本發(fā)明屬于微生物及飼料加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高植物細胞壁降解酶活性瘤胃真菌分離鑒定及其在青貯飼料中應(yīng)用效果評價。

背景技術(shù)：

農(nóng)作物秸稈作為反芻動物重要的飼料原料，是我國極其豐富、可再生的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源。我國每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量達8.4億多噸，然而僅有22.6～27.5％的秸稈被用作飼料，超過3億噸的秸稈未被利用，造成極大的浪費。農(nóng)作物秸稈青貯和黃貯是我國奶畜養(yǎng)殖重要的優(yōu)質(zhì)粗飼料來源的兩種有效方式。在青貯過程中添加產(chǎn)纖維素酶的真菌或纖維素酶，可破壞植物細胞壁，改善青貯的營養(yǎng)品質(zhì)，降低秸稈中粗纖維含量，因而能夠提高動物對飼草的利用率。微生物制劑和酶制劑作為生物性青貯添加劑是牧草營養(yǎng)學的重點領(lǐng)域。

然而，植物細胞壁多糖成分的復(fù)雜性、合成酶系的多樣性和超分子結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性成為生物質(zhì)資源抵抗微生物和酶消化的主要原因。目前研發(fā)和應(yīng)用于酶制劑生產(chǎn)的菌株存在不能產(chǎn)生降解植物細胞壁所需的全部酶類、產(chǎn)酶成本高和活性不穩(wěn)定等問題。

自1975年orpin首次從綿羊(ovisaires)瘤胃內(nèi)容物中分離出瘤胃厭氧真菌(neocallimastigomycota)以來，國內(nèi)外學者經(jīng)過40多年的研究已證明厭氧真菌是反芻動物消化道中一類重要的降解植物細胞壁的功能菌，在植物細胞壁消化中起著重要的作用。已有研究表明，草食動物消化道真菌所產(chǎn)的植物細胞壁降解酶活性高于目前廣泛應(yīng)用的菌株里氏木霉(trichodermareesei)和曲霉(aspergillusnidulans)。wei等(2016a，anaerobe,39:158-164)發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)瘤胃真菌能夠降解秸稈產(chǎn)生大量乙醇和乙酸。稻草黃貯時添加純培養(yǎng)瘤胃真菌能夠降低黃貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，提高黃貯飼料粗纖維的降解率(leeetal.,2015，journalofappliedmicrobiology,118(3):565)。目前，已在牦牛(bosgrunniens)、肉牛(bostaurus)等反芻動物瘤胃及糞便中篩選獲得了產(chǎn)細胞壁降解酶瘤胃真菌(zhuetal.,1997，anaerobe,3(1):49-59；gruningeretal.,2014，femsmicrobiologyecology,90(1):1-17；weietal.,2016b，journalofappliedmicrobiology,3(120):571-587)，但都未廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。因此，進一步開發(fā)和利用瘤胃厭氧真菌來提高植物飼料細胞壁中多糖的消化率成為研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)從西農(nóng)薩能奶山羊瘤胃中分離篩選植物細胞壁降解酶活性的厭氧真菌，最終篩選獲得的瘤胃厭氧真菌piromycessp.cn6具有較高的植物細胞壁降解酶活性，且木聚糖酶和乙酰酯酶在較寬的溫度和ph范圍內(nèi)均具有較高的活性，同時具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。通過玉米青貯驗證表明，piromycessp.cn6能夠改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，提高粗纖維的降解率，可以作為青貯添加劑應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的之一在于提供一株具有高植物細胞壁降解酶活性的厭氧真菌。

本發(fā)明的目的之二在于提供上述厭氧真菌的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供上述厭氧真菌的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明公開了一株具有細胞壁降解酶活性的厭氧真菌piromycessp.cn6，該菌株已于2017年7月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為cgmccno.14449。該菌株為單中心類型；絲狀假根；游動孢子多為球形或橢圓形，孢子直徑約為4-10μm；多為單鞭毛，偶見雙鞭毛或多鞭毛，鞭毛長度約為10-30μm；成熟孢子囊為球形或橢圓形，孢子囊直徑約為20-75μm；孢子梗較長，與假根相連。

