本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法。具體而言，本發(fā)明涉及在化學(xué)誘導(dǎo)中期加入化學(xué)物質(zhì)巴豆酸，通過(guò)激活包括zscan4在內(nèi)的一系列二細(xì)胞期基因的表達(dá)，迅速延長(zhǎng)端粒，從而減少端粒區(qū)域的基因組損傷，提高最終的化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，小鼠和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(下文稱(chēng)為ips)已相繼建立，這類(lèi)細(xì)胞的建立需要依靠強(qiáng)制表達(dá)一系列外源轉(zhuǎn)錄因子組合，如oct4，sox2，klf4等。但是介導(dǎo)外源基因表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒有潛在的安全問(wèn)題，不管是逆轉(zhuǎn)錄病毒,還是慢病毒,都會(huì)把外源基因整合到基因組dna中,這就有可能引起插入突變，造成潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，不利于ips的臨床應(yīng)用。因此，降低基因整合風(fēng)險(xiǎn)和致癌性的方法之一就是減少外源轉(zhuǎn)錄因子，而這同時(shí)伴隨著誘導(dǎo)效率的降低。加入一些化學(xué)小分子，如vpa,bix,vc等，可以顯著提高重編程的效率，但是潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)依然使得ips距離臨床應(yīng)用非常遙遠(yuǎn)。

通過(guò)不斷的努力和嘗試，鄧宏魁課題組首次利用小分子化合物將小鼠成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)為化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(下文稱(chēng)為cips)，這就避免了外源基因整合進(jìn)基因組的風(fēng)險(xiǎn)。但是過(guò)低的誘導(dǎo)效率和過(guò)長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間仍然大大地限制了cips的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是解決因外源基因整合到基因組dna中可能造成潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)以及減少外源轉(zhuǎn)錄因子而伴隨著誘導(dǎo)效率降低的問(wèn)題，提供一種利用巴豆酸激活zscan4等二細(xì)胞期基因表達(dá)，延長(zhǎng)端粒，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法。

本發(fā)明試圖通過(guò)篩選其他化學(xué)小分子以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程的效率，并提高cips的質(zhì)量。具體而言，利用一種小分子化合物巴豆酸，在化學(xué)誘導(dǎo)過(guò)程中第二階段加入后，可以顯著提高最終的化學(xué)誘導(dǎo)效率，并且這種方法得到的cips具備與正常胚胎干細(xì)胞更接近的基因表達(dá)譜，其安全性與有效性可轉(zhuǎn)化于未來(lái)臨床應(yīng)用。

通過(guò)不斷的嘗試，我們發(fā)現(xiàn)7mm的巴豆酸(crotonicacid，以下簡(jiǎn)稱(chēng)ca)在化學(xué)誘導(dǎo)中期加入，可以使化學(xué)誘導(dǎo)效率提高3倍左右。

本發(fā)明技術(shù)方案

利用巴豆酸激活zscan4等二細(xì)胞期基因表達(dá)并延長(zhǎng)端粒，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法，包括如下步驟：

第1.mef細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)；

通過(guò)貼壁培養(yǎng)，從處死的孕鼠組織獲得原代mef細(xì)胞；

第2.加入巴豆酸獲得化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；

將第1步中獲得的原代mef細(xì)胞，培養(yǎng)至多3代作為前體細(xì)胞用于化學(xué)誘導(dǎo)重編程，以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率。

其中，第2步所述加入巴豆酸獲得化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法如下：

首先在六孔板中接種50000個(gè)原代mef細(xì)胞，轉(zhuǎn)天待細(xì)胞貼壁后換上化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)液a，記為第0天，0-12天每隔3天換液；在第12天時(shí)，細(xì)胞用胰酶消化后，以每個(gè)六孔100000-200000個(gè)細(xì)胞重新接種，培養(yǎng)至第16天，此時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)液改為誘導(dǎo)培養(yǎng)液aa；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液a包括以下成分：100ng/mlbfgf,0.5mmvpa,20μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,50μmforskolin,0.05μmam580和5μmepz004777；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液aa是將誘導(dǎo)培養(yǎng)液a中的bfgf、chir99021和forskolin分別減量至25ng/ml、10μm和10μm，其他成分不變。

在第16天時(shí)，細(xì)胞換上另外誘導(dǎo)培養(yǎng)液b，培養(yǎng)至第28天，每隔3天換液；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液b的成分如下：25ng/mlbfgf,0.5mmvpa,10μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,10μmforskolin,0.05μmam580,0.05μmdznep,0.5μm5-aza-dc，5μmsgc0946和7mm巴豆酸；

在第28天時(shí)，細(xì)胞換上n2b27+2ilif培養(yǎng)液，再經(jīng)過(guò)8-12天的培養(yǎng)，原代cips克隆出現(xiàn)，挑出后進(jìn)行增擴(kuò)和進(jìn)一步鑒定。所述n2b27+2ilif培養(yǎng)液成分為：f12和neurobasal的1：1混合液，并添加n2,b27,3μmchir99021,1μmpd0325901和1000u/mlmlif。

