本發(fā)明涉及植物病蟲害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株微白黃鏈霉菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

連作障礙已成為影響設(shè)施園藝及專業(yè)化種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制性因素。由連作引起的植物根結(jié)線蟲病就是連作障礙的一種形式，該病害可造成全世界每年高達(dá)1000多億美元的經(jīng)濟(jì)損失?；瘜W(xué)農(nóng)藥雖能在一定程度上減輕根結(jié)線蟲病害，但由于其在農(nóng)產(chǎn)品中殘留危害食品安全，在土壤中殘留引起環(huán)境污染，導(dǎo)致化學(xué)殺線劑在生產(chǎn)上的應(yīng)用受到限制。

無公害的微生物防治是目前解決植物連作障礙的主要途徑之一。篩選植物病蟲害生防微生物，探索這些微生物對根結(jié)線蟲病的防效及其作用機(jī)制，是利用微生物防控根結(jié)線蟲病的基礎(chǔ)。

放線菌可產(chǎn)多種抗生素及其他生物活性物質(zhì)，具有孢子抗逆性強(qiáng)、菌劑保藏時(shí)間長及誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等優(yōu)點(diǎn)。另外，放線菌中的鏈霉菌屬產(chǎn)生抗生活性物質(zhì)的菌種比例最高?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的抗菌活性物質(zhì)中，約70％來源于微生物，而微生物產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)中，約70％來源于放線菌，放線菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)中，70％來源于鏈霉菌。因此，鏈霉菌中可能有較高比例的產(chǎn)殺蟲物質(zhì)產(chǎn)生菌。因此，從放線菌中篩選具有殺線蟲活性且對農(nóng)作物具有防病促生作用的多功能放線菌，對包括根結(jié)線蟲在內(nèi)的土壤連作障礙修復(fù)具有重要意義。但目前生產(chǎn)上尚無可用于根結(jié)線蟲防治的放線菌制劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供1株具有殺線蟲及抗病活性且能促進(jìn)植物生長的多功能放線菌，同時(shí)提供該菌在防病促生方面的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

(一)一株微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4，于2017年5月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno:m2017237，地址為武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編：430072。

所述微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4的16srdna序列如seqidno.1所示。

所述微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物吲哚乙酸和鐵載體。

(二)微白黃鏈霉菌的應(yīng)用

(1)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在防治植物病害中的應(yīng)用。

(2)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在防治農(nóng)作物土傳根系病害中的應(yīng)用。

(3)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在防治線蟲中的應(yīng)用。

(4)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在防治根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。

(5)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在提高農(nóng)作物種子活力中的應(yīng)用。

(6)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在植物促生中的應(yīng)用。

(7)微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4在促進(jìn)土壤中有益微生物生長和抑制有害微生物生長中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的放線菌微白黃鏈霉菌t4可產(chǎn)植物生長刺激物質(zhì)吲哚乙酸和植物生長促生物質(zhì)鐵載體，可顯著促進(jìn)農(nóng)作物的根系生長，增強(qiáng)農(nóng)作物根系活力，顯著提高農(nóng)作物種子活力；另外，本發(fā)明提供的微白黃鏈霉菌t4對包括根結(jié)線蟲及根系土傳病害在內(nèi)的連作障礙具有良好的修復(fù)能力；微白黃鏈霉菌t4對秀麗隱桿線蟲的校正致死率可達(dá)95.4％；微白黃鏈霉菌t4的無細(xì)胞發(fā)酵濾液對農(nóng)作物土傳根系病害病原真菌尖孢鐮刀菌及腐皮鐮刀具有較強(qiáng)的拮抗作用，其可促進(jìn)農(nóng)作物根區(qū)土壤中有益菌生長，并抑制植物病原菌生長。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4的系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖2為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4的菌落形態(tài)；

圖3為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4菌體形態(tài)的掃描電鏡圖；其中，a為菌絲體；b為孢子鏈；c為孢子；d為孢子表面；

圖4為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4代謝產(chǎn)物中的4種植物激素標(biāo)準(zhǔn)樣品的氣相色譜分析結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為毫吸光度，單位是mau；a為激動(dòng)素，b為吲哚-3-乙酸，c為天然脫落酸；d為6-芐氨基嘌呤；

圖5為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4代謝產(chǎn)物中吲哚乙酸的氣相色譜分析結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為毫吸光度，單位是mau；b為吲哚-3-乙酸；

