本發(fā)明是關(guān)于一種強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌及其生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1,3-丙二醇用途廣泛，是非常重要的化工產(chǎn)品及平臺(tái)化合物，可用作粘合劑、保護(hù)劑、潤滑劑、抗凍劑及溶劑，在高分子材料、醫(yī)藥、化工、食品及化妝品領(lǐng)域都具有廣泛應(yīng)用。其最重要的用途為生產(chǎn)聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(ptt)。ptt的良好特性，包括水洗性、延展性及回復(fù)性都使得其市場需求日益擴(kuò)大。由此拉動(dòng)了1,3-丙二醇的市場需求(liuh.etal.,biotechnolj.2010,5(11):1137–1148)。
鑒于1,3-丙二醇的重要作用，化學(xué)法合成的種種弊端，利用微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究備受關(guān)注。目前報(bào)道的合成1,3-丙二醇的菌株主要有克雷伯氏菌屬(klebsiella)、梭菌屬、腸桿菌屬以及乳酸菌屬。其中，克雷伯氏菌屬的菌株屬于兼性厭氧菌，在工業(yè)應(yīng)用中容易培養(yǎng)，且該類菌株具有良好的底物甘油耐受性及產(chǎn)物1,3-丙二醇耐受性，1,3-丙二醇的生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率較高。因此，克雷伯氏菌屬是研究較多的優(yōu)良的1,3-丙二醇生產(chǎn)菌株(celińskae.critrevbiotechnol.2012,32(3):274–288)。為進(jìn)一步提高1,3-丙二醇生產(chǎn)水平，降低1,3-丙二醇生產(chǎn)成本，需要對(duì)克雷伯氏菌進(jìn)行改造和優(yōu)化，以提高菌株生產(chǎn)1,3-丙二醇的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度等性能，構(gòu)建基因工程克雷伯氏菌是實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的有效方法之一。目前，已有多種方法被用于構(gòu)建生產(chǎn)1,3-丙二醇的基因工程克雷伯氏菌：
(1)通過基因工程方法強(qiáng)化表達(dá)1,3-丙二醇合成途徑中關(guān)鍵酶，如甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶(或其同功酶)(zheng,p.,wereath,k.,sun,j.,vandenheuvel,j.,&zeng,a.p.(2006).overexpressionofgenesofthedharegulonanditseffectsoncellgrowth,glycerolfermentationto1,3-propanediolandplasmidstabilityinklebsiellapneumoniae.processbiochemistry,41(10),2160-2169；zhu,j.g.,li,s.,ji,x.j.,huang,h.,&hu,n.(2009).enhanced1,3-propanediolproductioninrecombinantklebsiellapneumoniaecarryingthegeneyqhdencoding1,3-propanedioloxidoreductaseisoenzyme.worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology,25(7),1217.)。zhu等人將大腸桿菌的yqhd基因克隆，并插入帶有四環(huán)素抗性基因的puc18-tet質(zhì)粒上，獲得了yqhd基因的強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒puc18-yqhd-tet。將質(zhì)粒puc18-yqhd-tet轉(zhuǎn)化至肺炎克雷伯氏菌中，構(gòu)建得到的基因工程菌株生產(chǎn)1,3-丙二醇濃度是對(duì)照菌株的125.33％，基因工程菌株1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率是對(duì)照菌株的121.56％。強(qiáng)化表達(dá)1,3-丙二醇氧化還原酶同功酶構(gòu)建基因工程菌株是提高1,3-丙二醇生產(chǎn)水平的有效方法。過量表達(dá)甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶(或其同功酶)可以增加這些酶的量，從而提高1,3-丙二醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。
(2)敲除1,3-丙二醇合成的副產(chǎn)物的編碼基因(cn200510127744.0；cn201310071754.1)。敲除1,3-丙二醇合成的副產(chǎn)物的編碼基因，可以阻斷副產(chǎn)物合成途徑，減少副產(chǎn)物生成，提高1,3-丙二醇轉(zhuǎn)化率。
(3)在生產(chǎn)1,3-丙二醇的克雷伯氏菌中構(gòu)建輔酶nadh再生系統(tǒng)(zhang,y.,huang,z.,du,c.,li,y.,&cao,z.a.(2009).introductionofannadhregenerationsystemintoklebsiellaoxytocaleadstoanenhancedoxidativeandreductivemetabolismofglycerol.metabolicengineering,11(2),101-106.)。將波依定假絲酵母的fdh基因克隆，并插入pmal-p2x質(zhì)粒上，獲得了fdh基因的強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pmal-p2x-fdh。將質(zhì)粒pmal-p2x-fdh轉(zhuǎn)化至產(chǎn)酸克雷伯氏菌中，構(gòu)建得到的基因工程菌株生產(chǎn)1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率是對(duì)照菌株的117.3％。引入輔酶再生系統(tǒng)構(gòu)建基因工程菌株是提高1,3-丙二醇生產(chǎn)水平的有效方法。構(gòu)建輔酶nadh再生系統(tǒng)可以為1,3-丙二醇合成提供更多輔酶nadh，提高1,3-丙二醇產(chǎn)量。
