本發(fā)明屬于應用生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種枯草芽孢桿菌菌株及其應用。
背景技術(shù)：
：隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對公廁環(huán)境也有了更高的要求，除了日常的人工清潔打掃衛(wèi)生之外,惡臭污染也已成為公廁環(huán)境治理的重要議題。目前常見的殺菌方法包括物理殺菌除臭,化學殺菌除臭和生物抑菌除臭。對于公廁環(huán)境而言，難以采用物理殺菌除臭的方法實現(xiàn)衛(wèi)生清潔，所以目前大多采用化學殺菌除臭，例如二氯異氰尿酸鈉、次氯酸鈣、過氧乙酸、戊二醛、環(huán)氧乙烷等化學殺菌劑。然而，這些化學殺菌劑往往都伴隨著刺鼻的異味，會造成廁所內(nèi)空氣質(zhì)量的二次污染，噴灑把握不當還會造成呼吸不暢，皮膚沾染過敏等現(xiàn)象。而且由于殺菌劑的化學成分會與空氣接觸后揮發(fā)，需要在同一廁所不定期多次噴灑以達到預期效果，這給噴灑的人員和廁所使用人員帶來一定的安全隱患。在公廁的除臭方法中，采用生物抑菌除臭能夠解決化學殺菌除臭帶來的問題，做到無異味，無二次污染。生物抑菌除臭采用的菌株繁殖迅速，存活時間長，在生長過程中還會產(chǎn)生其他有益菌素，對人畜無危害，不污染環(huán)境，抑菌除臭效果持續(xù)而且較強，是公廁除臭、環(huán)境凈化的更好選擇，可廣泛推廣應用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要目的是提供一株枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)菌株。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，保藏編號為：cgmccno.13714；該菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(cgmcc)；保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101；保藏日期為：2017年3月1日。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌cgmcc13714采集自四川雙流某養(yǎng)豬廠排放出的養(yǎng)殖污水，其性狀特征為：菌株細胞呈長桿狀，芽孢為橢圓形；菌落表面粗糙不透明，呈污白色，液體培養(yǎng)時會形成皺醭，可以在偏酸或偏堿的環(huán)境中生存?？莶菅挎邨U菌cgmcc13714的生理生化性質(zhì)如表1所示：表1枯草芽孢桿菌cgmcc13714的生理生化性質(zhì)本發(fā)明的另一個目的是提供枯草芽孢桿菌在制備除臭菌劑中的應用。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：枯草芽孢桿菌在制備除臭菌劑中的應用，包括如下步驟：1)、制備枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液：將枯草芽孢桿菌cgmcc13714接種于活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到活化菌種，將活化菌種接種于擴大發(fā)酵培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。2)、接種除臭：將擴大培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液接種在糞便中，保持溫度20～35℃。優(yōu)選的：所述的擴大培養(yǎng)為將枯草芽孢桿菌cgmcc13714接種在擴大發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30～35℃、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)24～48h。優(yōu)選的：所述的枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液的濃度為107～108cfu/ml。優(yōu)選的：所述的步驟2)中枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液接種的量為1～10％(v/w)。優(yōu)選的：所述的步驟2)中枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液接種的量為5％(v/w)。優(yōu)選的：所述的活化培養(yǎng)基的組分包括：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化鈉5g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。優(yōu)選的：所述的擴大發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括：蛋白胨5g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化鈉5g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。優(yōu)選的：枯草芽孢桿菌cgmcc13714固體培養(yǎng)時，所述的活化培養(yǎng)基和擴大發(fā)酵培養(yǎng)基還包括瓊脂1.0％～2.0％(w/v)。優(yōu)選的：用枯草芽孢桿菌cgmcc13714制備固體除臭菌劑：將所述的枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液與填充劑按質(zhì)量比為1:1的比例混合，混合物置于40℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干培養(yǎng)20～24h，至含水量為15～20％；所述填充劑為滅菌麩皮。本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明提供了一種新的枯草芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌cgmcc13714，該菌株從養(yǎng)殖廠排放的廢水中篩選得到，不會對周圍環(huán)境與生態(tài)平衡造成危害，符合生物安全法規(guī)。且枯草芽孢桿菌是非致病細菌，對人畜無害，不污染環(huán)境。2、枯草芽孢桿菌cgmcc13714能夠應用于糞便的生物除臭，該菌株單一使用的除臭效果穩(wěn)定，受溫度影響小，在常溫條件下仍具有較好的現(xiàn)場除臭效果。相較于混合菌株制劑，本發(fā)明具有制備工藝簡單高效，使用方便，包裝、運輸便利，易形成商品化的明顯的技術(shù)優(yōu)勢。3、枯草芽孢桿菌cgmcc13714可以通過原位除臭方法有效除臭，相較于異位除臭方法(如土壤除臭法、反應器除臭法等)除臭操作簡單易行、無需配套設(shè)備與技術(shù)、投資規(guī)模小。