本發(fā)明涉及一種工程菌及其構(gòu)建方法，具體是一種酪氨酸酚裂解酶工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

左旋多巴（3,4-dihydroxyphenyl-l-ananine，簡(jiǎn)稱l-dopa）的化學(xué)名稱為3,4-二羥基苯基丙氨酸，其結(jié)構(gòu)式為：

作為一種重要的生物活性物質(zhì)，l-dopa是從l-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物。

上世紀(jì)60年代，國(guó)外許多學(xué)者開(kāi)始致力于微生物酶法合成l-dopa的研究。為了提高l-dopa產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，研究者們對(duì)微生物酶法合成l-dopa的工藝方法進(jìn)行了大量研究。

酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenollyase，tpl，e.c.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，該酶分子量約200kda，是一個(gè)四聚體酶。tpl酶以磷酸吡哆醛（pyridoxal-phosphate，plp）為輔酶，以鉀離子和氨離子為輔助因子，tpl可以催化l-酪氨酸發(fā)生β-消去反應(yīng)生成苯酚、丙酮酸和氨。由于這個(gè)反應(yīng)是可逆的，將鄰苯二酚代替苯酚后，可由鄰苯二酚、丙酮酸和氨可在tpl催化下生成l-dopa。左旋多巴的前體在較高濃度時(shí)對(duì)酶活都有抑制作用，其中鄰苯二酚及丙酮酸除了有強(qiáng)抑制作用外，還會(huì)導(dǎo)致酶的不可逆失活，反應(yīng)條件難以控制，副產(chǎn)物多，l-dopa的產(chǎn)率低。

印度r.krishnavenivandanarathod等人利用真菌acremoniumrutilum轉(zhuǎn)化l-酪氨酸至l-多巴，酪氨酸酶比活達(dá)1095u/mg。但目前產(chǎn)能較低，只有0.89g/l。

巴基斯坦ikram-ul-haq等人對(duì)產(chǎn)酪氨酸酶的aspergillusoryzae進(jìn)行紫外誘變，誘變株最大產(chǎn)量達(dá)1.28g/l。

埃及doaaa.r.mahmoud?magdaa.elbendary利用egyptianhalophilicblackyeast的酪氨酸酶轉(zhuǎn)化生成l-dopa，產(chǎn)量為66μg/ml。

韓國(guó)研究人員使用酪氨酸酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，利用電取代還原試劑，將多巴醌（dopaquinone）還原為l-多巴，使轉(zhuǎn)化率達(dá)95.9，生產(chǎn)強(qiáng)度47.27mg/l*h。

也有一些利用自然界中的細(xì)菌，如escherichia、proteus（變形菌屬）、stizolobiumhassjoo和erwinia(歐文氏菌屬)等，來(lái)合成l-dopa，如左旋多巴酶法合成綜述報(bào)道，tpl大腸桿菌基因工程菌轉(zhuǎn)化30h，轉(zhuǎn)化生成29.6g/l的l-dopa。又如，jang-younglee等人克隆來(lái)源于escherichiacoliw(atcc11105)的對(duì)羥基苯乙酸-3-羥基化酶（p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase，phah），轉(zhuǎn)化l-酪氨酸為l-dopa，產(chǎn)物累積至10g/l。研究者發(fā)現(xiàn)這些重組菌株雖然tpl的表達(dá)量高于野生菌株，但最終的l-dopa合成能力卻沒(méi)有明顯提高甚至低于野生菌株。這可能因?yàn)橐@得較高的l-dopa合成能力，菌株除了具備tpl高活性外，還要有相對(duì)完善的底物、產(chǎn)物出入細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及對(duì)底物鄰苯二酚抑制酶活的耐受力等?？傮w來(lái)說(shuō)，反應(yīng)條件難以控制，穩(wěn)定性差，副產(chǎn)物多，l-dopa的產(chǎn)率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種工程菌；鑒定為大腸埃希氏菌，命名為大腸埃希氏菌mbp-tpl（escherichiacolimbp-tpl），保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢,武漢大學(xué)，保藏日期為2017年4月21日，保藏編號(hào)為cctccno：m2017202。

本發(fā)明的目的是提供所述工程菌的構(gòu)建方法，將酪氨酸酚裂解酶基因與麥芽糖結(jié)合蛋白基因連接在一起構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，即融合表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白和酪氨酸酚裂解酶的表達(dá)質(zhì)粒，得到大腸埃希氏菌mbp-tpl。該菌發(fā)酵單位菌體量的酪氨酸酚裂解酶酶活高，可溶性表達(dá)量大。

所述工程菌是全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因，連入到含有麥芽糖結(jié)合蛋白基因的表達(dá)載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pmbp-tpl。

以上操作構(gòu)建的菌提高了單位菌體的酶活，后續(xù)轉(zhuǎn)化合成左旋多巴時(shí)，投菌量少，后續(xù)提取速率提高。

作為優(yōu)選，所述酪氨酸酚裂解酶基因來(lái)源于弗氏檸檬酸桿菌，連入表達(dá)載體上融合性好，后續(xù)表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)產(chǎn)物更高效地、更專一的合成左旋多巴，副產(chǎn)物少，給后續(xù)的分離純化帶來(lái)了很大的方便，并簡(jiǎn)化了分離步驟，有效的降低了生產(chǎn)成本。