(4)采用基因工程方法改造1,3-丙二醇生產(chǎn)菌株提高抗逆性(cn200810114647.1)。提高菌株抗逆性可以提高菌株對(duì)1,3-丙二醇合成的有毒中間代謝物3-羥基丙醛的抵抗力，減少發(fā)酵過程中的異常現(xiàn)象。
(5)采用基因工程方法改造1,3-丙二醇生產(chǎn)菌株三羧酸循環(huán)相關(guān)酶表達(dá)量(cn201110069870.0)。提高三羧酸循環(huán)相關(guān)酶蘋果酸酶的表達(dá)量，加快三羧酸循環(huán)，提高atp和nadh的生成量，提高1,3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率。
克雷伯氏菌的基因組注釋結(jié)果表明，很多克雷伯氏菌都具有citt基因，但是，目前還沒有對(duì)克雷伯氏菌citt基因的相關(guān)功能的研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本案發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，在克雷伯氏菌中強(qiáng)化表達(dá)citt基因，可顯著提高克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的產(chǎn)量。
一方面，本發(fā)明提供了一種強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌。
本發(fā)明的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌，其是通過在克雷伯氏菌中強(qiáng)化表達(dá)citt基因而得到的。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌，其是通過在肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌或變棲克雷伯氏菌中強(qiáng)化表達(dá)citt基因而得到的。
本發(fā)明的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌，其中，所述citt基因?yàn)閬碜钥死撞暇腸itt基因。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌，其中，所述citt基因?yàn)閬碜苑窝卓死撞暇a(chǎn)酸克雷伯氏菌或變棲克雷伯氏菌的citt基因。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌，所述肺炎克雷伯氏菌為肺炎克雷伯氏菌atcc25955，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌為產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236，所述變棲克雷伯氏菌為變棲克雷伯氏菌atccbaa-830。
本發(fā)明中，所述變棲克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)atccbaa-830可從美國模式培養(yǎng)物寄存庫(americantypeculturecollection，atcc)購買獲得，其基因組序列可參見ncbi的記載(ncbi數(shù)據(jù)庫的保藏號(hào)為nz_cp010523.2)；肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)atcc25955可從美國模式培養(yǎng)物寄存庫(americantypeculturecollection，atcc)購買獲得，其基因組序列可參見ncbi的記載(ncbi數(shù)據(jù)庫的保藏號(hào)為aqqh00000000)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)atccbaa-1236可從美國模式培養(yǎng)物寄存庫(americantypeculturecollection，atcc)購買獲得。
另一方面，本發(fā)明還提供了構(gòu)建所述的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的方法。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在克雷伯氏菌中強(qiáng)化表達(dá)citt基因的技術(shù)可采用已知的任何可行的技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案，本發(fā)明的構(gòu)建所述的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的方法包括：
將citt基因連接至表達(dá)載體，構(gòu)建得到citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒；
將citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到克雷伯氏菌中，在卡那霉素或氯霉素的抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得陽性克隆，得到強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案，本發(fā)明的構(gòu)建所述的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的方法中，所述表達(dá)載體包括pdk6或pdk7。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建所述的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的方法包括：
步驟一，以克雷伯氏菌的基因組序列的dna為模板，設(shè)計(jì)引物，通過pcr將其citt基因完整克隆，獲得citt基因；
步驟二，將citt基因連接至表達(dá)載體，構(gòu)建得到citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒；
步驟三，將citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主克雷伯氏菌中，在卡那霉素或氯霉素的抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得陽性克隆，即為強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌。