該菌株培養(yǎng)5d的木聚糖酶、羧甲基纖維素酶和乙酰酯酶活性分別為1655.3mu、93.4mu和152.8mu。酶學特性表明，piromycessp.cn6分泌的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適ph為5.0，該酶在40℃和ph5.0～8.0下較穩(wěn)定；k⁺、ca²⁺和co²⁺對其有激活作用，zn²⁺、cu²⁺、mg²⁺、fe²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。乙酰酯酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適ph為9.0，該酶在40℃和ph5.0～10.0下較穩(wěn)定；mg²⁺、k⁺、ca²⁺對乙酰酯酶有激活作用，zn²⁺、fe²⁺、co²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。

其次，本發(fā)明公開了厭氧真菌piromycessp.cn6的培養(yǎng)方法，包括將piromycessp.cn6在厭氧環(huán)境進行培養(yǎng)的步驟。

優(yōu)選的，所述厭氧環(huán)境所用的培養(yǎng)基為：葡萄糖1.0g/l，酵母膏1.0g/l，蛋白胨1.0g/l，nahco37.0g/l，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g/l，鹽溶液a82.5ml/l，鹽溶液b16.5ml/l，0.1g/l刃天青溶液1.0ml/l。

鹽溶液a：nacl6.0g，(nh4)2so43.0g，kh2po43.0g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·7h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。鹽溶液b：4gk2hpo4蒸餾水定容至1000ml。

液體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1％(w/v)的粉碎風干的小麥秸稈。

固體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加15mg/ml的瓊脂。

上述piromycessp.cn6的發(fā)酵培養(yǎng)物、菌體也是本發(fā)明的公開范圍。

此外，本發(fā)明還公開了piromycessp.cn6的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括在制備植物細胞壁降解酶中的應(yīng)用，或者在農(nóng)作物秸稈飼料制備中應(yīng)用。

具體的，本發(fā)明公開了一種用于植物細胞壁降解的組合酶的制備方法，包括piromycessp.cn6進行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟和對發(fā)酵液中酶進行純化的步驟。

本發(fā)明還公開了一種農(nóng)作物秸稈青貯飼料的制備方法，包括在青貯工程中添加piromycessp.cn6菌體或培養(yǎng)液的步驟。

優(yōu)選的，添加piromycessp.cn6菌體10⁵tfu/g或培養(yǎng)液中piromycessp.cn6真菌數(shù)量>10⁶tfuml^-1。

優(yōu)選的，青貯飼料的制備方法中在青貯之前還包括piromycessp.cn6進行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟。

優(yōu)選的，所述農(nóng)作物秸稈為玉米秸稈。

基于此，本發(fā)明也公開了一種青貯微生態(tài)制劑，包括piromycessp.cn6菌體。

優(yōu)選的，所述青貯微生態(tài)制劑還包括其他菌體，如植物乳桿菌等乳酸菌。

本發(fā)明取得了以下有益效果：

(1)本發(fā)明采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)從西農(nóng)薩能奶山羊瘤胃中分離獲得12株具有細胞壁降解酶活性的厭氧真菌，通過形態(tài)學觀察、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和28srdnad1/d2區(qū)基因序列分析確定其分類地位。測定12株真菌的植物細胞壁降解酶活性(木聚糖酶、羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶、乙酰酯酶和β-葡聚糖酶)，并對活性最高菌株的木聚糖酶和乙酰酯酶進行酶學特性分析。結(jié)果表明，12株瘤胃厭氧真菌均為piromyces屬，分別命名為piromycessp.cn1-piromycessp.cn12。其中，piromycessp.cn6的木聚糖酶、羧甲基纖維素酶和乙酰酯酶活性分別為1655.3mu、93.4mu和152.8mu，顯著高于其他菌株(p<0.05)，piromycessp.cn3的微晶纖維素酶活性最高，但與piromycessp.cn6差異不顯著(p>0.05)，各菌株的β-葡聚糖酶活性差異不顯著(p>0.05)，且木聚糖酶與羧甲基纖維素酶、乙酰酯酶存在極顯著正相關(guān)(p<0.01)，與微晶纖維素酶呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。酶學特性表明，piromycessp.cn6的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適ph為5.0，該酶在40℃和ph5.0-8.0下較穩(wěn)定；k⁺、ca²⁺、co²⁺對其有激活作用，zn²⁺、cu²⁺、mg²⁺、fe²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。乙酰酯酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適ph為9.0，該酶在40℃和ph5.0-10.0下較穩(wěn)定；mg²⁺、k⁺、ca²⁺對乙酰酯酶有激活作用，zn²⁺、fe²⁺、co²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。本發(fā)明從奶山羊瘤胃內(nèi)容物篩選獲得的piromycessp.cn6具有較高的植物細胞壁降解酶活性，其中木聚糖酶和乙酰酯酶在較寬的溫度和ph范圍內(nèi)均具有較高的活性，同時具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。