圖6為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4處理與對照盆栽番茄根系分類標(biāo)準(zhǔn)圖；其中，a為正常健康根系，b為輕病根，c為重病根。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供一株放線菌，具體為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavust4，該菌于2017年5月4日保藏于在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno:m2017237。

本實(shí)施例所用的試驗(yàn)材料及其對試驗(yàn)材料的處理如下：

(1)殺線蟲放線菌：微白黃鏈霉菌t4，生防鏈霉菌，分離篩選自中國西北甜瓜健株根區(qū)土壤。供試菌劑為固態(tài)菌粉，由t4通過固態(tài)發(fā)酵制備，菌劑的活菌數(shù)為1.70×10¹⁰cfug^-1。

(2)番茄品種：厚皮毛粉802，屬茸毛型高秧粉紅果。

(3)病土：2014年9月采自陜西省楊陵區(qū)孟家寨農(nóng)戶連作4年以上的日光溫室染病番茄根區(qū)。在番茄盛果期，挑選根結(jié)線蟲侵害嚴(yán)重的番茄，拔出病株后用取樣鏟將表層5cm左右的浮土除去，采集根系分布區(qū)5～20cm土壤裝入塑料自封袋內(nèi)充分混勻，作為溫室盆栽試驗(yàn)的病土接種材料。經(jīng)貝爾曼淺盤法測定，病土中的線蟲密度為80萬條·kg^-1。

(4)盆栽土壤：塿土，采集相同類型的非連作健康土壤0～20cm耕層土壤，風(fēng)干，破碎過10mm篩混勻。

實(shí)施例1菌株的篩選及鑒定

1.試驗(yàn)方法：

1.1分離篩選：采用高氏1號瓊脂及稀釋平皿涂抹法從甜瓜健株根區(qū)土壤中分離篩選，該菌株具有抗病促生作用。

1.2菌株鑒定

形態(tài)特征：菌落形態(tài)，通過稀釋平皿涂抹法獲得單菌落，觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣狀況、隆起程度、表面光澤、粘稠度及菌落顏色等特征。細(xì)胞形態(tài)：掃描電鏡觀察。16srdna序列分析獲取序列后，在ncbi數(shù)據(jù)庫中通過blast程序進(jìn)行相似度搜索，采用mega5.0軟件中的neighbor-joining法將同源性較高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.試驗(yàn)結(jié)果：

streptomycesalbidoflavust4的16srdna序列如下：

gtcgaacgatgaaccgctttcgggcggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggatatgaccgtctgccgcatggtggatggtgtaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtagtggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggttgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcactaggtgtgggcaacattccacgttgtccgtgccgcagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacgtctggagacaggcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcccgtgttgccagcaggcccttgtggtgctggggactcacgggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggagggagctgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaa

采用blast軟件在genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列相似性搜索，調(diào)取與t4相似性較高的9株鏈霉菌屬相關(guān)典型菌株，用clustalx2.0軟件進(jìn)行序列相似性分析，neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

從圖1看出，放線菌t4與微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)和達(dá)格斯坦鏈霉菌(streptomycesdaghestanicus)在同一系統(tǒng)進(jìn)化分支上，t4與微白黃鏈霉菌的相似度為99.52％,與達(dá)格斯坦鏈霉菌的相似度為99.31％。綜合16srdna序列分析結(jié)果及形態(tài)與生理生化特征，將菌株t4鑒定為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)。

streptomycesalbidoflavust4菌落形態(tài)見圖2，由圖可知，菌落直徑12-15mm，菌落表面的氣生菌絲形成不完整灰白色皮革狀菌膜，菌落中央菌膜缺失，菌落邊緣形成約2mm寬的深灰色孢子環(huán)，菌落背面呈棕黑色。

streptomycesalbidoflavust4菌體形態(tài)的掃描電鏡圖見圖3。

實(shí)施例2streptomycesalbidoflavust4促生特性測定

1.試驗(yàn)方法

1.1產(chǎn)吲哚乙酸(iaa)能力：在無菌條件下，挑取平板上己經(jīng)活化好的streptomycesalbidoflavust4菌株單菌落轉(zhuǎn)接到高氏1號液體培養(yǎng)基上，30℃，120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)8天，發(fā)酵液用離心法除去菌體，所得上清液用微孔濾膜(0.22μm)抽濾除菌，獲得無細(xì)胞發(fā)酵濾液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?；以乙酸乙酯作為萃取劑提取t4無細(xì)胞發(fā)酵濾液中的次級代謝產(chǎn)物，利用蒸餾裝置從streptomycesalbidoflavust4無細(xì)胞發(fā)酵濾液萃取物中蒸餾出次級代謝產(chǎn)物，通過氣相色譜(hplc)定性分析其次級代謝產(chǎn)物中有無吲哚乙酸。采用salkowski比色法測定t4的次級代謝產(chǎn)物中的吲哚乙酸(iaa)產(chǎn)量。