上述強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的構(gòu)建方法中，優(yōu)選地，步驟一中，所述克雷伯氏菌為變棲克雷伯氏菌atccbaa-830時(shí)，引物設(shè)計(jì)為：
kv-citt-f：ggccgaattcatgaaagagaaaaagacaac(如seqidno：1所示)
kv-citt-r：gagcggatcctcagaacatcatggacatcc(如seqidno：2所示)。
注：“kv-citt-f”：指采用變棲克雷伯氏菌atccbaa-830時(shí)，擴(kuò)增citt基因的正向引物；“kv-citt-r”指采用變棲克雷伯氏菌atccbaa-830時(shí)，擴(kuò)增citt基因的反向引物；下述依次類推，不再贅述。
上述強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的構(gòu)建方法中，優(yōu)選地，步驟一中，所述克雷伯氏菌為肺炎克雷伯氏菌atcc25955時(shí)，引物設(shè)計(jì)為：
kp-citt-f：gagcggatccatgaaagagaaaaagacaac(如seqidno：3所示)
kp-citt-r：ggccaagctttcagaacatcatggacatcc(如seqidno：4所示)。
上述強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的構(gòu)建方法中，優(yōu)選地，步驟二中，構(gòu)建citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒的方法為：
當(dāng)表達(dá)載體為pdk6時(shí)，使用ecori和bamhi酶切citt基因和表達(dá)載體pdk6，將citt基因連接至表達(dá)載體pdk6的ecori和bamhi酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建得到的citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk6-citt；
當(dāng)表達(dá)載體為pdk7時(shí)，使用bamhi和hindiii酶切citt基因和表達(dá)載體pdk7，將citt基因連接至表達(dá)載體pdk7的bamhi和hindiii酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建得到的citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt。
上述強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的構(gòu)建方法中，優(yōu)選地，將所述citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主克雷伯氏菌中后，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有20-50μg/ml卡那霉素或氯霉素的固體lb培養(yǎng)基平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，獲得陽性克隆，即為該強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌在生產(chǎn)1,3-丙二醇中的應(yīng)用。
另一方，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，該方法包括：
將本發(fā)明所述的強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；
將種子培養(yǎng)液接種于含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生產(chǎn)得到1,3-丙二醇。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法中，搖瓶培養(yǎng)的條件為32-37℃、轉(zhuǎn)速為150-200rpm、種子培養(yǎng)基的ph為6.8-7.0，培養(yǎng)10-12h。更具體地，所述種子培養(yǎng)基中，以1l種子培養(yǎng)基計(jì)，該種子培養(yǎng)基包括10g的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的氯化鈉和50mg的卡那霉素；或，該種子培養(yǎng)基包括10g的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的氯化鈉和20-25mg的氯霉素。優(yōu)選地，每100ml種子培養(yǎng)基中接入強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌的斜面菌苔1-5環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為32-37℃、轉(zhuǎn)速為100-150rpm、通氣量為0.5-1.0vvm、發(fā)酵培養(yǎng)基ph值為6.5-6.8，發(fā)酵30-35h。優(yōu)選地，發(fā)酵過程中流加甘油使發(fā)酵液中甘油濃度控制在10-60g/l。更具體地，所述種子培養(yǎng)液與所述含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為(0.1-1):100。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基，以1l發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，該發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g的甘油、10g的k2hpo4·3h2o、2g的kh2po4、1g的nh4cl、0.1g的mgso4·7h2o、3g的檸檬酸三鈉、2g的酵母膏、50mg卡那霉素和0.3ml的微量元素溶液?；蛘?，該發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g的甘油、10g的k2hpo4·3h2o、2g的kh2po4、1g的nh4cl、0.1g的mgso4·7h2o、3g的檸檬酸三鈉、2g的酵母膏、20mg的氯霉素和0.3ml的微量元素溶液。更具體地，其中，以1l微量元素溶液計(jì)，該微量元素溶液包括7.56g的zncl2、15.65g的fecl3·6h2o、6.28g的mncl2·4h2o、1.32g的cucl2·2h2o、6.42g的cocl2·6h2o、0.48g的h3bo3和3.22g的na2moo4·2h2o。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法中，在發(fā)酵第3-4h時(shí)，向發(fā)酵液中加入0.01-1mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)citt基因的過量表達(dá)。