(2)本發(fā)明采用單因素完全隨機設(shè)計，每組設(shè)5個重復(fù)，以全株玉米為青貯原料，分別設(shè)為對照組、真菌組(10⁵tfu/g)和復(fù)合酶組(0.033mg/g)，聚乙烯袋真空包裝，室溫下存儲10d、30d、60d后開封取樣。結(jié)果表明，真菌組和復(fù)合酶組青貯飼料達到1級優(yōu)良，對照組達到2級較好，瘤胃真菌piromycessp.cn6作為青貯接種劑能夠在青貯前期大量繁殖并附著在玉米莖葉表面。與對照組相比，真菌組和酶制劑組均可顯著降低發(fā)酵30d青貯玉米ph、乙酸含量和nh3-n/tn(p<0.05)，顯著降低發(fā)酵10d、30d、60d后青貯玉米ndf和adf含量(p<0.05)，顯著提高發(fā)酵30d青貯飼料干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維體外消化率(p<0.05)，顯著提高發(fā)酵30d青貯玉米可溶性糖含量、粗蛋白含量、乳酸含量和乳酸/乙酸比值(p<0.05)。綜上，瘤胃真菌piromycessp.cn6能夠改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，提高粗纖維的降解率，可以作為青貯添加劑應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

附圖說明

圖1瘤胃厭氧真菌的掃描電鏡圖

圖2瘤胃厭氧真菌的生長階段

圖3瘤胃厭氧真菌的its序列進化樹

圖4瘤胃厭氧真菌的28srdnad1/d2序列進化樹

圖5木聚糖酶和乙酰酯酶的最適溫度

圖6木聚糖酶和乙酰酯酶的溫度穩(wěn)定性

圖7木聚糖酶和乙酰酯酶的最適ph

圖8木聚糖酶和乙酰酯酶的ph穩(wěn)定性

圖9金屬離子對木聚糖酶和乙酰酯酶的影響

圖10青貯玉米掃描電鏡圖

圖11不同處理對青貯玉米ndf和adf的影響

具體實施方式

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明，以下實例僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。如果實施例中未注明的實驗具體條件，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑公司所推薦的條件；下述實施例中所用的試劑、耗材等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本文中，青貯是將收割的鮮(青)秸稈粉碎后直接窖貯、裝袋或打捆包裹貯藏的一種技術(shù)。青貯料經(jīng)壓實密封，在適宜的濕度條件下，自身所含有的或添加的微生物厭氧發(fā)酵，使貯料內(nèi)部的ph降到4.5左右。此時，大部分微生物都會停止繁殖，最后乳酸菌也被自身產(chǎn)生的乳酸所控制而停止生長，從而達到青貯的目的。由于青貯要求秸稈含水率在60％～70％以上，含水率過低時便不能作業(yè)，因此受到時間上的限制。

本文中，黃貯是利用己變干(黃)秸稈做原料，經(jīng)機械揉搓粉碎后，加適量水和生物菌劑，壓捆以后再裝袋貯存的一種技術(shù)。黃貯加入的高效復(fù)合菌劑，在適宜的厭氧環(huán)境下，將大量的纖維素、半纖維素，甚至一些木質(zhì)素分解，并轉(zhuǎn)化為糖類。糖類經(jīng)有機酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸和丙酸，并抑制丁酸菌和霉菌等有害菌的繁殖，最后達到與青貯同樣的貯存效果。

誠如背景技術(shù)中所述，為進一步開發(fā)和利用瘤胃厭氧真菌來提高植物飼料細胞壁中多糖的消化率，本發(fā)明公開了一株具有細胞壁降解酶活性的厭氧真菌piromycessp.cn6，該菌株已于2017年7月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為cgmccno.14449。