1.2產(chǎn)鐵載體能力：吸取離心后的上清液1ml，加入1ml0.5mol·l^-1鹽酸，1ml鉬酸鈉溶液，1ml1mol·l^-1氫氧化鈉溶液。若顏色變紅，且1個(gè)小時(shí)內(nèi)保持紅色不變，則表明發(fā)酵液中含有兒茶酚類鐵載體。

2結(jié)果與分析

streptomycesalbidoflavust4無細(xì)胞發(fā)酵濾液中的活性成分見表1及圖4、圖5氣相色譜分析結(jié)果。

表1streptomycesalbidoflavust4促生特性

由圖4和圖5可知，streptomycesalbidoflavust4次級代謝產(chǎn)物中含有吲哚乙酸。由表1可知，在streptomycesalbidoflavust4的次級代謝產(chǎn)物中，吲哚乙酸含量為20.26±0.4mg·l^-1，同時(shí)具有產(chǎn)鐵載體能力。

吲哚乙酸(iaa)是植物體中最為普遍的生長素類物質(zhì)，streptomycesalbidoflavust4產(chǎn)生這類植物激素，對根系生長作用顯著，能增強(qiáng)植物根系活力，使植物獲得充分的營養(yǎng)成分，促進(jìn)植物更好的生長。此外，iaa可提高植物光合作用效率。鐵載體對fe³⁺有極強(qiáng)的絡(luò)合能力，能捕獲fe³⁺并將其運(yùn)輸進(jìn)入植物細(xì)胞，為植物提供養(yǎng)分fe，促進(jìn)植物光合作用。

實(shí)施例3streptomycesalbidoflavust4殺線蟲作用測定

1.試驗(yàn)方法

1.1streptomycesalbidoflavust4發(fā)酵液制備：在無菌條件下，挑取平板上己經(jīng)活化好的streptomycesalbidoflavust4菌株單菌落轉(zhuǎn)接到高氏1號液體培養(yǎng)基上，30℃，120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)8天后取出，發(fā)酵液用離心法除去菌體，所得上清液用微孔濾膜(0.22μm)抽濾除菌，獲得無細(xì)胞發(fā)酵濾液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2秀麗隱桿線蟲懸液的制備：向長滿線蟲的培養(yǎng)皿注入5ml無菌水，搖晃30s后傾斜放置2min，收集富集在培養(yǎng)皿邊緣含有大量秀麗隱桿線蟲的無菌水于10ml離心管內(nèi)，振蕩器振蕩10秒，吸取1ml液體均勻涂布在方格計(jì)數(shù)板上，立體顯微鏡下計(jì)數(shù)。將線蟲懸液用m9溶液稀釋至5000條/ml。

1.3線蟲致死率測定：在96孔板內(nèi)進(jìn)行，每孔內(nèi)加入130μl放線菌streptomycesalbidoflavust4無細(xì)胞發(fā)酵濾液和20μl秀麗隱桿線蟲懸液，24h后在立體顯微鏡下觀察線蟲形態(tài)，蟲體僵直不動(dòng)視為死亡。統(tǒng)計(jì)各孔內(nèi)死亡線蟲數(shù)目，計(jì)算致死率，并以加130μl未接菌處理濾液(未接streptomycesalbidoflavust4的液體培養(yǎng)基經(jīng)與接菌處理同步離心、微孔濾膜抽濾所得濾液)和20μl秀麗隱桿線蟲懸液處理為對照進(jìn)行校正，計(jì)算校正致死率。致死率和校正致死率分別按照式(1)和式(2)進(jìn)行。以上致死率測定均重復(fù)8次。

校正致死率(％)＝t4致死率－培養(yǎng)液致死率(2)