其原位除臭的原理是：枯草芽孢桿菌cgmcc13714以攝取糞便中的糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)為基礎(chǔ)，能夠?qū)⒓S池中的游離氧消耗掉，促進有益厭氧菌生長，降低ph值，有效抑制有害微生物的活動以及有機物的急劇腐敗分解。同時，枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素和短桿菌肽等活性物質(zhì)對致病菌有明顯的抑制作用。4、枯草芽孢桿菌cgmcc13714可直接接種(如噴灑菌液)、持續(xù)作用時間長，在孢子狀態(tài)下穩(wěn)定性好，可以在糞便中良好生長，占據(jù)有利生態(tài)位，抑制產(chǎn)惡臭微生物生長繁殖，降低糞便惡臭釋放強度，實現(xiàn)了惡臭原位源頭控制。具體實施方式下面具體提供優(yōu)選的實施例，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更加清楚本發(fā)明的技術(shù)方案和效果。實施例1：枯草芽孢桿菌cgmcc13714的選育(1)將10ml取自四川雙流某養(yǎng)豬廠排放出的養(yǎng)殖污水懸于90ml無菌蒸餾水中震蕩均勻，煮沸5min，冷卻后進行梯度稀釋，分別從稀釋度為10-2、10-4、10-6、10-8、10-10的稀釋液中吸取0.1ml，并涂布于篩選培養(yǎng)基中，在35℃條件下培養(yǎng)24h，得到多個菌落。這里采用的篩選培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其組分包括：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5.0g，加水至1000ml、ph7.0～7.4，經(jīng)過121℃、30min高溫滅菌處理。(2)挑選形態(tài)各異、生長旺盛、表面光滑且粘稠的菌落5株，相同的培養(yǎng)條件下，將這5株菌進行反復劃線培養(yǎng)三次以上，獲得純菌株，分別編號為1號、2號、3號、4號和5號菌株，斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后于4℃保存。將五株菌株分別用活化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的菌液1ml接種于裝有100g人糞便的1l燒杯中，在溫度為30℃的條件下作用3d后，分別測量五個燒杯中的惡臭強度、氨氣濃度、硫化氫濃度。其中，接種3號菌株的燒杯中臭氣強度降低了26.8％、氨氣濃度降低了39.5％、硫化氫濃度降低了35.2％，遠高于其他四個菌株，初步判斷其除臭能力最強，命名為fjn。(3)菌種鑒定1)、形態(tài)特征：細胞為桿狀，革蘭氏陽性，寬0.7～1μm、長2～3μm；無莢膜，周生鞭毛，能運動；在37℃培養(yǎng)2～3天形成芽孢，芽孢大小0.6～0.9×1～1.5μm，為橢圓或圓柱形，位于菌體中央或稍偏。2)、培養(yǎng)性質(zhì)：菌株細胞呈長桿狀，芽孢為橢圓形；菌落表面粗糙不透明，呈污白色，液體培養(yǎng)時會形成皺醭。3)、分子生物學鑒定：提取菌株全基因組dna，pcr擴增16srdna片段，測序，測序結(jié)果在ncbi中進行比對，比對結(jié)果顯示該菌株為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。實施例2：枯草芽孢桿菌cgmcc13714應用于糞便除臭1、培養(yǎng)基及接種菌液制備固體活化培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化鈉5.0g，瓊脂15g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。液體擴大發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化鈉5.0g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。將枯草芽孢桿菌cgmcc13714接種至活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24h得活化菌種待用；將活化菌種接種到擴大發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃、120rmp條件下振蕩培養(yǎng)24h，得接種菌液，待用。2、糞便除臭處理將接種菌液5ml接種于裝有500g人糞便的1l燒杯中(接種量1.0％，v/w)，保鮮膜密封燒杯；同時做不加菌液的對照，每組實驗設(shè)置三個重復，保持溫度30℃。5d后測定惡臭強度、氨氣濃度、硫化氫濃度，測定結(jié)果如下表2所示。表2枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌株除臭效果(30℃)由表2可知，溫度為30℃時，糞便中添加枯草芽孢桿菌cgmcc13714作用5d后，臭氣強度、氨氣濃度和硫化氫濃度均比對照明顯降低，其中臭氣強度降低29.3％、氨氣濃度降低41.0％、硫化氫濃度降低37.0％。實施例3：枯草芽孢桿菌cgmcc13714應用于糞便除臭1、培養(yǎng)基及接種菌液制備活化培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化鈉5.0g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。液體擴大發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化鈉5.0g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。將枯草芽孢桿菌cgmcc13714接種至活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24h得活化菌種待用；將活化菌種接種到擴大發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、120rmp條件下振蕩培養(yǎng)24h，得接種菌液，待用。2、糞便除臭處理將接種菌液5ml接種于裝有500g人糞便的1l燒杯中(接種量1.0％，v/w)，保鮮膜密封燒杯；同時做不加菌液的對照，每組實驗設(shè)置三個重復，保持溫度20℃。5d后測定惡臭強度、氨氣濃度、硫化氫濃度，測定結(jié)果如下表3所示。表3枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌株除臭效果(20℃)測定指標對照菌株處理降低率(％)臭氣強度(ou)17675015566011.8氨氣濃度(mg/m3)34.223.132.5硫化氫濃度(mg/m3)105.286.517.8由表3可知，溫度為20℃，糞便中添加枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液作用5d后，臭氣強度降低11.8％、氨氣濃度降低32.5％、硫化氫濃度降低17.8％。