一種北冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種北冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冬蟲(chóng)夏草是麥角菌科真菌，首載于本草從新，味甘，性溫，歸肺，腎經(jīng)，具有具有多種生理活性，如補(bǔ)虛損、益精氣、保肺、益腎、止血化痰、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗氧化、提高免疫力等，因此，常用來(lái)治療勞咳痰血、盜汗、陽(yáng)痿、遺精、黃膽病、肺結(jié)核及老年衰弱、慢性咳喘等癥，為我國(guó)名貴中藥材之一。
[0003]蟲(chóng)草素(cordyc印in)又稱蟲(chóng)草菌素、蛹蟲(chóng)草菌素、3 '-脫氧腺苷(3-deoxyadenosine)，是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類抗菌素。早在1950年，國(guó)外學(xué)者Cunningham et al.觀察到被蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris寄生的昆蟲(chóng)組織不易腐爛，進(jìn)而從中分離出一種抗菌性物質(zhì)，定名為蟲(chóng)草素，之后許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證研究(Kaczkaet al.1964b ；Frederiksen et al.1965)。蟲(chóng)草素分子式為 ClOH 13 N503，王成明等國(guó)內(nèi)這者于2009報(bào)道蟲(chóng)草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等藥理作用，目前，已經(jīng)出現(xiàn)以蟲(chóng)草素為主要成分的新藥應(yīng)用于白血病的治療，它在臨床上有著良好的應(yīng)用前景。目前已報(bào)道的蟲(chóng)草素產(chǎn)生菌主要是蟲(chóng)草屬的一些種類及其上分離得到的菌株，而天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中基本不含蟲(chóng)草素，發(fā)酵菌絲體中卻含有極低含量的蟲(chóng)草素。北冬蟲(chóng)夏草是主要產(chǎn)蟲(chóng)草素的菌株，研究表明，其深層發(fā)酵液中含有大量蟲(chóng)草素，因此，對(duì)北冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵液中的蟲(chóng)草素進(jìn)行有效分離、純化顯得十分重要。離子交換樹(shù)脂吸附法、反相高效液相色譜法等是目前蟲(chóng)草素主要的分離純化方法，但前者需要用酸堿處理，后期處理比較復(fù)雜，其他方法蟲(chóng)草素提取率低，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。為此，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)便、蟲(chóng)草素得率高的大孔吸附樹(shù)脂分離純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提供一種北冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的提取方法，操作簡(jiǎn)便，蟲(chóng)草素得率高。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種北冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的提取方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理:將保藏好的北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體5-10g經(jīng)清水沖洗，加入乙醚脫脂，再加清水反復(fù)沖洗，烘干備用；
(2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，蛋白胨l-2g，麥麩2-4g，KH2PO4 2-4g, MgSO4 l-2g, Vitamin B1 2_4g，Vitamin B2 3_6g，培養(yǎng)基中加入蒸餾水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌，倒在平板上；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(2)中制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液，經(jīng)0.45um微孔濾膜過(guò)濾，取樣品濾液備用； (4)樹(shù)脂的預(yù)處理:將NKA-1I型大孔樹(shù)脂采用乙醇浸泡，除去上浮的樹(shù)脂碎片，反復(fù)浸泡3-5次，至洗滌液3倍體積水無(wú)白色渾濁為止，最后用蒸餾水淋洗直至無(wú)乙醇味；
(5)稱取步驟(4)中預(yù)處理好的NKA-1I型大孔樹(shù)脂2-5g，加入10_20ml步驟(3)中制備好的樣品濾液，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)3-6h，將吸附后的樹(shù)脂采用清水洗滌3-5次，采用乙醇洗脫，對(duì)洗脫液在259nm處測(cè)定吸光度值，進(jìn)行蟲(chóng)草素含量的測(cè)定。
[0006]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的烘干溫度均為50_80°C。
[0007]優(yōu)選的，步驟(2)中加蒸餾水的量是按料水比(1-3): (1.5-5)的體積加入的。