本發(fā)明所述厭氧真菌可以產(chǎn)生一個多組分的纖維素酶系，主要包括內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase)和β-1,4-葡萄糖苷酶(β-1,4-cellobiase)，它們通過協(xié)同作用快速降解微晶纖維素。其中，內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素多糖鏈上的非結(jié)晶區(qū)，通過隨機地切斷糖苷鍵，使纖維多糖長鏈變短，產(chǎn)生新的糖鏈末端或長短不一的纖維寡糖。外切纖維素酶作用于纖維素糖鏈的還原端或非還原端，以漸進的方式切割，釋放出纖維二糖或葡萄糖。β-葡聚糖酶能夠快速地水解可溶性的纖維糊精或纖維二糖生成葡萄糖。

本發(fā)明厭氧真菌產(chǎn)生的半纖維素酶主要為木聚糖酶，包括木二糖酶、β-木聚糖酶和β-木糖苷酶。以隨機切割的方式，將木聚糖水解成木糖分子，從而有效地消除木聚糖的抗營養(yǎng)作用。另外，木聚糖酶和乙酰酯酶可以通過協(xié)同作用加速植物細胞壁中乙?；鶊F的釋放和木聚糖的降解，提高飼料細胞壁的降解效率。

此外，本發(fā)明厭氧真菌還能夠分泌乙酰酯酶、p-香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶等酯酶和果膠酶。酯酶能夠打開細胞壁中酚酸和半纖維素形成的酯鍵，使半纖維素從木質(zhì)素和纖維素的復(fù)合體中釋放出來。果膠酶能夠降解植物細胞壁果膠成分，釋放出的細胞壁其他成分又可以為其他降解酶的酶解提供反應(yīng)底物，在植物細胞壁降解的初始階段具有非常重要的意義。瘤胃厭氧真菌產(chǎn)生的阿魏酸酯酶和乙酰酯酶活性要比瘤胃細菌高數(shù)倍，是反芻動物降解細胞壁酚酸類物質(zhì)的關(guān)鍵酶。

該菌株培養(yǎng)5d的木聚糖酶、羧甲基纖維素酶和乙酰酯酶活性分別為1655.3mu、93.4mu和152.8mu；木聚糖酶與羧甲基纖維素酶、乙酰酯酶存在極顯著正相關(guān)(p<0.01)，與微晶纖維素酶呈顯著正相關(guān)(p<0.05)；酶學特性表明，piromycessp.cn6分泌的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適ph為5.0，該酶在40℃和ph5.0～8.0下較穩(wěn)定；k⁺、ca²⁺和co²⁺對其有激活作用，zn²⁺、cu²⁺、mg²⁺、fe²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。乙酰酯酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適ph為9.0，該酶在40℃和ph5.0～10.0下較穩(wěn)定；mg²⁺、k⁺、ca²⁺對乙酰酯酶有激活作用，zn²⁺、fe²⁺、co²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。

本發(fā)明的另一實施方案中公開了厭氧真菌piromycessp.cn6的培養(yǎng)方法，包括將piromycessp.cn6在厭氧環(huán)境進行培養(yǎng)的步驟。

所述厭氧環(huán)境所用的培養(yǎng)基為：葡萄糖1.0g/l，酵母膏1.0g/l，蛋白胨1.0g/l，nahco37.0g/l，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g/l，鹽溶液a82.5ml/l，鹽溶液b16.5ml/l，0.1g/l刃天青溶液1.0ml/l。

鹽溶液a：nacl6.0g，(nh4)2so43.0g，kh2po43.0g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·7h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。鹽溶液b：4gk2hpo4蒸餾水定容至1000ml。

液體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1％(w/v)的粉碎風干的小麥秸稈。

固體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加15mg/ml的瓊脂。

上述piromycessp.cn6的發(fā)酵培養(yǎng)物、菌體也是本發(fā)明的公開范圍。

此外，本發(fā)明的實施方案中公開了一種用于植物細胞壁降解的組合酶的制備方法，包括括piromycessp.cn6進行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟和對發(fā)酵液中酶進行純化的步驟。

