本發(fā)明涉及一種表達豬表皮生長因子基因的重組乳酸乳球菌及構建方法。

背景技術：

表皮生長因子(egf)是一類重要的生長因子，是類egf大家族的一個成員。它是由50-60個氨基酸分子組成的肽鏈，鏈中含有6個半胱氨酸分子，半胱氨分子間形成穩(wěn)定的雙硫鍵。使整條肽鏈成為三個環(huán)聯(lián)部分的活性物質。它是一種廣泛存在于人或其它動物體內的小分子多肽，極微量即能強烈刺激細胞生長、抑制衰老基因的出現(xiàn)，延緩表皮細胞衰老。他通過與其受體相結合發(fā)揮作用。

表皮生長因子通過與細胞表面的受體表皮生長因子受體(egfr)結合而起作用。與表皮生長因子受體的高親和力結合，激發(fā)受體內在的酪氨酸激酶的活性，從而啟動了信號傳導級聯(lián)而導致多種生物化學變化，細胞內鈣水平上升，增加糖酵解與蛋白質合成,增加某些基因(包括表皮生長因子受體)的表達，最終導致dna合成和細胞增殖。

豬egf蛋白含53個氨基酸殘基，相對分子質量6.2kd，主要由唾液腺、乳汁、paneth細胞、十二指腸的brunners腺和胰腺等分泌至胃腸道，在消化道中發(fā)揮作用，egf對酸和熱非常穩(wěn)定，對抵抗多種消化酶的消化作用，因此這對其維持結構的穩(wěn)定和發(fā)揮生物學作用具有重要的意義。

乳酸乳球菌是人體和畜禽體內的益生菌，能夠定殖于腸道，可以很好的維持微生態(tài)平衡，分泌多種促生長酶類，促進消化，能夠分泌維生素及抗菌肽，對腸道健康與有害微生物的抑制具有重要作用。同時乳酸乳酸菌已在各個領域廣泛應用，已證實其為安全級微生物，無致病性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明其目的就在于提供一種表達豬表皮生長因子基因的重組乳酸乳球菌及構建方法，對表達的重組豬表皮生長因子進行了純化，并對重組蛋白進行了tricine-sds-page鑒定。

為實現(xiàn)上述目的而采取的技術方案是，

一種表達豬表皮生長因子基因的重組乳酸乳球菌，所述的重組乳酸乳球菌為pegf-pnz8148-nz9000。

一種表達豬表皮生長因子基因的重組乳酸乳球菌的構建方法，包括以下步驟：

（1）用限制性內切酶分別對pnz8148質粒和pegf基因進行雙酶切；

（2）使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別對酶切產物進行回收，再經t4dna連接酶對酶切產物進行連接反應后轉化至大腸桿菌mc1061感受態(tài)細胞中，使用氯霉素抗性進行篩選后，經酶切鑒定、pcr鑒定得出正確的重組質粒；

（3）提取重組質粒并電轉至乳酸乳球菌nz9000中，再經pcr鑒定正確，得到重組乳酸乳酸球菌株pegf-pnz8148-nz9000。

有益效果

與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點。

本發(fā)明對表達的重組豬表皮生長因子進行了純化，并對重組蛋白進行了tricine-sds-page鑒定。

附圖說明

以下結合附圖對本發(fā)明作進一步詳述。

圖1為篩選豬表皮生長因子基因與pnz8148質粒連接的陽性克隆子電泳圖（引物pegf-f和pegf-r，產物約189bp）；

圖2為乳酸乳球菌nz9000表達pegf蛋白的tricine-sds-page圖（蛋白大小在6.2kd左右）；

圖3為pnz8148質粒圖譜。

具體實施方式

一種表達豬表皮生長因子基因的重組乳酸乳球菌，所述的重組乳酸乳球菌為pegf-pnz8148-nz9000。

一種表達豬表皮生長因子基因的重組乳酸乳球菌的構建方法，如圖1-3所示，包括以下步驟：

（1）用限制性內切酶分別對pnz8148質粒和pegf基因進行雙酶切；

（2）使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別對酶切產物進行回收，再經t4dna連接酶對酶切產物進行連接反應后轉化至大腸桿菌mc1061感受態(tài)細胞中，使用氯霉素抗性進行篩選后，經酶切鑒定、pcr鑒定得出正確的重組質粒；