利用本發(fā)明方法構(gòu)建的基因工程菌株，通過強(qiáng)化citt基因的表達(dá)水平，可提高1,3-丙二醇的產(chǎn)量。本發(fā)明的部分具體實(shí)施例表明，攜帶質(zhì)粒pdk6-citt并強(qiáng)化citt基因表達(dá)的肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)atcc25955的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk6-citt的野生菌株的125％；攜帶質(zhì)粒pdk7-citt并強(qiáng)化citt基因表達(dá)的肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)atcc25955的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk7-citt的野生菌株的118％；攜帶質(zhì)粒pdk7-citt并強(qiáng)化citt基因表達(dá)的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)atccbaa-1236的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk7-citt的野生菌株的131％；攜帶質(zhì)粒pdk7-citt并強(qiáng)化citt表達(dá)的變棲克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)atccbaa-830的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk7-citt的野生菌株的129％。
具體實(shí)施方式
為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明的可實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例中pcr使用的試劑均為常規(guī)的商業(yè)產(chǎn)品，使用方法參照產(chǎn)品說明書的常規(guī)方法。
實(shí)施例中檢測發(fā)酵液中1,3-丙二醇含量是通過氣相色譜儀進(jìn)行檢測。其中，氣相色譜儀型號(hào)為gc-2014c，購自日本島津公司，色譜柱采用毛細(xì)管柱at.se-54(30m×0.53mm×1.0μm)，fid檢測器，n2作為載氣，柱溫為120℃，檢測器與進(jìn)樣器溫度為250℃。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供一種強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：
步驟一，以克雷伯氏菌atccbaa-830的基因組序列(ncbi數(shù)據(jù)庫的保藏號(hào)為nz_cp010523.2)的dna為模板，設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)為：
kv-citt-f：ggccgaattcatgaaagagaaaaagacaac(如seqidno：1所示)
kv-citt-r：gagcggatcctcagaacatcatggacatcc(如seqidno：2所示)，
通過pcr將其citt基因完整克隆，獲得citt基因。
步驟二，使用ecori和bamhi酶切citt基因和表達(dá)載體pdk6，將citt基因連接至表達(dá)載體pdk6的ecori和bamhi酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建得到citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk6-citt。
步驟三，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)肺炎克雷伯氏菌atcc25955，將citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk6-citt轉(zhuǎn)化到肺炎克雷伯氏菌atcc25955中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有50μg/ml卡那霉素的固體lb培養(yǎng)基平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，獲得陽性克隆，即為該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌。
本實(shí)施例還提供該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌atcc25955生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，包括以下步驟：
步驟(1)，將強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌atcc25955斜面菌苔1環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；其中，以1l種子培養(yǎng)基計(jì)，該種子培養(yǎng)基包括10g的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的氯化鈉和50mg的卡那霉素；搖瓶培養(yǎng)的條件為37℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、種子培養(yǎng)基的ph為7.0，培養(yǎng)12h。
步驟(2)，將種子培養(yǎng)液接種于含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)得到1,3-丙二醇；所述種子培養(yǎng)液與所述含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：100。