本發(fā)明還公開了一種農(nóng)作物秸稈青貯飼料的制備方法，包括在青貯工程中添加piromycessp.cn6菌體或培養(yǎng)液的步驟。

優(yōu)選的實施例中，添加piromycessp.cn6菌體10⁵tfu/g或培養(yǎng)液中真菌數(shù)量>10⁶tfuml^-1。

優(yōu)選的實施例中，青貯飼料的制備方法中在青貯之前還包括piromycessp.cn6進行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟。

優(yōu)選的實施例中，所述農(nóng)作物秸稈為玉米秸稈。

以下通過具體實施例來闡述本發(fā)明。

實施例1高植物細胞壁降解酶活性瘤胃真菌分離鑒定及酶學特性分析

1.1材料及方法

菌株來源：瘤胃內(nèi)容物取自西北農(nóng)林科技大學畜牧教學基地3頭裝有永久性瘤胃瘺管且體況良好的西農(nóng)薩能奶山羊，試驗動物分別在08﹕30和17﹕30各飼喂一次，日糧精粗比為3﹕7，自由飲水，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。瘤胃內(nèi)容物的采集操作：奶山羊晨飼后2h，瘤胃內(nèi)容物通過負壓裝置從瘺管中采集，裝入已滅菌并充滿co2的厭氧瓶中，將厭氧瓶放入39℃保溫瓶中，迅速帶回實驗室，進行瘤胃厭氧真菌的分離培養(yǎng)。

表1日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

每千克預(yù)混料含有:石粉476.0g，feso4·7h2o25.38g，cuso4·5h2o13.45g，mnso4·h2o12.56g，znso4·7h2o40.20g，cocl2·6h2o83mg，na2seo345mg，ki66mg，va3×10⁶iu，vd37.8×10⁵iu，ve3×10³iu。2營養(yǎng)水平為實際測量值。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖1.0g/l，酵母膏1.0g/l，蛋白胨1.0g/l，nahco37.0g/l，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g/l，鹽溶液a82.5ml/l，鹽溶液b16.5ml/l，0.1g/l刃天青溶液1.0ml/l，瘤胃液12000rpm離心20min后收集的上清170.0ml/l。

鹽溶液a：nacl6.0g，(nh4)2so43.0g，kh2po43.0g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·7h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。鹽溶液b：4gk2hpo4蒸餾水定容至1000ml。

液體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1％(w/v)的粉碎風干的小麥秸稈。

固體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加15mg/ml的瓊脂。

培養(yǎng)基分裝到亨蓋特厭氧管中(9ml/管)，厭氧管通過針頭接入帶有真空泵和高純co2的抽氣裝置進行除氧。培養(yǎng)基除氧后于121℃高溫高壓濕熱滅菌20min備用。

復(fù)合抗生素：醫(yī)用硫酸鏈霉素1g(100萬單位)與醫(yī)用青霉素鈉0.48g(80萬單位)溶解于5ml液體培養(yǎng)基中。氯霉素溶液：100mg氯霉素溶解于5ml乙醇(以無菌水為溶質(zhì)，濃度50％(v/v)的乙醇)。厭氧真菌傳代時每次添加100ul復(fù)合抗生素和25ul氯霉素溶液到10ml培養(yǎng)體系，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別達到2000iu/ml、1600iu/ml和50μg/ml。

瘤胃厭氧真菌的分離純化：采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進行厭氧真菌的分離純化，采集的瘤胃內(nèi)容物充分混合后，用無菌注射器取1ml接種到39℃預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中，39℃培養(yǎng)3-4d。取1ml菌液接種于煮沸融化后置于45℃水浴的固體培養(yǎng)基，冰上滾管至培養(yǎng)基凝固并均勻分布于管壁，39℃培養(yǎng)3-4d。選擇菌落密度適中的培養(yǎng)管在熒光顯微鏡下觀察厭氧真菌菌落形態(tài)，并根據(jù)甲烷菌自身熒光特點，選擇沒有甲烷菌共生的單菌落，在厭氧條件下挑取菌落至新鮮的39℃預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中。同時，整個分離純化過程用氣相色譜儀檢測是否有甲烷產(chǎn)生。重復(fù)上述過程，直到鏡檢厭氧管中所有菌體形態(tài)一致，且檢測不到甲烷，在熒光顯微鏡下觀察不到甲烷菌，即獲得了瘤胃厭氧真菌單菌株。