2.結(jié)果與分析

由表2可知，streptomycesalbidoflavust4對秀麗隱桿線蟲24h致死率達(dá)到95.4％。

表2streptomycesalbidoflavust4在24h內(nèi)的殺線蟲活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。

實(shí)施例4streptomycesalbidoflavust4對病原真菌的抑制率測定

1.測定方法：

1.1無細(xì)胞發(fā)酵濾液制備：將t4以一定比例的接種量接種到裝有60ml高氏1號液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28℃、160r/min搖床振蕩培養(yǎng)8d，以不接放線菌高氏1號液體培養(yǎng)基為對照。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液先經(jīng)定性濾紙粗濾，所得濾液用微孔濾膜(0.22μm)抽濾除菌，得無細(xì)胞發(fā)酵濾液，置該濾液于滅菌容器中4℃保藏備用。

1.2相對抑菌率測定：采用生長速率法

含無細(xì)胞發(fā)酵濾液平皿制備：將t4無細(xì)胞發(fā)酵濾液與冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基按1：4體積比混合均勻倒平板，以不接菌的pda培養(yǎng)基(ck：振蕩培養(yǎng)8d的滅菌高氏1號液體培養(yǎng)基與pda培養(yǎng)基按1：4體積比混合)為對照，待培養(yǎng)基凝固后接種。

接種：將提前培養(yǎng)好的病原菌平皿用直徑為7mm滅菌打孔器打成菌餅，用竹簽挑取病原菌菌餅接種在含無細(xì)胞發(fā)酵濾液及對照平皿中央，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)皿，28℃正置培養(yǎng)4d，每隔24h測量1次菌落直徑(用十字交叉法測量，取平均值)，并據(jù)式(3)計(jì)算相對抑菌率。

2.結(jié)果與分析

從表3可知，streptomycesalbidoflavust4無細(xì)胞發(fā)酵濾液對農(nóng)作物土傳根系病害病原真菌尖孢鐮刀菌及腐皮鐮刀有較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌率分別為21.2％-25.2％及5.4％-10.1％，表明該菌的代謝產(chǎn)物除對線蟲有殺蟲作用外，對農(nóng)作物根腐病害病原菌也有一定抑制作用，對減輕根系病害有一定效果。

表3streptomycesalbidoflavust4對病原真菌腐皮鐮刀菌(f.solani.)和尖孢鐮刀菌(f.oxysporum)的相對抑菌率％

實(shí)施例5streptomycesalbidoflavust4對種子活力的影響測定

1.試驗(yàn)方法

分別用無菌水(ck)、t4無細(xì)胞發(fā)酵濾液原液以及稀釋10倍、100倍、500倍的發(fā)酵液浸泡番茄和玉米種子24h，根據(jù)科技文獻(xiàn)《對種子活力測定方法—ttc定量法的改進(jìn)》采用改良后的ttc法測定種子活力。

2.試驗(yàn)結(jié)果及分析

由表4可知，streptomycesalbidoflavust4處理番茄種子活力較對照增加113％，玉米種子活力較對照增加14.4％，與對照差異均顯著(p＜0.05)。即streptomycesalbidoflavust4發(fā)酵濾液可提高番茄、玉米種子活力。

表4streptomycesalbidoflavust4對番茄和玉米種子活力的影響

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。

實(shí)施例6streptomycesalbidoflavust4的促生防病效果測定

1.盆栽試驗(yàn)方法

1.1試驗(yàn)方案及實(shí)施

設(shè)2個(gè)處理：①ck：每盆裝20kg健康土壤(采自小麥田20cm耕層土壤，該土壤中無連作番茄根區(qū)大量存在的根結(jié)線蟲及其他病原菌)。②t4：每盆裝20kg健康土壤，再按1.0g/kg用量均勻拌入20gstreptomycesalbidoflavust4固態(tài)菌粉，充分混勻。試驗(yàn)于2016年5月至10月在楊凌金麒麟生物科技有限公司大棚內(nèi)進(jìn)行。在底部直徑×頂部直徑×高為10cm×20cm×14cm的小花盆內(nèi)育苗，按1.5kg/盆量裝入健康土壤，在其上覆蓋0.5kg病土(采自連作番茄根結(jié)線蟲嚴(yán)重侵染病株根區(qū)，該土壤中有大量根結(jié)線蟲及能引起根系病害的病原真菌)，將15粒番茄種子均勻播種在病土土層中，并覆蓋少量病土。待出苗后保留3株番茄幼苗，常規(guī)管理，生長45天后用鏟子小心將生長在病土上的植株連根鏟起，將根系上攜帶病土的植株移栽至25cm×35cm×40cm大花盆內(nèi)。試驗(yàn)于2016年5月5日播種，2016年10月5日收獲。每處理均重復(fù)8盆，3株/盆。