[0008]優(yōu)選的，步驟(2)中調(diào)節(jié)PH為調(diào)節(jié)PH至6.5-7.2。
[0009]優(yōu)選的，步驟(2)中所述的高壓蒸汽滅菌時(shí)間為10_20min。
[0010]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的培養(yǎng)溫度為25_28°C，培養(yǎng)為無(wú)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為5-7do
[0011 ] 優(yōu)選的，步驟(4)中所述的乙醇的濃度為90-95%，采用乙醇浸泡的時(shí)間為每次12-24ho
[0012]優(yōu)選的，步驟(5)中的搖床培養(yǎng)速度為100_120r/min。
[0013]優(yōu)選的，步驟(5)中所述的乙醇的濃度為40-50%。
[0014]優(yōu)選的，步驟(5)中所述的乙醇的加入量為NKA-1I型大孔樹(shù)脂體積的4-6倍，采用乙醇洗脫的時(shí)間為60-120min。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果體現(xiàn)在:
1.本發(fā)明中將蛋白胨作為固態(tài)培養(yǎng)基的氮源，可提高蟲(chóng)草菌絲體及其主要有效成分的含量；本發(fā)明對(duì)固態(tài)培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了嚴(yán)格優(yōu)化，對(duì)固態(tài)培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)溫度、料水比及光照等培養(yǎng)條件也進(jìn)行了嚴(yán)格控制，對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體生長(zhǎng)更有利，可明顯提高菌絲體中的主要有效成分之一麥留醇的含量。
[0016]2.本發(fā)明在對(duì)北冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行深層發(fā)酵時(shí)，先采用清水沖洗，再采用乙醚脫脂，再采用清水沖洗，可有效去除樣品中有關(guān)雜質(zhì)對(duì)后續(xù)蟲(chóng)草素的提取。
[0017]3.研究顯示，NKA-1I型樹(shù)脂對(duì)蟲(chóng)草素的吸附能力最強(qiáng)，為此，本發(fā)明選擇NKA-1I型樹(shù)脂作為蟲(chóng)草素的吸附載體；另外，蟲(chóng)草素在NKA-1I型樹(shù)脂上靜態(tài)吸附時(shí)間達(dá)到3h后，蟲(chóng)草吸附率可達(dá)90%或以上，在吸附6h時(shí)，吸附率可達(dá)95%或以上，因此，本發(fā)明將NKA-1I型樹(shù)脂吸附時(shí)間限定為3-6h，可最大限度的吸附發(fā)酵液中的蟲(chóng)草素。
[0018]4.在對(duì)吸附有蟲(chóng)草素的NKA-1I型樹(shù)脂進(jìn)行解吸時(shí)，體積分?jǐn)?shù)為50%左右的乙醇解吸率可達(dá)90%以上，而體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇解吸率也為90%以上，為此，本發(fā)明選擇體積分?jǐn)?shù)為40-50%的乙醇作為洗脫劑進(jìn)行解吸，不僅不會(huì)對(duì)蟲(chóng)草素的解吸產(chǎn)生影響，而且節(jié)省了成本；另外，加入的乙醇洗脫劑的體積為NKA-1I型樹(shù)脂的4-6倍，可人使蟲(chóng)草素解吸率達(dá)90%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
實(shí)施例1
一種北冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的提取方法，包括以下步驟:
(I)樣品前處理:將保藏好的北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體5g經(jīng)清水沖洗，加入乙醚脫脂，再加清水反復(fù)沖洗，在50°C下烘干備用；
(2)配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:取葡萄糖2g，玉米粉2g，蛋白胨lg，麥麩2g，KH2PO42g, MgSO4 lg, Vitamin B1 2g，Vitamin B2 3g，培養(yǎng)基中加入蒸饋水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)PH至6.5，趁熱倒入容器中，高壓蒸汽滅菌lOmin，倒在平板上；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(I)中經(jīng)樣品前處理后的樣品接種到步驟(2)中制備好的培養(yǎng)基中，在25°C下無(wú)光照培養(yǎng)5d，培養(yǎng)完成后取菌種發(fā)酵液，經(jīng)0.45um微孔濾膜過(guò)濾，取樣品濾液備用；
(4)樹(shù)脂的預(yù)處理:將NKA-1I型大孔樹(shù)脂采用90%的乙醇浸泡12h，除去上浮的樹(shù)脂碎片，反復(fù)浸泡3次，至洗滌液3倍體積水無(wú)白色渾濁為止，最后用蒸餾水淋洗直至無(wú)乙醇味；
(5)稱取步驟(4)中預(yù)處理好的NKA-1I型大孔樹(shù)脂2-5g，加入10_20ml步驟(3)中制備好的樣品濾液，以lOOr/min速度進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)3h，將吸附后的樹(shù)脂采用清水洗滌3次，采用NKA-1I型大孔樹(shù)脂體積4倍的40%的乙醇洗脫60min，