùn)；用無菌手術(shù)刀片、眼科剪將肺癌組織切割成直徑小于1mm的小碎塊，并用剪掉尖部的1ml槍頭反復(fù)吹打肺癌組織塊；收集肺癌組織塊及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至一新的6cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中僅加入1ml完全培養(yǎng)1基濕潤(rùn)腫瘤組織(完全培養(yǎng)基為：dmem/f12+15％fbs+20ng/mlegfr)，置于37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第3天觀察細(xì)胞貼壁情況，有少量細(xì)胞貼壁并形成小克隆團(tuán)后，并適量補(bǔ)充完全培養(yǎng)基1；第5天，貼壁細(xì)胞增多，克隆團(tuán)增大；第7天，見大量克隆團(tuán)形成，更換完全培養(yǎng)基2(完全培養(yǎng)基2為含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基)；第9天，1ml槍頭輕輕吹打，將組織塊吹打脫離培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基底部后丟棄，并加入完全培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)；

第11天，相差顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)，見部分克隆團(tuán)為大小不等、細(xì)胞核大且多核、堆疊生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，部分細(xì)胞為細(xì)長(zhǎng)梭型的成纖維細(xì)胞；顯微鏡下挑選腫瘤細(xì)胞團(tuán)，先用復(fù)溫至常溫的pbs沖洗2遍，后加入稀釋2倍的含edta的0.25％的胰酶1ml，顯微鏡先觀察待細(xì)胞變圓、變亮后加入完全培養(yǎng)基2終止消化，反復(fù)吹打至貼壁細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿底壁，收集細(xì)胞至15ml離心管中，1200rpm離心5mins，棄上清，用完全培養(yǎng)基2重懸細(xì)胞，運(yùn)用有限稀釋法稀釋細(xì)胞后種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，盡量保證每個(gè)孔中僅含有1個(gè)細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基2進(jìn)行培養(yǎng)天，顯微鏡下觀察，選取單克隆團(tuán)消化后，種于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿至85％瓶壁時(shí)反復(fù)傳代于12孔板、6孔板、培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)；每2-3天觀察并胰酶消化傳代細(xì)胞，細(xì)胞傳代培養(yǎng)至超過50代而沒有衰老跡象，收集細(xì)胞進(jìn)行he染色、mts增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。he染色見細(xì)胞大小異型性明顯，核漿比例倒置，核仁清晰、多個(gè)，病理診斷為肺癌細(xì)胞；mts實(shí)驗(yàn)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；克隆形成實(shí)驗(yàn)示細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞可在裸鼠體內(nèi)惡性增殖、生長(zhǎng)成瘤。

以上所述實(shí)施例，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。