1.2番茄植株存活率調(diào)查

于收獲期統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理番茄植株存活率，存活率按照式(4)計(jì)算。

1.3番茄生物量測定

將整盆土傾倒于塑料薄膜上并使之分散，將植株從土壤中小心挖出，盡可能保持植株完整無損及根系上附著土壤不脫落，將植株置于無菌塑料袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，抖落并收集根上附著的土壤，用于根區(qū)土壤微生物分析；小心洗凈根系，拍照后用小刀將根系上的須根部分切下，用精度0.01g天平分別測定每株番茄根系上的須根(具有吸收水分養(yǎng)分功能)及所余畸形膨大根(無吸收能力)的鮮質(zhì)量。同步測定株高、莖粗及莖葉鮮質(zhì)量。

1.4番茄根系受病害程度測定

將根系按照其被根結(jié)線蟲侵染程度分為正常健康根系(未被根結(jié)線蟲侵染，形態(tài)上無膨大與畸變)、輕病根(須根上有少量根結(jié))和重病根(根結(jié)多且膨大畸變，幾乎無須根)，根系分類標(biāo)準(zhǔn)見圖6。將病根數(shù)占總根數(shù)的比例稱為根系發(fā)病率(％)。

1.5微生物區(qū)系分析

根區(qū)土壤樣品采集：將1.3中從番茄根系上抖落并收集到自封袋中的根系表面附著土壤稱為根區(qū)土壤。該土壤來自根系密集分布區(qū)，其中的微生物種類及數(shù)量與根系生物學(xué)及生理生化特性關(guān)系密切，能真實(shí)反映番茄收獲時(shí)根系表面及根系周圍土壤的微生物現(xiàn)狀。

微生物分離計(jì)數(shù)：采用稀釋平皿培養(yǎng)法進(jìn)行。細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂，真菌用pda，放線菌用高氏1號瓊脂。將優(yōu)勢細(xì)菌、真菌及放線菌純化后斜面保藏，用于進(jìn)一步鑒定。

1.6t4及根區(qū)土壤優(yōu)勢菌鑒定

優(yōu)勢菌指土壤微生物分離測數(shù)時(shí)平皿內(nèi)數(shù)量較多、在皿內(nèi)菌落總數(shù)中所占比例較高的微生物。挑取優(yōu)勢菌種的典型菌落，純化后采用rdna-its序列分析技術(shù)，參照科技文獻(xiàn)《rapididentificationoffungibysequencingtheits1andits2regionsusinganautomatedcapillaryelectrophoresissystem》中的方法鑒定優(yōu)勢真菌；采用16srrna序列分析技術(shù)，參照《放線菌系統(tǒng)學(xué)：原理、方法及實(shí)踐》中的方法進(jìn)行優(yōu)勢細(xì)菌、優(yōu)勢放線菌以及t4的鑒定。

將對照與處理的差異稱為菌劑效應(yīng)，用⊿ck/％表示，按式(5)計(jì)算；樣品中某種優(yōu)勢細(xì)菌占該樣品細(xì)菌總數(shù)的比例p(％)按式(6)計(jì)算；某種優(yōu)勢真菌與放線菌所占比例計(jì)算與細(xì)菌相同。采用duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析。

2.試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1streptomycesalbidoflavust4對番茄生長及發(fā)病率的影響

t4對番茄植株生長的影響情況如表5所示。由表5可知，t4處理番茄死亡率為0，較ck降低100％，株高較對照顯著增加9.6％(p＜0.05)。莖粗較ck增加20.0％(p＜0.05)。t4處理番茄莖葉鮮質(zhì)量較對照增加15.4％。

t4對番茄植株根系的發(fā)病率的影響結(jié)果如表6所示。由表6可知，t4處理番茄根系腐爛率較ck降低41％；發(fā)病率較ck降低45％；具有吸收功能的須根部分鮮質(zhì)量較ck顯著增加76％(p＜0.05)。

表5各處理番茄死亡率、株高、莖粗及鮮質(zhì)量(n＝24株)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。

