本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母保護(hù)劑的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：膜醭畢赤酵母(pichiamembranifaciens)是一種能夠有效控制果蔬采后病害的酵母菌，國(guó)內(nèi)外大量研究表明，該酵母能夠防治柑橘、蘋果、桃、枇杷、櫻桃、楊梅等水果采后的主要病害。然而關(guān)于膜醭畢赤酵母在采后領(lǐng)域的商業(yè)化應(yīng)用研究卻較少。真空冷凍干燥是一種在研究和工業(yè)中廣泛應(yīng)用的保種技術(shù)。在食品領(lǐng)域中，常用該技術(shù)生產(chǎn)微生物固態(tài)制劑，例如發(fā)酵劑、益生菌劑、生防制劑等。真空冷凍干燥技術(shù)能夠很好的滿足微生物商業(yè)化的要求，但在凍干過(guò)程中，微生物的存活率、功能性活力例如生防效力、產(chǎn)酸能力等會(huì)受到影響，尤其是凍干后微生物較低的存活率，是限制其商業(yè)化應(yīng)用的首要因素。大量研究表明，凍干過(guò)程中的每一步幾乎都會(huì)影響微生物的存活率，包括微生物菌種、微生物培養(yǎng)條件、冷凍溫度、干燥壓力、貯藏和復(fù)水的條件等，而凍干前在微生物懸浮液中添加合適的保護(hù)劑是提高其存活率的有效手段。糖類、蛋白質(zhì)類、抗氧化類試劑是常用且能夠有效提高微生物存活率的幾類保護(hù)劑，而在真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母的應(yīng)用中卻未見(jiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種提高真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母存活率的保護(hù)劑復(fù)配方案；本發(fā)明的目的之二在于提供凍干膜醭畢赤酵母在柑橘果實(shí)保鮮中的應(yīng)用，即使用上述復(fù)配保護(hù)劑方案進(jìn)行凍干酵母。附圖說(shuō)明圖1a、圖1b和圖1c分別為是不同濃度的糖醇類保護(hù)劑、抗氧化類保護(hù)劑、脫脂奶粉對(duì)凍干膜醭畢赤酵母存活率的影響的曲線圖。圖2a和圖2b、圖2c和圖2d、圖2e和圖2f分別為蔗糖和谷氨酸鈉、蔗糖和脫脂奶粉、谷氨酸鈉和脫脂奶粉對(duì)凍干膜醭畢赤酵母存活率交互影響的響應(yīng)面和等高線圖。圖3a和圖3b、圖3c和圖3d、圖3e和圖3f分別為蔗糖和谷氨酸鈉、蔗糖和脫脂奶粉、谷氨酸鈉和脫脂奶粉對(duì)凍干膜醭畢赤酵母存活率交互影響的響應(yīng)面和等高線圖。圖4a和圖4b、圖4c和圖4d、圖4e和圖4f分別為凍干膜醭畢赤酵母對(duì)柑橘采后綠霉病、青霉病、炭疽病的控制效果柱形圖。其中，w代表無(wú)菌水；fy代表新鮮酵母(1×108cfuml-1)；fdy代表用無(wú)菌水復(fù)水的凍干酵母(1×108cfuml-1)；p代表最優(yōu)保護(hù)劑配方。具體實(shí)施方式一、酵母及酵母懸浮液的制備膜醭畢赤酵母購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。該酵母在nyda培養(yǎng)基(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，瓊脂20g，水1000ml)中、4℃條件下保藏。每?jī)蓚€(gè)月活化一次。進(jìn)行凍干試驗(yàn)前，膜醭畢赤酵母首先接種到新鮮的nyda培養(yǎng)基上，在28℃條件下活化48h，再將活化好的酵母接種到nydb(不加瓊脂的nyda)培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm條件下培養(yǎng)24h，之后在1351×g、4℃條件下離心10min，棄上清液，加入無(wú)菌水，再次離心(進(jìn)行兩次，以保證培養(yǎng)基無(wú)殘留)，加入無(wú)菌水，用血球計(jì)數(shù)板制成2×108cfu/ml酵母懸浮液。二、保護(hù)劑及保護(hù)劑懸浮液的制備試驗(yàn)中所使用的保護(hù)劑包括：蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖醇、谷氨酸鈉、抗壞血酸、脫脂奶粉。所有保護(hù)劑按比例溶解到無(wú)菌水中以制備保護(hù)劑懸浮液，使得最后與酵母懸浮液混合后濃度如試驗(yàn)方案中所示。具體保護(hù)劑試驗(yàn)方案如下：1、保護(hù)劑的單因素試驗(yàn)(1)對(duì)照：無(wú)菌水(2)1％、5％、10％、15％、20％、25％蔗糖(3)1％、5％、10％、15％、20％、25％乳糖(4)1％、5％、10％、15％、20％、25％半乳糖(5)1％、5％、10％、15％、20％、25％葡萄糖(6)1％、5％、10％、15％、20％、25％山梨糖醇(7)0.1％、1％、3％、4％、5％、6％、7％谷氨酸鈉(8)0.1％、1％、3％、4％、5％、6％、7％抗壞血酸(9)1％、5％、10％、15％、20％、25％脫脂奶粉2、保護(hù)劑的正交試驗(yàn)基于保護(hù)劑單因素的試驗(yàn)結(jié)果，使用蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉進(jìn)行三因素四水平的正交試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。