其中，以1l發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，該發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g的甘油、10g的k2hpo4·3h2o、2g的kh2po4、1g的nh4cl、0.1g的mgso4·7h2o、3g的檸檬酸三鈉、2g的酵母膏、50mg卡那霉素和0.3ml的微量元素溶液，以1l微量元素溶液計(jì)，該微量元素溶液包括7.56g的zncl2、15.65g的fecl3·6h2o、6.28g的mncl2·4h2o、1.32g的cucl2·2h2o、6.42g的cocl2·6h2o、0.48g的h3bo3和3.22g的na2moo4·2h2o；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為37℃、轉(zhuǎn)速為150rpm、通氣量為1.0vvm、發(fā)酵培養(yǎng)基ph值為6.5，發(fā)酵30h；
在發(fā)酵的第3h時(shí)，向發(fā)酵罐中加入0.1mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)citt基因的過量表達(dá)，并在發(fā)酵過程中流加甘油使發(fā)酵液中甘油濃度控制在10-20g/l。
使用氣相色譜檢測發(fā)酵液中1,3-丙二醇的濃度，肺炎克雷伯氏菌atcc25955發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為60g/l，強(qiáng)化表達(dá)來自變棲克雷伯氏菌atccbaa-830的citt基因的基因工程肺炎克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為75g/l，產(chǎn)量是肺炎克雷伯氏菌atcc25955產(chǎn)量的125％。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供一種強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：
步驟一，以肺炎克雷伯氏菌atcc25955的基因組序列(ncbi數(shù)據(jù)庫的保藏號(hào)為aqqh00000000)的dna為模板，設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)為：
kp-citt-f：gagcggatccatgaaagagaaaaagacaac(如seqidno：3所示)
kp-citt-r：ggccaagctttcagaacatcatggacatcc(如seqidno：4所示)，
通過pcr將其citt基因完整克隆，獲得citt基因。通過檢測，肺炎克雷伯氏菌atcc25955的citt基因與變棲克雷伯氏菌atccbaa-830的citt基因的核苷酸序列具有93％一致性，氨基酸序列具有97％一致性。
步驟二，使用bamhi和hindiii酶切citt基因和表達(dá)載體pdk7，將citt基因連接至表達(dá)載體pdk7的bamhi和hindiii酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建得到citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt。
步驟三，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)肺炎克雷伯氏菌atcc25955，將citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt轉(zhuǎn)化到肺炎克雷伯氏菌atcc25955中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有20μg/ml氯霉素的固體lb培養(yǎng)基平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，獲得陽性克隆，即為該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌。
本實(shí)施例還提供該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌atcc25955生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，包括以下步驟：
步驟(1)，將強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程肺炎克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌atcc25955斜面菌苔3環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；其中，以1l種子培養(yǎng)基計(jì)，該種子培養(yǎng)基包括10g的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的氯化鈉和20mg的氯霉素；搖瓶培養(yǎng)的條件為37℃、轉(zhuǎn)速為150rpm、種子培養(yǎng)基的ph為6.8，培養(yǎng)10h。
步驟(2)，將種子培養(yǎng)液接種于含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)得到1,3-丙二醇；所述種子培養(yǎng)液與所述含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：100。
其中，以1l發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，該發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g的甘油、10g的k2hpo4·3h2o、2g的kh2po4、1g的nh4cl、0.1g的mgso4·7h2o、3g的檸檬酸三鈉、2g的酵母膏、20mg氯霉素和0.3ml的微量元素溶液，以1l微量元素溶液計(jì)，該微量元素溶液包括7.56g的zncl2、15.65g的fecl3·6h2o、6.28g的mncl2·4h2o、1.32g的cucl2·2h2o、6.42g的cocl2·6h2o、0.48g的h3bo3和3.22g的na2moo4·2h2o；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為37℃、轉(zhuǎn)速為100rpm、通氣量為0.8vvm、發(fā)酵培養(yǎng)基ph值為6.8，發(fā)酵35h；
在發(fā)酵的第3h時(shí)，向發(fā)酵罐中加入0.1mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)citt基因的過量表達(dá)，并在發(fā)酵過程中流加甘油使發(fā)酵液中甘油濃度控制在10-20g/l。