與溫度為30℃時相比，除臭效果下降，但依然表現(xiàn)出一定的除臭效果。實施例4：枯草芽孢桿菌cgmcc13714應用于糞便除臭培養(yǎng)基及接種菌液制備方法與實施例2相同，糞便除臭處理設(shè)置三組平行實驗，三組中菌液的接種量(v/w)分別為2％、5％和10％，保持溫度在25～35℃范圍內(nèi)，5d后測定惡臭強度、氨氣濃度、硫化氫濃度，測定結(jié)果如下表4所示。表4枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌株除臭效果由表4可知，糞便中添加不同接種量的枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液作用5d后，除臭效果隨接種量增大表現(xiàn)為先增加后降低趨勢，其中在接種量為5％時，除臭效果最好，臭氣強度降低35.4％、氨氣濃度降低50.0％、硫化氫濃度降低47.5％。實施例5：枯草芽孢桿菌cgmcc13714應用于公共廁所除臭培養(yǎng)基及接種菌液制備方法與實施例2相同，在成都市武侯區(qū)某公共廁所內(nèi)，環(huán)境溫度為30℃～35℃，用枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液進行噴灑蹲便池(噴灑量可根據(jù)該公共廁所的人流量和異味程度進行調(diào)整，例如此次的噴灑量為12ml/蹲便池)。分別測定噴灑前與噴灑后第5d廁所內(nèi)惡臭強度、氨氣濃度、硫化氫濃度，測定結(jié)果如下表5。表5枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌株除臭效果(30～35℃)測定指標對照菌株處理降低率(％)臭氣強度(ou)3562168552.7氨氣濃度(mg/m3)3.52.140.0硫化氫濃度(mg/m3)16.76.561.1由表5可知，在公共廁所內(nèi)噴灑枯草芽孢桿菌cgmcc13714菌液5d后，臭氣強度、氨氣濃度和硫化氫濃度均比噴灑前明顯降低，其中臭氣強度降低52.7％、氨氣濃度降低40.0％、硫化氫濃度降低61.1％，除臭效果與上述實施例一小試規(guī)模除臭效果相當。實施例6：制備除臭菌劑1、液體除臭菌劑：培養(yǎng)基的制備和活化培養(yǎng)與實施例3相同，將活化菌種接種到擴大發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、120rmp條件下振蕩培養(yǎng)48h，制得液體除臭菌劑。擴大發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化鈉5.0g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。2、固體除臭菌劑：將液體除臭菌劑與滅菌麩皮按照質(zhì)量比為1:1的比例混合，置于40℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干培養(yǎng)21h，使含水量低至15～20％，得到固體除臭菌劑。序列表<110>成都友益佳環(huán)保設(shè)備工程有限公司<120>一種枯草芽孢桿菌菌株及其應用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1503<212>dna<213>枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)<400>1cctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgg60gagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgta120agactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggt180tcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctag240ttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggc300cacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccg360caatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaa420agctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacct480aaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcg540ttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaag600cccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggaga660gtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaag720gcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggatta780gataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccc840ttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaa900ctcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaa960cgcgaa1020gaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggg1080gcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt1140cccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtg1200actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1260cctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaag1320ccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagct1380ggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtaca1440caccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttagg1500agccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccg1503當前第1頁12