3、保護(hù)劑的第一次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)基于保護(hù)劑正交試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，繼續(xù)使用蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉進(jìn)行三元二次正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方案見(jiàn)表6。4、保護(hù)劑的第二次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)基于保護(hù)劑第一次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，改變保護(hù)劑濃度，繼續(xù)使用蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉進(jìn)行三元二次正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方案見(jiàn)表9。三、樣品的制備及真空冷凍干燥保護(hù)劑懸浮液與酵母懸浮液等體積混合得到樣品。樣品在漩渦振蕩儀中均勻混合1min，之后在室溫下靜置60min。分裝1ml的樣品在10ml的燒杯中，在-20℃條件下冷凍12h，之后在冷阱溫度為-50℃、真空度為1–10pa條件下凍干24h。試驗(yàn)重復(fù)三次。四、酵母存活率的測(cè)定酵母存活率用凍干前酵母的菌落總數(shù)(n0)以及凍干后酵母的菌落總數(shù)(nf)來(lái)表示。凍干前，稀釋到合適濃度的酵母涂布在nyda平板上。凍干后，每個(gè)凍干樣品用4ml的無(wú)菌水溶解，用漩渦振蕩儀均勻混合1min，再在室溫下靜置60min，稀釋到合適的濃度，涂布在nyda平板上。上述平板均在28℃條件下培養(yǎng)48h。試驗(yàn)重復(fù)三次，用如下公式計(jì)算存活率：存活率＝(nf/n0)×100％五、凍干膜醭畢赤酵母在柑橘果實(shí)上的應(yīng)用試驗(yàn)所采用柑橘品種為北碚447#錦橙(citrussinensicosbeck.cv.jincheng447#)，采自重慶市北碚區(qū)。挑選新鮮無(wú)機(jī)械傷、大小均一、成熟度一致的果實(shí)作為試驗(yàn)材料。使用前，將挑選好的果實(shí)用2％的次氯酸鈉溶液浸泡2min，用清水沖洗，在室溫下(20℃)下晾干。青霉菌(penicilliumitalicum)、綠霉菌(penicilliumdigitatum)和炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。上述病原菌分別在pda培養(yǎng)基(土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，水1000ml)中、在4℃條件下保藏。每?jī)蓚€(gè)月活化一次。凍干試驗(yàn)前，病原菌分別接種到新鮮的pda培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)10d(此過(guò)程連續(xù)進(jìn)行兩次)，用無(wú)菌水將孢子洗下，四層紗布過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用無(wú)菌水稀釋至所需濃度(1×104sporesml-1)。為確定凍干膜醭畢赤酵母在柑橘果實(shí)上的生防效果，進(jìn)行如下試驗(yàn)：用消毒后的打孔器在果實(shí)赤道部位等距離打孔2個(gè)(深4mm，直徑6mm)，每個(gè)孔用微量移液器注入30μl如下處理液：無(wú)菌水、新鮮酵母(1×108cfuml-1)、用無(wú)菌水復(fù)水的凍干酵母(1×108cfuml-1)，最優(yōu)保護(hù)劑配方。4h后，再次分別注入20μl、1×104sporesml-1的青霉菌，綠霉菌以及炭疽菌，待菌液吸收后，單果包裝，在溫度20℃、相對(duì)濕度85％～95％的環(huán)境下貯藏。每天記錄果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。每組處理3個(gè)果實(shí)，重復(fù)三次。研究結(jié)果：一、真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母保護(hù)劑的優(yōu)化1、保護(hù)劑的單因素試驗(yàn)從圖1可看出，在糖醇類保護(hù)劑中，15％的蔗糖效果最佳，存活率為59.64％。