表6各處理根系發(fā)病率、腐爛率及根系鮮質(zhì)量

2.2t4對番茄根區(qū)土壤微生物種類及數(shù)量的影響

從番茄根區(qū)土壤中共分離獲得7株優(yōu)勢菌，其中優(yōu)勢細(xì)菌3株，優(yōu)勢真菌3株，優(yōu)勢放線菌1株。采用16srrna和rdna-its序列分析技術(shù)分別對優(yōu)勢細(xì)菌、優(yōu)勢放線菌和優(yōu)勢真菌進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果見表7。

表7番茄根區(qū)土壤中的優(yōu)勢微生物

番茄根區(qū)優(yōu)勢菌數(shù)量及微生物總量見表8。

由表8可知，t4處理后番茄根區(qū)土壤中細(xì)菌總量較ck增加14％。其中，對番茄具有抗病促生作用的優(yōu)勢細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌較ck增加35％；植物根瘤菌臺(tái)灣貪銅菌較對照增加17％；短小芽孢桿菌較ck增加100％。

t4處理后番茄根區(qū)土壤中真菌總量較對照降低16％，差異均顯著(p＜0.05)。其中植物病原真菌尖孢鐮刀菌較ck顯著降低38％(p＜0.05)，石榴葉霉病病原菌數(shù)量較對照雖有增加，與對照無顯著差異。

由表8可知，t4處理后番茄根區(qū)土壤中放線菌總量較對照雖有減少，與對照無顯著差異；t4處理的根區(qū)土壤中出現(xiàn)了較多的有益優(yōu)勢放線菌灰色鏈霉菌。

由上述實(shí)施例6可知，向盆栽土壤中施入t4菌劑可使番茄死亡率大幅降低，并促進(jìn)番茄生長。t4菌劑拌土處理番茄株高及莖粗均顯著高于ck(p＜0.05)。另外，t4可減輕番茄根系被根結(jié)線蟲侵染程度，主要表現(xiàn)在根結(jié)病發(fā)病率較ck降低45％，根系腐爛率較ck降低41％。

表8番茄根區(qū)優(yōu)勢菌數(shù)量及微生物總量

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05).

大量研究表明，土壤發(fā)生“真菌化”是土壤質(zhì)量下降的一個(gè)重要標(biāo)志，而番茄連作栽培使根區(qū)土壤細(xì)菌/真菌數(shù)量比例顯著降低。本發(fā)明實(shí)施例5發(fā)現(xiàn)，t4使番茄根區(qū)土壤中細(xì)菌總量增加，真菌總量顯著降低(p＜0.05)。由此可見，t4可抑制連作番茄根區(qū)土壤“真菌化”，防止土壤質(zhì)量下降。解淀粉芽孢桿菌能抑制植物病原真菌，對番茄具有抗病促生作用，t4處理使根區(qū)土壤中解淀粉芽孢桿菌數(shù)量較ck增加。短小芽孢桿菌對番茄種子萌發(fā)、根系生長及幼苗的株高和株重具有明顯的促進(jìn)作用，并可誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生抗病性，t4處理后短小芽孢桿菌較ck增加100％?；疑溍咕僧a(chǎn)生殺蟲抗生素-纈氨霉素，而灰色鏈霉菌僅在t4處理后的根區(qū)土壤中作為優(yōu)勢菌被檢出。尖孢鐮刀菌是世界性分布的土傳病原真菌，能引發(fā)植物嚴(yán)重的枯萎病，t4使該植物病原菌數(shù)量較ck顯著降低。綜上所述，t4可促進(jìn)番茄根區(qū)土壤中有益菌生長，并抑制植物病原菌生長。

綜上，本發(fā)明提供的微白黃鏈霉t4對番茄具有抗病促生作用，由上述各實(shí)施例試驗(yàn)結(jié)果可知，微白黃鏈霉t4可能通過產(chǎn)生吲哚乙酸和鐵載體提高番茄種子活力、促進(jìn)番茄生長，產(chǎn)生具有殺線活性的化合物，從而降低番茄根系根結(jié)線蟲病發(fā)病率及病根腐爛率，改變并優(yōu)化番茄根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提高土壤質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)對番茄的抗病促生作用。

雖然，本說明書中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

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<110>陜西博秦生物工程有限公司

<120>一株微白黃鏈霉菌及其應(yīng)用

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