所述原代cips進(jìn)行增擴(kuò)時(shí)使用的cips傳代培養(yǎng)液為knock-outdmem添加20％血清,1000u/mlmlif，3μmchir99021和1μmpd0325901。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明方法是一種非侵入式的簡(jiǎn)單低成本的方法，得到的cips具備多能性和產(chǎn)生高嵌合體小鼠的發(fā)育潛能。因此，本方法高效誘導(dǎo)的cips具備了大量應(yīng)用于臨床的潛力。

本發(fā)明中巴豆酸不僅使化學(xué)誘導(dǎo)效率得到了提高，我們還進(jìn)一步對(duì)ca作用于提高重編程效率的機(jī)制做出了闡明。我們的結(jié)果表明，ca的加入在重編程中期可以激活包括zscan4在內(nèi)的一系列二細(xì)胞期基因，從而保護(hù)端粒區(qū)域的dna，使之損傷減少，同時(shí)可以部分挽救端?？s短，維持基因組的穩(wěn)定性。而且由ca誘導(dǎo)得到的cips基因表達(dá)譜上與胚胎干細(xì)胞更為接近，因此具備更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖注說(shuō)明：

圖1為巴豆酸(crotonicacid)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2為誘導(dǎo)過(guò)程中加入巴豆酸(crotonicacid，以下簡(jiǎn)稱(chēng)ca)在第40天時(shí)的克隆形態(tài)圖。可以看出40天時(shí)ca誘導(dǎo)而來(lái)的gfp熒光克隆數(shù)明顯多于對(duì)照組。

圖3為誘導(dǎo)過(guò)程中加入ca在第40天時(shí)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。結(jié)果證實(shí)加入ca對(duì)誘導(dǎo)效率有3倍左右的提高。

圖4為端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示加入ca后對(duì)端粒酶活性無(wú)明顯影響。

圖5為westernblot結(jié)果，證實(shí)在16天時(shí)加入ca后在28天時(shí)可以顯著提高二細(xì)胞期基因zscan4蛋白水平的表達(dá)，對(duì)于多能性基因無(wú)明顯效果。

圖6為免疫熒光和定量結(jié)果。結(jié)果顯示在加入ca后，28天時(shí)zscan4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。

圖7為根據(jù)rna-sequencing結(jié)果做出的熱圖。結(jié)果顯示在16天加入ca后在28天時(shí)可以顯著激活一系列二細(xì)胞期基因的表達(dá)。

圖8為southernblot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示過(guò)程中加入ca在第30天左右對(duì)端粒有明顯的延長(zhǎng)作用，并且在第40天左右與對(duì)照組存在顯著性差異。

圖9為加入ca后第28天時(shí)trf1和γh2ax免疫熒光和其共定位定量統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。結(jié)果顯示加入ca后在第28天時(shí)可以顯著降低在端粒區(qū)域的dna損傷。

圖10為ca誘導(dǎo)得到的cips免疫熒光檢測(cè)多能性maker的表達(dá)情況。結(jié)果顯示加入ca后得到的cips與對(duì)照組都具備很好的多能性，無(wú)明顯差別。

圖11為加入ca誘導(dǎo)得到的cipscs形成的嵌合體小鼠。證實(shí)了cips具備很好的體內(nèi)發(fā)育潛能。

圖12為根據(jù)rna-sequencing結(jié)果做出的熱圖。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，加入ca誘導(dǎo)得到的cipscs能更好地與胚胎干細(xì)胞聚類(lèi)，即二者擁有更相似的基因表達(dá)譜。

圖13為ca作用于化學(xué)誘導(dǎo)重編程的模式圖，常規(guī)的化學(xué)誘導(dǎo)重編程需要40天左右的誘導(dǎo)時(shí)間，而且在誘導(dǎo)的最后一個(gè)階段，即30天至40天時(shí)，伴隨著端?？s短和基因組損傷等過(guò)程。我們?cè)谡T導(dǎo)重編程第二階段，即16天至28天持續(xù)加入7mm的巴豆酸，可在28天左右激活包括zscan4在內(nèi)的一系列二細(xì)胞期基因，迅速延長(zhǎng)端粒，減少端粒區(qū)域的dna損傷，最終提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：檢測(cè)化學(xué)誘導(dǎo)過(guò)程中加入巴豆酸后誘導(dǎo)效率的提高(圖2，3)

利用巴豆酸激活二細(xì)胞期基因表達(dá)以提高化學(xué)誘導(dǎo)重編程效率的方法，包括如下步驟：

第1.mef細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

將13.5天的孕鼠處死，去除四肢、頭尾和內(nèi)臟，剪碎組織，0.05mm胰酶37℃消化10分鐘后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。貼壁獲得的梭形細(xì)胞為原代mef細(xì)胞。

