本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母菌株及其在發(fā)酵生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

s-腺苷蛋氨酸（s-adenosyl-methionine，簡(jiǎn)寫為sam）,是生物體內(nèi)廣泛存在的重要代謝中間體，也是蛋氨酸(methionine，met)的活化形式，它于1952年由cantoni發(fā)現(xiàn)。在生物學(xué)上，s-腺苷蛋氨酸是重要的甲基供體，具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基和轉(zhuǎn)氨丙基三方面的作用。在臨床上,s-腺苷蛋氨酸在70年代末在歐洲作為治療關(guān)節(jié)炎的抗炎止痛藥,80年代中期在歐洲作為抗抑郁癥的精神病藥物,90年代在美國(guó)作為抗抑郁、保肝等的非處方藥和營(yíng)養(yǎng)保健品，近年來則用來治療各種急、慢性肝病。s-腺苷蛋氨酸對(duì)于原發(fā)纖維性肌痛、偏頭痛、阿爾茨海默、癲癇、老年性癡呆等以及增加不育男性的精子活力，治療多發(fā)性硬化、帕金森氏病、亞急性脊髓變性、睡眠紊亂、心臟病、腦缺血以及hiv引起的神經(jīng)性并發(fā)癥等多種疾病。

s-腺苷蛋氨酸的制備方法始于20世紀(jì)50年代，主要的制備方法有化學(xué)合成法、酶促合成法和微生物發(fā)酵法。相比化學(xué)法成本高、產(chǎn)率不高、純度低、穩(wěn)定性差、污染環(huán)境；酶法催化效率很低、atp原料成本比較高、酶活限制等問題；微生物發(fā)酵法具有成本低廉、產(chǎn)物純度高且活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，因此生物法制備s-腺苷蛋氨酸是近年來工業(yè)生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的主要途徑。目前生物法合成s-腺苷蛋氨酸的主要菌種包括：霉菌（molds）、細(xì)菌、假絲酵母（candidaalbicans）、清酒酵母(saccharomycessake)、糖酵母(saccharomyces)、畢赤酵母（pichiapastoris）、釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）、乳酸克魯維酵母（scheffersomycesstipitis）、馬克斯克魯維酵母（kluyveromycesmarxianus）、谷氨酸棒桿菌（corynebacteriumglutamicum）和大腸桿菌（escherichiacoli）等,其中釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）生長(zhǎng)繁殖快、代期短，生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候和地區(qū)的限制；與其他微生物相比，具有易于收集，代謝方式多樣性，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)和人們易于接受等特性，所以釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）是目前研究發(fā)現(xiàn)的生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的重要工業(yè)菌種之一。但是原始釀酒酵母菌株在發(fā)酵生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的過程中，對(duì)溫度以及ph的控制要求較嚴(yán)格，嚴(yán)重影響了s-腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量，為s-腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)條件控制增加了很大的負(fù)擔(dān)。

目前，現(xiàn)有技術(shù)中，釀酒酵母生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的主要研究有：高產(chǎn)sam菌株的理性化篩選育種、微生物發(fā)酵過程優(yōu)化以及代謝工程改造3個(gè)方向。迄今為止，國(guó)內(nèi)報(bào)道的s-腺苷蛋氨酸生產(chǎn)采用的菌株也是釀酒酵母菌株，在30ml發(fā)酵液/500ml搖瓶中產(chǎn)量最高為0.83g/l，它在7l發(fā)酵罐中培養(yǎng)的產(chǎn)量最高為17.1g/l，在發(fā)酵過程中不僅要對(duì)ph進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控：在發(fā)酵前期控制ph5.4為有利于菌體的生長(zhǎng)、在發(fā)酵后期控制ph5.1為有利于s-腺苷蛋氨酸的穩(wěn)定性，在發(fā)酵中期期在補(bǔ)加葡萄糖、氮源營(yíng)養(yǎng)鹽母液以及發(fā)酵后期額再次補(bǔ)加10g/l的三磷酸腺苷二鈉溶液，它的發(fā)酵周期為66h。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

發(fā)明人通過低能離子束注入技術(shù)，對(duì)土壤中篩選出能夠在l-蛋氨酸的誘導(dǎo)下得到產(chǎn)物s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）進(jìn)行誘變，經(jīng)三輪篩選得到一株釀酒酵母，其好氧下可高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸。該菌株，其分類命名為釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620，目前該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱cgmcc），保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，登記入冊(cè)的編號(hào)是cgmccno.13760，保藏日期是2017年3月20日。

釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620菌株具有下述性質(zhì)：

1、菌落形態(tài)學(xué)特征：在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30℃劃線培養(yǎng)呈中度生長(zhǎng)，菌苔線狀，24h為乳白色,菌落為圓形,邊緣整齊，48h后稍呈白色，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顏色稍增白。表面濕潤(rùn)、光滑，有光澤，有黏性，菌落不透明。

2、生理與生化特征：

a.培養(yǎng)溫度：20～40℃，最適溫度為30℃；

b.在ph3.0～7.5范圍內(nèi)生長(zhǎng)；

c.色素產(chǎn)生情況：不產(chǎn)生色素；

3、營(yíng)養(yǎng)特征：

釀酒酵母菌株可在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉。該培養(yǎng)基碳源一般為葡萄糖或酸化處理后的糖蜜，氮源可選用玉米漿干粉、麥芽汁浸粉、酵母膏、(nh4)2hpo4以及(nh4)2so4等，培養(yǎng)基中還包括鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、磷酸鹽和檸檬酸鹽等常用的無機(jī)鹽類，根據(jù)不同的氮源而定，以硫酸銨或玉米漿干粉為唯一氮源時(shí)需全添加，在以玉米漿干粉、麥芽汁浸粉時(shí)可以少量或不加入無機(jī)鹽。

利用上述高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母菌生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的方法，將釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620的菌株活化后，在20～45℃下好氧發(fā)酵48～96h；

其中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基：碳源20～100g/l，氮源20～60g/l，無機(jī)鹽10～30g/l，其余為水，ph3.0～7.5。

其中，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜中的至少一種。

其中，所述的氮源為玉米漿干粉、麥芽汁浸粉、酵母膏或者(nh4)2so4中的至少一種。

其中，所述的無機(jī)鹽為鉀鹽、錳鹽、鐵鹽、鎂鹽、鋅鹽、銅鹽、鈷鹽、鈣鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽的任意一種或幾種的組合。

最優(yōu)選的生產(chǎn)方式為：將釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）ty-93620的菌株活化后，在30℃下好氧發(fā)酵在30℃下好氧發(fā)酵84～96h，裝液量為30ml發(fā)酵液/500ml三角瓶，轉(zhuǎn)速為200rpm。

其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖37.5g/l，玉米漿45g/l，麥芽浸粉15g/l，k2hpo4?3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4?7h2o3.75g/l，初始ph5.0。

或者優(yōu)選為：將釀酒酵母ty-93620的菌株活化后，在30℃下好氧發(fā)酵48～72h，轉(zhuǎn)速為800rpm；

其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖60g/l，玉米漿10g/l，麥芽浸粉5g/l，酵母粉15g/l，酸化處理后的糖蜜40g/l，k2hpo4?3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4?7h2o3.75g/l，feso4?7h2o10mg/l，(nh4)2hpo45g/l，初始ph5.0。

有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì)：

（1）與化學(xué)法及酶法催化相比，低成本，低能耗，無污染，使用粗原料等非化石資源作為原料，無需使用atp作為催化誘導(dǎo)劑，產(chǎn)量高，穩(wěn)定性強(qiáng)，過程清晰簡(jiǎn)單易操控。

（2）與原始菌相比，發(fā)酵產(chǎn)物種類少，純度高，穩(wěn)定性好，產(chǎn)量明顯增高；且培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單易控，耐高溫、低ph耐受性強(qiáng)。

附圖說明

圖1本發(fā)明菌株cgmccno.13760好氧發(fā)酵終點(diǎn)的高效液相色譜腺苷蛋氨酸檢測(cè)圖譜;其中，標(biāo)號(hào)1的峰為s-腺苷蛋氨酸的響應(yīng)峰。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1

發(fā)明人通過低能離子束注入技術(shù)，對(duì)土壤中篩選得到的能夠在l-蛋氨酸的誘導(dǎo)下得到產(chǎn)物s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）；在30℃條件下，將篩選得到的釀酒酵母接種到y(tǒng)pd培養(yǎng)液中培養(yǎng)4h，離心去上清，加入適量的生理鹽水制成釀酒酵母菌懸液均勻涂布于無菌平皿上；用低能離子束對(duì)菌懸液進(jìn)行脈沖注入；把經(jīng)誘變處理后的菌懸液稀釋后，涂布于ypd固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；選取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)三輪篩選選取遺傳性狀穩(wěn)定的能夠高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母菌株，即得到高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母菌株。