在抗氧化類保護(hù)劑中，5％的谷氨酸鈉效果最佳，存活率為20.95％。15％的脫脂奶粉效果最佳，存活率為33.9％。2、保護(hù)劑的正交試驗(yàn)表1真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母保護(hù)劑復(fù)配試驗(yàn)方案l16(45)及結(jié)果表2正交試驗(yàn)方差分析表變異來(lái)源ssdfmsff0.05f0.01區(qū)組間13.4426.720.51a3494.6331164.8888.052.924.51b1911.573637.1948.16c1947.973649.3249.08模型誤差(e1)1059.46176.5713.352.423.47模型誤差(e2)396.913013.23總變異8823.9247表3a因素各水平均值多重比較結(jié)果(ssr法)表4b因素各水平均值多重比較結(jié)果(ssr法)表5c因素各水平均值多重比較結(jié)果(ssr法)從表2可看出，蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉對(duì)凍干酵母存活率的效果均極顯著，說(shuō)明所選用的三種保護(hù)劑是有效的，但是模型誤差也是極顯著的，說(shuō)明此模型不適合該試驗(yàn)。通過(guò)表3-5，確定的最佳保護(hù)劑配比為5％蔗糖、3％谷氨酸鈉和10％脫脂奶粉，三種保護(hù)劑的濃度均處在所設(shè)濃度的最低水平上?；谝陨蟽牲c(diǎn)，擴(kuò)大各保護(hù)劑濃度范圍，進(jìn)行三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)。3、保護(hù)劑的第一次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)表6三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)編碼表表7三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)果表8三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方差分析從表8可看出，模型是極顯著的，失擬是不顯著的，故該模型有效，蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉的效果是顯著的，蔗糖和谷氨酸鈉的交互作用是不顯著的，蔗糖和脫脂奶粉、谷氨酸鈉和脫脂奶粉的交互作用是顯著的，圖2所示符合方差分析結(jié)果。通過(guò)designexpert軟件分析結(jié)果得出最佳保護(hù)劑配比為5％蔗糖、4％谷氨酸鈉和5％脫脂奶粉，存活率可達(dá)到72.83％。因試驗(yàn)所得最佳保護(hù)劑配比中，蔗糖和脫脂奶粉都處在所設(shè)濃度的最低水平上，故調(diào)整濃度范圍再次進(jìn)行三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)。4、保護(hù)劑的第二次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)表9三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)編碼表表10三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)果表11三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方差分析從表11可看出，模型是極顯著的，失擬是不顯著的，故該模型有效，蔗糖、谷氨酸鈉的效果是顯著的，脫脂奶粉的效果是不顯著的，谷氨酸鈉和脫脂奶粉的交互作用是不顯著的，蔗糖和谷氨酸鈉、蔗糖和脫脂奶粉的交互作用是顯著的，圖3所示符合方差分析結(jié)果。通過(guò)designexpert軟件分析結(jié)果得出最佳保護(hù)劑配比為6.04％蔗糖、3.41％谷氨酸鈉和5.34％脫脂奶粉，存活率可達(dá)到74.24％。使用該保護(hù)劑配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到凍干酵母的存活率為76.80％±4.27％(n＝3)。綜上得出，真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母的保護(hù)劑最佳復(fù)配方案為6.04％蔗糖、3.41％谷氨酸鈉和5.34％脫脂奶粉。二、凍干酵母在柑橘果實(shí)上的應(yīng)用從圖4可看出，與無(wú)菌水相比，新鮮酵母和凍干酵母均能夠顯著降低柑橘果實(shí)青綠霉病、炭疽病的發(fā)病率和病斑直徑。凍干酵母與新鮮酵母相比沒(méi)有顯著性差異。最優(yōu)保護(hù)劑配方對(duì)柑橘果實(shí)的青綠霉病、炭疽病沒(méi)有防治效果。綜上，試驗(yàn)所得真空冷凍干燥膜醭畢赤酵母可以應(yīng)用在柑橘果實(shí)的保鮮上。當(dāng)前第1頁(yè)12