菌株的鑒定

(1)菌落及菌體形態(tài)特征觀察：用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)2-3d固體培養(yǎng)基表面的厭氧真菌菌落形態(tài)。取50ul培養(yǎng)3-5d的培養(yǎng)液置于載玻片上，在普通光學顯微鏡下觀察厭氧真菌游動孢子、孢子囊及營養(yǎng)體形態(tài)。參照rezaeian等(2004，mycologicalresearch.108(10):1215-1226)方法處理培養(yǎng)3-5d培養(yǎng)基中的麥秸，用掃描電鏡觀察麥秸上定植的厭氧真菌菌體形態(tài)、孢子梗、孢子囊、菌絲體和假根等。根據(jù)厭氧真菌的形態(tài)學特征對其做出種屬鑒定。

(2)系統(tǒng)進化樹發(fā)育分析：液氮研磨菌體后，采用ctab法提取厭氧真菌基因組dna，進行核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)序列和28srdnad1/d2區(qū)基因序列擴增。真菌its特異性引物如下：jb206:5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’(seqidno:1)和jb205:5’-tcctccgcttattaatatgc-3’(seqidno:2)。擴增體系：10×pcrbuffer5μl，taqdna聚合酶0.5μl，dntps1μl，上下游引物(100ng/μl)各1μl，模版dna1μl，ddh2o補足體積至50μl。pcr反應(yīng)條件：95℃，5min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，1min；35個循環(huán)；72℃，6min。采用引物nl1(5’-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’seqidno:3)和nl4(5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’seqidno:4)擴增菌株的28srdnad1/d2區(qū)基因序列。進行pcr產(chǎn)物的t載體連接和轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆由華大基因公司測序。

植物細胞壁降解酶活性測定

粗酶液的制備：將培養(yǎng)5d的菌液1000×g離心10min,取上清液測定酶活。

將適當稀釋的粗酶液、10g/l底物和50mmpbs緩沖液(ph＝7.0)置于39℃預(yù)熱15min，然后向75μl粗酶液中加入75μl緩沖液和50μl底物，39℃反應(yīng)一定時間后加入300μldns溶液終止反應(yīng)。沸水浴5min后，冷卻至室溫。取200μl于干凈的96孔酶標板上，用多功能酶標儀在540nm下檢測吸光度。木聚糖酶的底物為木聚糖、反應(yīng)時間為15min，根據(jù)木糖的標準曲線計算木聚糖酶活性。羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶和β-葡聚糖酶的底物分別為羧甲基纖維素、微晶纖維素和β-葡聚糖，反應(yīng)時間為30min，根據(jù)葡萄糖的標準曲線計算酶活性。

乙酰酯酶活性測定：將適當稀釋的粗酶液、2mmp-硝基苯乙酯和50mmpbs緩沖液(ph＝7.0)置于39℃預(yù)熱15min，然后向50μl粗酶液中加入100μl緩沖液和50μl底物，39℃反應(yīng)30min后，用多功能酶標儀在415nm下檢測吸光度，根據(jù)p-硝基苯的標準曲線計算乙酰酯酶活性。

1個酶活力單位(u)是指在以上所述酶促反應(yīng)條件下，1ml酶液在1min內(nèi)自標準底物中釋放1μmol葡萄糖所需的酶量。

酶學特性分析

最適反應(yīng)溫度：按照木聚糖酶和乙酰酯酶活力測定方法，分別測定反應(yīng)溫度為20，30，40，50，60和70℃時的酶活力。以溫度為橫坐標，以相對酶活(活力最高定為100％)為縱坐標，比較不同溫度對酶活的影響。

溫度穩(wěn)定性：將粗酶液在40℃和50℃保溫1、3、5、7、9、11和24h后，最佳反應(yīng)溫度下測定木聚糖酶和乙酰酯酶活性。以最適反應(yīng)溫度下未保溫處理的粗酶液所測得酶活為100％，分析木聚糖酶和乙酰酯酶的溫度穩(wěn)定性。