第2.加入巴豆酸獲得化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

將第1步中獲得的原代mef細(xì)胞，培養(yǎng)至多3代可作為前體細(xì)胞用于化學(xué)誘導(dǎo)重編程。首先在六孔板中接種50000個(gè)原代mef細(xì)胞，轉(zhuǎn)天待細(xì)胞貼壁后換上化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)液a，記為第0天。0-12天每隔3天換液，誘導(dǎo)培養(yǎng)液a包括以下成分：100ng/mlbfgf,0.5mmvpa,20μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,50μmforskolin,0.05μmam580和5μmepz004777。在第12天時(shí)，細(xì)胞用胰酶消化后，以每個(gè)六孔100000-200000個(gè)細(xì)胞重新接種，培養(yǎng)至第16天，此時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)液改為誘導(dǎo)培養(yǎng)液aa。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液aa是將誘導(dǎo)培養(yǎng)液a中bfgf,chir99021和forskolin分別減量至25ng/ml,10μm和10μm，其他成分不變。

在第16天時(shí)，細(xì)胞換上另外誘導(dǎo)培養(yǎng)液b，成分如下：25ng/mlbfgf,0.5mmvpa,10μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,10μmforskolin,0.05μmam580,0.05μmdznep,0.5μm5-aza-dc，5μmsgc0946和7mm巴豆酸，每隔3天換液。在第28天時(shí)，細(xì)胞換上n2b27+2ilif培養(yǎng)液，培養(yǎng)液成分為f12和neurobasal1：1混合液，并添加n2,b27,3μmchir99021,1μmpd0325901和1000u/mlmlif。再經(jīng)過(guò)8-12天的培養(yǎng)，原代cips克隆出現(xiàn)，挑出后可進(jìn)行增擴(kuò)和進(jìn)一步鑒定。cips傳代培養(yǎng)液為knock-outdmem添加20％血清,1000u/mlmlif，3μmchir99021和1μmpd0325901。

通過(guò)顯微鏡觀察第40天時(shí)gfp陽(yáng)性克隆數(shù)(以未加入巴豆酸作為對(duì)照組)和流式細(xì)胞儀分析gfp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(圖2，3)結(jié)果顯示，加入巴豆酸后能提高3倍左右的誘導(dǎo)效率。

實(shí)施例2：檢測(cè)加入巴豆酸后對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)重編程的影響和作用機(jī)制(圖4，5，6，7，8，9)

1.通過(guò)trap(端粒酶活性檢測(cè))實(shí)驗(yàn)證實(shí)巴豆酸的加入對(duì)端粒酶活性沒(méi)有明顯影響。

2.通過(guò)westernblot實(shí)驗(yàn)證明，在加入巴豆酸后第28天時(shí)zscan4蛋白明顯上調(diào)，而對(duì)于其他多能性蛋白o(hù)ct4，nanog和lin28無(wú)明顯效果。

3.免疫熒光染色結(jié)果顯示，加入巴豆酸后第28天時(shí)zscan4陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，統(tǒng)計(jì)后結(jié)果存在顯著性差異。

4.rna-seq測(cè)序結(jié)果同樣證實(shí)了包括zscan4在內(nèi)的一系列二細(xì)胞期基因在巴豆酸加入后明顯被激活，與westernblot和免疫熒光結(jié)果相一致。

5.souternblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化學(xué)誘導(dǎo)過(guò)程中加入ca在第30天左右對(duì)端粒有明顯的延長(zhǎng)作用，并且在第40天左右端粒長(zhǎng)度與對(duì)照組存在顯著性差異。

6.免疫熒光通過(guò)共染trf1蛋白和γh2ax蛋白證實(shí)在加入巴豆酸后，總體上γh2ax蛋白指示的整體基因組損傷沒(méi)有明顯變化，但是與trf1共定位在第28天時(shí)有明顯減少，這進(jìn)一步證明了巴豆酸可以在28天左右減少端粒區(qū)域的基因組損傷。

實(shí)施例3：對(duì)加入巴豆酸誘導(dǎo)得到的cips進(jìn)行鑒定(圖10，11，12)

我們通過(guò)對(duì)加入巴豆酸誘導(dǎo)得到的cips進(jìn)行免疫熒光染色多能性markernanog，sox2和ssea1，顯示這種方法得到的cips具有很好的多能性。通過(guò)4-8細(xì)胞注射進(jìn)行的嵌合體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，這種方法得到的cips具備了形成高嵌合體的體內(nèi)發(fā)育潛能，這對(duì)于未來(lái)的再生醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用具有重要意義。而與未加入巴豆酸的cips相比較，巴豆酸誘導(dǎo)得到的cips與正常的胚胎干細(xì)胞系og4享有更接近的基因表達(dá)譜。