使用氣相色譜檢測發(fā)酵液中1,3-丙二醇的濃度，肺炎克雷伯氏菌atcc25955發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為60g/l，強(qiáng)化表達(dá)其自身citt基因的基因工程肺炎克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為71g/l，產(chǎn)量是肺炎克雷伯氏菌atcc25955產(chǎn)量的118％。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供一種強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：
步驟一，以肺炎克雷伯氏菌atcc25955的基因組序列(ncbi數(shù)據(jù)庫的保藏號(hào)為aqqh00000000)的dna為模板，設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)為：
kp-citt-f：gagcggatccatgaaagagaaaaagacaac(如seqidno：3所示)
kp-citt-r：ggccaagctttcagaacatcatggacatcc(如seqidno：4所示)，
通過pcr將其citt基因完整克隆，獲得citt基因。通過檢測，肺炎克雷伯氏菌atcc25955的citt基因與變棲克雷伯氏菌atccbaa-830的citt基因的核苷酸序列具有93％一致性，氨基酸序列具有97％一致性。
步驟二，使用bamhi和hindiii酶切citt基因和表達(dá)載體pdk7，將citt基因連接至表達(dá)載體pdk7的bamhi和hindiii酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建得到citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt。
步驟三，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236，將citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt轉(zhuǎn)化到產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有20μg/ml氯霉素的固體lb培養(yǎng)基平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，獲得陽性克隆，即為該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌。
本實(shí)施例還提供該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌或產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，包括以下步驟：
步驟(1)，將強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌或產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236斜面菌苔3環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；其中，以1l種子培養(yǎng)基計(jì)，該種子培養(yǎng)基包括10g的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的氯化鈉和20mg的氯霉素；搖瓶培養(yǎng)的條件為37℃、轉(zhuǎn)速為150rpm、種子培養(yǎng)基的ph為6.8，培養(yǎng)10h。
步驟(2)，將種子培養(yǎng)液接種于含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)得到1,3-丙二醇；所述種子培養(yǎng)液與所述含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：100。
其中，以1l發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，該發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g的甘油、10g的k2hpo4·3h2o、2g的kh2po4、1g的nh4cl、0.1g的mgso4·7h2o、3g的檸檬酸三鈉、2g的酵母膏、20mg氯霉素和0.3ml的微量元素溶液，以1l微量元素溶液計(jì)，該微量元素溶液包括7.56g的zncl2、15.65g的fecl3·6h2o、6.28g的mncl2·4h2o、1.32g的cucl2·2h2o、6.42g的cocl2·6h2o、0.48g的h3bo3和3.22g的na2moo4·2h2o；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為37℃、轉(zhuǎn)速為100rpm、通氣量為0.8vvm、發(fā)酵培養(yǎng)基ph值為6.8，發(fā)酵35h；
在發(fā)酵的第3h時(shí)，向發(fā)酵罐中加入0.01mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)citt基因的過量表達(dá)，并在發(fā)酵過程中流加甘油使發(fā)酵液中甘油濃度控制在20-40g/l。
使用氣相色譜檢測發(fā)酵液中1,3-丙二醇的濃度，產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為55g/l，強(qiáng)化表達(dá)來自肺炎克雷伯氏菌atcc25955的citt基因的基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為72g/l，產(chǎn)量是產(chǎn)酸克雷伯氏菌atccbaa-1236產(chǎn)量的131％。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供一種強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程變棲克雷伯氏菌的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：
步驟一，以肺炎克雷伯氏菌atcc25955的基因組序列(ncbi數(shù)據(jù)庫的保藏號(hào)為aqqh00000000)的dna為模板，設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)為：