（3）提取重組質粒并電轉至乳酸乳球菌nz9000中，再經pcr鑒定正確，得到重組乳酸乳酸球菌株pegf-pnz8148-nz9000。

所述的對pnz8148質粒和pegf基因進行雙酶切的兩種限制性內切酶分別為ncoi、xbai。

所述氯霉素篩選所用的濃度分別為50ug/ml和25ug/ml。

實施例1

豬表皮生長因子基因合成

對豬表皮生長因子氨基酸序列（af336151）進行分析，去掉上游信號肽序列，得到53氨基酸的成熟肽序列：

nsysecppshdgyclhggvcmyieavdsyacncvfgyvgercqhrdlkwwelr

通過乳酸乳球菌的密碼子偏好性對該序列進行密碼子優(yōu)化，在序列上游添加6個組氨酸的核苷酸，便于重組蛋白的驗證及純化，并在其上下游分別設計ncoi和xbai兩個限制性內切酶位點及保護性堿基，對優(yōu)化好的序列進行人工合成：catgccatggcatcatcatcatcatcataatagctatagcgaatgtccaccatctcatgatggttattgtttacatggtggagtttgtatgtatattgaagcagttgattcatatgcttgtaattgtgtttttggatatgtgggagaaagatgtcaacatagagatttaaaatggtgggaattacgttctagagc

實施例2

構建重組質粒pegf-pnz8148

1、相關培養(yǎng)基的配制

lb固體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%nacl2,2%瓊脂lb液體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%nacl2

2、pegf基因和pnz8148質粒的雙酶切反應

用ncoi和xbai分別對pegf基因和pnz8148質粒雙酶切，

雙酶切反應體系如下：

體系體積（ul）

ncoi2

xbai2

pegf基因/pnz8148質粒20

bsa1

10×mbuffer5

ddh2o20

總體積50

于37℃溫箱反應3h后，加入10ul的6×loadingbuffer，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分別跑膠，使用凝膠回收試劑盒回收pegf基因和pnz8148質粒的雙酶切片段。

3、pegf基因和pnz8148質粒的連接反應

回收好的pegf基因和pnz8148質粒用t4dna連接酶連接。

t4dna連接酶連接體系：

體系體積（ul）

pegf基因8

pnz8148質粒9

t4dna連接酶1

10×buffer2

總體積20

將反應體系放入4℃冰箱靜置反應18h。

4、mc1061大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備

4.1從lb培養(yǎng)基平板上挑取大腸桿菌mc1061單菌落，接種于5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；

4.2取1ml過夜培養(yǎng)物加至50mllb液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)2-3h，至od600≈0.4；

4.3用預冷的50ml離心管于4℃離心，2500rpm離心10min，棄上清；

4.4用預冷的25ml0.1mcacl2重懸菌體，冰上靜置10min，于4℃離心，2500rpm離心10min，棄上清，回收菌體；

4.5用預冷的2.5ml0.1mcacl2重懸菌體，分裝每管100ul，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5、連接產物轉化mc1061大腸桿菌感受態(tài)細胞

5.1取出-80℃凍存的大腸桿菌mc1061感受態(tài)細胞（100ul裝），握于手心中20sec快速融化后置于冰上；

5.2吸取15ul連接產物輕輕加至大腸桿菌mc1061感受態(tài)細胞底部，冰浴30min；

5.342℃水浴熱擊90sec，迅速放置冰上1min；

5.4加入預冷的lb培養(yǎng)基900ul，置于37℃搖床培養(yǎng)120rpm緩慢復蘇40min；

5.5復蘇的轉化產物涂于含氯霉素50ug/ml的lb固體平板上，每個平板涂200ul,37℃倒置培養(yǎng)16-18h。

6、轉化子菌落pcr擴增鑒定

pegf-f：ccatggcatcatcatcatcatca

pegf-r：tctagaacgtaattcccaccattt

使用pegf-f和pegf-r引物對轉化子進行菌落pcr擴增鑒定，pcr體系如下：

體系體積（ul）

pegf-f1

pegf-r1

dntp1

10×buffer2

transt-taq酶0.5.