作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體采用psyno-1。

作為優(yōu)選，所述受體菌采用bl21（de3），酶表達(dá)效率高，而且表達(dá)穩(wěn)定，產(chǎn)率高，遺傳穩(wěn)定性高。

作為優(yōu)選，構(gòu)建方法具體包括：（1）將克隆得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段整合進(jìn)表達(dá)載體psyno-1上，并將整合后的重整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入bl21（de3），獲得mbp-tpl菌。

上述方案通過(guò)優(yōu)選表達(dá)載體和受體菌，可以有效提高目的基因片段的可溶性表達(dá)，提高工程菌單位菌體量的酪氨酸酚裂解酶表達(dá)量以及活性。

上述所得到的工程菌大腸埃希氏菌mbp-tpl，用于在底物溶液存在條件下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生l-多巴。

具體操作步驟包括：

（1）挑單菌落接種到含lb培養(yǎng)基的試管中，加卡那霉素（25-50mg/l）30-37℃，220rpm，培養(yǎng)12-16h，得到一級(jí)種子；

（2）將所述一級(jí)種子接種到含發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，30-37℃，200-250rpm，培養(yǎng)2-5h，加iptg至終濃度0.6mm，28-32℃，180-220rpm，培養(yǎng)10-12h；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：胰蛋白胨12g/l、酵母提取物24g/l、甘油5g/l，磷酸二氫鉀2.31g/l、三水磷酸氫二鉀16.43g/l；

（3）離心收菌，得到菌體；

（4）菌體35g，加入底物溶液，攪勻，25℃，密封震蕩反應(yīng)；所述底物溶液包括14-16g/l的丙酮酸鈉、10-12g/l的鄰苯二酚、40-45g/l的氯化銨、2-5g/l的亞硫酸鈉、1-3g/l的edta，調(diào)ph7.5-8.5。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明將兩個(gè)酪氨酸酚裂解酶基因與麥芽糖結(jié)合蛋白基因連接在一起構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，可以有效提高目的基因片段的表達(dá)效率，可溶性表達(dá)量大，可以在提供相關(guān)底物下，轉(zhuǎn)化合成左旋多巴，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，產(chǎn)率高，具有工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以說(shuō)明。

實(shí)施例1：

1.將bl21（de3）制備成感受態(tài)細(xì)胞

使用takara感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，制備獲得bl21（de3）感受態(tài)。

2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段

根據(jù)geneid：x66978.1提供的序列，合成來(lái)源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。

3.構(gòu)建酪氨酸酶表達(dá)質(zhì)粒pmbp-tpl

將酪氨酸酶全基因片段亞克隆至psyno-1質(zhì)粒上麥芽糖結(jié)合蛋白基因片段下游。

4.表達(dá)質(zhì)粒pmbp-tpl導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞

1)感受態(tài)從-70度取出后立刻插入冰水浴中3min；

2)超凈臺(tái)中取1微升的質(zhì)粒pmbp-tpl加入感受態(tài)，輕彈混勻，立刻插入冰水浴25min，靜置；

3)將感受態(tài)輕輕轉(zhuǎn)移至42度水浴熱激1.5min，立刻輕輕轉(zhuǎn)移至冰水浴5min；

4)加700微升左右的lb，150rpm，37度，60min復(fù)蘇；

5)3500rpm*3min，棄上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勻，涂布加卡那霉素（50mg/l）lb平板，37℃培養(yǎng)16h，獲得大腸埃希氏菌pmbp-tpl。

實(shí)例2：

發(fā)酵產(chǎn)生酪氨酸酚裂解酶

lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物0.5g/l、氯化鈉10g/l、純水。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨12g/l、酵母提取物24g/l、甘油5g/l，磷酸二氫鉀2.31g/l、三水磷酸氫二鉀16.43g/l、純水。

1)挑單菌落接種4mllb培養(yǎng)基試管中，加卡那霉素（50mg/l），37℃，220rpm，培養(yǎng)12h，得到一級(jí)種子；

2)一級(jí)種子接種到100ml的發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃，220rpm，培養(yǎng)4h，加iptg至終濃度1mm，25℃，220rpm，培養(yǎng)12h；

3)步驟（2）中菌液離心收菌體，放置-20℃冰箱。

實(shí)例3：酪氨酸酚裂解酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生l-多巴

1)1l底物溶液：14g/l的丙酮酸鈉、10g/l的鄰苯二酚、40g/l的氯化銨、2g/l的亞硫酸鈉、1g/l的edta，調(diào)ph8.0；

2)菌體35g，加入1l底物溶液，攪勻，25℃，密封震蕩反應(yīng)；

3)每半小時(shí)添加一次底物（等量的丙酮酸鈉和領(lǐng)苯二酚），控制兩種底物底物濃度不高于10g/l；

4)當(dāng)鄰苯二酚殘留濃度至1g/l以下，停止反應(yīng)，l-多巴濃度累積至100g/l以上。