實(shí)施例2

平板培養(yǎng)基：蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l，ph自然。

好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖37.5g/l，玉米漿45g/l，麥芽浸粉15g/l，k2hpo4?3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4?7h2o3.75g/l，初始ph5.0。500ml三角瓶裝液量30ml，121℃滅菌15分鐘。

分別將初始菌株及cgmccno.13760菌首先于30℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入裝液量為30ml發(fā)酵液/500ml三角瓶，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm。待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期后（即發(fā)酵48h），向發(fā)酵液中投加d/l一蛋氨酸0.1g。發(fā)酵30h后cgmccno.13760的發(fā)酵液中含有2.95g/ls-腺苷蛋氨酸。較初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量提高了7.25倍。

實(shí)施例3

平板培養(yǎng)基：同實(shí)施例1；

好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g/l，玉米漿10g/l，麥芽浸粉5g/l，酵母粉15g/l，酸化處理后的糖蜜40g/l，k2hpo4?3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4?7h2o3.75g/l，feso4?7h2o10mg/l，(nh4)2hpo45g/l，初始ph5.0。7l發(fā)酵罐裝液量3l，121℃滅菌15分鐘。

分別將初始菌株及cgmccno.13760菌首先于30℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照10%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入3l發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣2v/vm，轉(zhuǎn)速800rpm，30℃培養(yǎng)。發(fā)酵至16h后，開始補(bǔ)加葡萄糖，將葡萄糖的濃度控制為10-15g/l。待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期后（即發(fā)酵36h），向發(fā)酵液中投加d/l一蛋氨酸10g。發(fā)酵48h后cgmccno.13760的發(fā)酵液中含有25.66g/ls-腺苷蛋氨酸。較初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量提高了35倍。

實(shí)施例4

平板培養(yǎng)基：同實(shí)施例1；

好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g/l，酸化處理后的糖蜜40g/l，k2hpo4?3h2o1.6g/l，kh2po41.25g/l，mgso4?7h2o3.75g/l，feso4?7h2o10mg/l，(nh4)2hpo45g/l，初始ph5.0。7l發(fā)酵罐裝液量3l，121℃滅菌15分鐘。

所述糖蜜的酸化處理方法為：糖蜜按照質(zhì)量比稀釋10倍，用濃硫酸調(diào)節(jié)ph為2.0，100℃條件下保溫30min，到達(dá)時(shí)間后自然冷卻，冷卻后過濾備用。

分別將初始菌株及cgmccno.13760菌首先于45℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，45℃，200rpm培養(yǎng)16h，然后按照10%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入3l發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣2v/vm，轉(zhuǎn)速800rpm，45℃培養(yǎng)。發(fā)酵至16h后，開始補(bǔ)加葡萄糖，將葡萄糖的濃度控制為10-15g/l。待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期后（即發(fā)酵42h），向發(fā)酵液中投加d/l一蛋氨酸10g。發(fā)酵54h后cgmccno.13760的發(fā)酵液中含有18.96g/ls-腺苷蛋氨酸。較初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量提高了25.9倍。

實(shí)施例5

平板培養(yǎng)基：同實(shí)施例1；

好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40g/l，玉米漿干粉10g/l，初始ph5.0。7l發(fā)酵罐裝液量3l，121℃滅菌15分鐘。

分別將初始菌株及cgmccno.13760菌首先于30℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照10%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入3l發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣2v/vm，轉(zhuǎn)速800rpm，30℃培養(yǎng)。發(fā)酵至16h后，開始補(bǔ)加葡萄糖，將葡萄糖的濃度控制為10-15g/l。待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期后（即發(fā)酵36h），向發(fā)酵液中投加d/l一蛋氨酸10g。發(fā)酵48h后cgmccno.13760的發(fā)酵液中含有19.63g/ls-腺苷蛋氨酸。較初始菌株相比，s-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量提高了26.8倍。

其中，s-腺苷蛋氨酸的檢測(cè)方法：取體積比為1:9的發(fā)酵液與1.5mol/l高氯酸混合溶液，向其中加入10g直徑為3mm的玻璃珠，采用漩渦振蕩混勻器轉(zhuǎn)振蕩破碎30s，取1ml得到的液體采用臺(tái)式離心機(jī)10000r/min離心1min，采用0.22μm的水系濾頭進(jìn)行過濾；最后采用c18在流動(dòng)相為0.01mol/l的甲酸銨溶液（用甲酸調(diào)ph至3.0），檢測(cè)溫度為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速為1ml/min的條件下進(jìn)行檢測(cè)。