轉化子菌液2

ddh2o12.5

總體積20

pcr擴增反應程序：

預變性95℃5min

變性95℃30sec

退火55℃30sec

延伸72℃1min

總延伸72℃5min

變性，退火，延伸，30cycle

擴增完成后加入10ul6×loadingbuffer，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，疑似陽性轉化子有159bp的目的條帶；

將疑似陽性轉化子的pcr原液送北京奧科生物工程有限公司測序，測序結果與目的基因進行序列對比，匹配度100%。

實施案例3

構建重組菌株egf-pnz8148-nz9000

1、相關培養(yǎng)基及試劑的配制

m17肉湯，m17瓊脂，購于青島海博生物技術有限公司。

gm17：m17培養(yǎng)基加2%葡萄糖。

sgm17g：gm17培養(yǎng)基加17%蔗糖加1.8%甘氨酸。

復蘇培養(yǎng)基：gm17培養(yǎng)基加17%蔗，20mmmgcl2及2mmcacl2。

感受態(tài)洗滌液：17g蔗糖，10ml甘油，用ddh2o定容至100ml。

2、乳酸乳球菌nz9000感受態(tài)的制備

2.1在m17瓊脂平板上劃線復蘇乳酸乳球菌nz9000，30℃倒置培養(yǎng)48；

2.2培養(yǎng)種子液：挑取乳酸乳球菌nz9000單菌落接種于5mlgm17中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。

2.3100mlsgm17g中加入2ml過夜培養(yǎng)好的種子液，30℃靜置培養(yǎng)至od600=0.4-0.5，4℃2500rpm離心10min，棄上清培養(yǎng)基。

2.4加入預冷感受態(tài)洗滌液25ml，緩慢重懸菌體，冰浴15min后，4℃2500rpm離心10min，棄上清培養(yǎng)基。

2.5加預冷感受態(tài)洗滌液1ml，緩慢重懸菌體，分裝成90ul每管，立即電轉使用或放于-80℃保存。

3、重組質粒egf-pnz8148電轉乳酸乳球菌nz9000

將質粒小量提取試劑盒提取的egf-pnz8148重組質粒電轉化乳酸乳球菌nz9000,電轉化步驟如下：

3.1將90ul乳酸乳球菌nz9000感受態(tài)細胞中加入10ulegf-pnz8148重組質粒，冰浴30min；

3.2將冰浴完成后的重組質粒和感受態(tài)混合物緩慢加入2mm電轉杯底部，冰浴10min；

3.3設置參數(shù)電壓2500v、電容50uf、電阻200ω，電轉完成后迅速加入900ul預冷的修復培養(yǎng)基，輕輕混勻后轉移至1.5mlep管中，30℃搖床80rpm緩慢復蘇2h；

3.4復蘇好的轉化產物涂于含氯霉素25ug/ml的gm17培養(yǎng)基平板上，每個平板涂200ul,30℃倒置培養(yǎng)48-72h。

4、轉化子pcr擴增鑒定

對電轉化長出的單克隆進行擴大培養(yǎng)，生長良好的菌液離心收集菌體，加適量溶菌酶裂解細胞壁并提取質粒，以質粒為模板，進行pcr擴增鑒定，pcr體系和擴增條件與鑒定mc1061重組菌相同。

實施例4

重組乳酸乳酸球egf-pnz8148-nz9000的表達

平板上挑取重組乳酸乳球菌egf-pnz8148-nz9000單菌落接種于含氯霉素25ug/ml的5mlgm17液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物分別吸取2ml各加入含氯霉素25ug/ml的50mlgm17液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到od600=0.4，向其中一瓶加5ul誘導劑nisin母液，繼續(xù)靜置誘導培養(yǎng)24h，常溫2500rpm離心10min，收集培養(yǎng)基80ul，加5×sds-pageloadingbuffer20ul，沸水浴15min。