kp-citt-f：gagcggatccatgaaagagaaaaagacaac(如seqidno：3所示)
kp-citt-r：ggccaagctttcagaacatcatggacatcc(如seqidno：4所示)，
通過pcr將其citt基因完整克隆，獲得citt基因。通過檢測，肺炎克雷伯氏菌atcc25955的citt基因與變棲克雷伯氏菌atccbaa-830的citt基因的核苷酸序列具有93％一致性，氨基酸序列具有97％一致性。
步驟二，使用bamhi和hindiii酶切citt基因和表達(dá)載體pdk7，將citt基因連接至表達(dá)載體pdk7的bamhi和hindiii酶切位點(diǎn)間，構(gòu)建得到citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt。
步驟三，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)變棲克雷伯氏菌atccbaa-830，將citt強(qiáng)化表達(dá)質(zhì)粒pdk7-citt轉(zhuǎn)化到變棲克雷伯氏菌atccbaa-830中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有25μg/ml氯霉素的固體lb培養(yǎng)基平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，獲得陽性克隆，即為該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程變棲克雷伯氏菌。
本實(shí)施例還提供該強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程變棲克雷伯氏菌或變棲克雷伯氏菌atccbaa-830生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，包括以下步驟：
步驟(1)，將強(qiáng)化表達(dá)citt基因工程變棲克雷伯氏菌或變棲克雷伯氏菌atccbaa-830斜面菌苔2環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；其中，以1l種子培養(yǎng)基計(jì)，該種子培養(yǎng)基包括10g的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的氯化鈉和20mg的氯霉素；搖瓶培養(yǎng)的條件為32℃、轉(zhuǎn)速為150rpm、種子培養(yǎng)基的ph為6.8，培養(yǎng)12h。
步驟(2)，將種子培養(yǎng)液接種于含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)得到1,3-丙二醇；所述種子培養(yǎng)液與所述含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為0.1：100。
其中，以1l發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，該發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g的甘油、10g的k2hpo4·3h2o、2g的kh2po4、1g的nh4cl、0.1g的mgso4·7h2o、3g的檸檬酸三鈉、2g的酵母膏、50mg卡那霉素和0.3ml的微量元素溶液，以1l微量元素溶液計(jì)，該微量元素溶液包括7.56g的zncl2、15.65g的fecl3·6h2o、6.28g的mncl2·4h2o、1.32g的cucl2·2h2o、6.42g的cocl2·6h2o、0.48g的h3bo3和3.22g的na2moo4·2h2o；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為32℃、轉(zhuǎn)速為100rpm、通氣量為0.5vvm、發(fā)酵培養(yǎng)基ph值為6.8，發(fā)酵32h；
在發(fā)酵的第4h時(shí)，向發(fā)酵罐中加入1mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)citt基因的過量表達(dá)，并在發(fā)酵過程中流加甘油使發(fā)酵液中甘油濃度控制在40-60g/l。
使用氣相色譜檢測發(fā)酵液中1,3-丙二醇的濃度，變棲克雷伯氏菌atccbaa-830發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為52g/l，強(qiáng)化表達(dá)來自肺炎克雷伯氏菌atcc25955的citt基因的基因工程變棲克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的濃度為67g/l，產(chǎn)量是變棲克雷伯氏菌atccbaa-830產(chǎn)量的129％。
綜上所述，利用本發(fā)明方法構(gòu)建的基因工程菌株，通過強(qiáng)化citt基因的表達(dá)水平，可提高1,3-丙二醇的產(chǎn)量。攜帶質(zhì)粒pdk6-citt并強(qiáng)化citt基因表達(dá)的肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)atcc25955的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk6-citt的野生菌株的125％；攜帶質(zhì)粒pdk7-citt并強(qiáng)化citt基因表達(dá)的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)atccbaa-1236的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk7-citt的野生菌株的131％；攜帶質(zhì)粒pdk7-citt并強(qiáng)化citt表達(dá)的變棲克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)atccbaa-830的1,3-丙二醇產(chǎn)量是不攜帶質(zhì)粒pdk7-citt的野生菌株的129％。
序列表
<110>張家港美景榮化學(xué)工業(yè)有限公司
<120>強(qiáng)化表達(dá)citt基因的克雷伯氏菌及其生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用
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