實施例5

重組pegf的純化

1、飽和硫酸銨沉淀培養(yǎng)基上清中的pegf

培養(yǎng)完成的菌液最大轉速離心30min，棄菌體沉淀，將等體積的飽和硫酸銨溶液（4.1mol/l，25℃）邊攪拌邊慢慢加入，加完放磁力攪拌器上4℃攪拌過夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm4℃離心30min，棄上清保留沉淀，將沉淀溶于少量（10-20ml）pbs-0.2g/l疊氮鈉中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小時更換透析緩沖液，以徹底去除硫酸銨。

2、重組pegf蛋白鎳柱純化

相關試劑如下：

母液1：29.22g氯化鈉，2.42gtris-base，ddh2o定溶至1l，調節(jié)ph=8.0。

母液2：6.06gtris-base，ddh2o定溶至1l，調節(jié)ph=8.0。

bindingbuffer：0.1702g咪唑，溶于500ml母液1。

elutionbuffer：17.02g咪唑，溶于500ml母液1。

washingbuffer:2.3828g咪唑，溶于500ml母液2。

先用bindingbuffer平衡鎳離子親和層析柱，然后將待純化的樣品上樣于鎳柱，結合30min左右，收集留出液flowthrough，用washingbuffer洗3個柱體積，收集washthrongh，最后用elutionbuffer洗脫蛋白，收集eluent.將bindingbuffer，washthrongh，eluent。

將鎳柱收集的蛋白用milipore壓力超濾濃縮裝置通過30kda超濾膜截留濃縮至10ml左右，將樣品通過gelfiltrationbuffer平衡過的superdex200分子篩進行分離。

實施例6

重組pegf的tricine-sds-page

1、相關試劑的配制

1.1ab-3濃縮膠：9.6g丙烯酰胺，0.3g甲叉雙丙烯酰胺，溶于20ml水；ab-6分離膠：9.3g丙烯酰胺，0.6g甲叉雙丙烯酰胺，溶于20ml水；凝膠緩沖液：2.422gtris，0.02gsds，溶于20ml水，ph=8.45

1.215%分離膠（separatinggel）

成分體積（ml）

ddh2o7.5

ab-65

凝膠緩沖液1

甘油1.5

10%過硫酸銨0.05

temed0.005

總體積15

1.310%濃縮膠（spacergel）

成分體積（ml）

ddh2o1.1

ab-30.6

凝膠緩沖液1

甘油0.3

10%過硫酸銨0.015

temed0.0015

總體積3

1.44%濃縮膠（stackinggel）

成分體積（ml）

ddh2o4

ab-30.5

凝膠緩沖液1.5

10%過硫酸銨0.045

temed0.0045

總體積6

1.5考馬斯亮藍染色液：稱取1.0g考馬斯亮藍r-250，加入50ml冰醋酸、25ml無水乙醇和425mlddh2o，攪拌溶解后過濾；

1.6考馬斯亮藍脫色液：50ml冰醋酸、25ml無水乙醇，用ddh2o定容至500ml；

2、純化pegf的tricine-sds-page

將純化的pegf中添加sds-pageloadingbuffer，沸水浴15min，以蛋白質標準分子量為參考，在tricine-sds-page蛋白膠上電泳，由15%separatinggel，10%spacergel，4%stackinggel灌制三層的tricine-sds-page蛋白膠，插入1mm膠梳，室溫下凝固。制備完成后拔下膠梳，立即將膠板固定于電泳裝置上，電泳槽內加入電泳緩沖液，排盡凝膠底部玻璃板間的氣泡，每孔加樣20μl,接通電源，進入分離膠之前30v,之后100v,在跑至分離膠底部之前調至200v，電泳完成后取下凝膠，考馬斯亮藍染色液中染色過夜，過夜染色完成后，使用考馬斯亮藍脫色液進行脫色，每30分鐘換脫色液，直到看到清晰的條帶為止，結果如圖2所示。