最適作用ph:按照木聚糖酶和乙酰酯酶活力測定方法，分別測定ph3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0下的酶活力。以相對值表示各ph下的酶活。

ph穩(wěn)定性：將粗酶液用ph分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的緩沖液適度稀釋，預(yù)保溫1h，最適溫度下測定木聚糖酶和乙酰酯酶活性。以相同ph配制未保溫酶液處理的酶活為100％計算相對活力，分析酶的ph穩(wěn)定性。

金屬離子對酶活性影響：取4.0mmol/lmgso4、feso4、zncl2、cucl2、cocl2、cacl2、mncl2、kcl等儲液與等體積的粗酶液混合，39℃保溫30min后，測定木聚糖酶和乙酰酯酶活性。

1.2試驗結(jié)果

菌株形態(tài)特征觀察：經(jīng)過反復(fù)多次的分離純化，從西農(nóng)薩能奶山羊瘤胃中分離得到12株厭氧真菌，分別編號為cn1-cn12。顯微鏡和掃描電鏡觀察(圖1，圖2)發(fā)現(xiàn)cn1-cn12均為單中心類型；絲狀假根；游動孢子多為球形或橢圓形，孢子直徑約為4-10μm；多為單鞭毛，偶見雙鞭毛或多鞭毛，鞭毛長度約為10-30μm；成熟孢子囊為球形或橢圓形，孢子囊直徑約為20-75μm；孢子梗較長，與假根相連。

菌株系統(tǒng)發(fā)育學分析：測序結(jié)果顯示擴增得到的its和28srdnad1/d2基因片段均為700bp左右。將菌株cn1-cn12的its基因序列和28srdnad1/d2區(qū)基因序列與genbank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，結(jié)果顯示12株真菌的its序列與piromycessp.egrl-6(jf974104)相似度最高，達98％，12株真菌的28srdna基因序列與piromycessp.10gfm-3(jf974127)相似度最高，達99％。采用mega6.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining,nj)對目的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定菌株的進化地位。結(jié)果(圖3，圖4)顯示：菌株cn1-cn12均可與piromyces屬真菌聚于同一分支。結(jié)合掃描電鏡和顯微鏡觀察結(jié)果可以確定菌株cn1-cn12均為piromyces屬。

高植物細胞壁降解酶活性菌株篩選：由表2可知，12株厭氧真菌的木聚糖酶、羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶、乙酰酯酶和β-葡聚糖酶活力分別為462.5-1655.3、20.0-93.4、29.2-54.5、94.1-152.8、57.3-68.5mu。菌株piromycessp.cn6的木聚糖酶(1655.3mu)、羧甲基纖維素酶(93.4mu)和乙酰酯酶(152.8mu)均顯著高于其他菌株(p<0.05)。菌株piromycessp.cn3產(chǎn)生的微晶纖維素酶活性最高，但與菌株piromycessp.cn6差異不顯著(p>0.05)。12株菌株產(chǎn)生的β-葡聚糖酶活性差異不顯著(p>0.05)。確定菌株piromycessp.cn6的細胞壁降解酶活性最高，對其分泌的木聚糖酶和乙酰酯酶進行酶學特性分析。

植物細胞壁降解酶活性的相關(guān)分析：對12株厭氧真菌的5種降解酶活性進行相關(guān)分析，由表3可知，木聚糖酶、羧甲基纖維素酶和乙酰酯酶相互間均存在極顯著正相關(guān)(r>0.555，p<0.01)，同時木聚糖酶、羧甲基纖維素酶與微晶纖維素酶呈顯著正相關(guān)(r>0.367，p<0.05)。木聚糖酶、羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶、乙酰酯酶與β-葡聚糖酶無顯著相關(guān)性(r<0.119，p>0.05)。

酶學特性分析

木聚糖酶和乙酰酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性：由圖5可知，隨著溫度的升高，菌株piromycessp.cn6的木聚糖酶和乙酰酯酶活性逐漸升高，當溫度達到50℃時，木聚糖酶和乙酰酯酶活性均達到最高；超過50℃以后，木聚糖酶活性迅速降低，乙酰酯酶活性緩慢降低。木聚糖酶和乙酰酯酶均具有較強的溫度適應(yīng)性，乙酰酯酶的溫度適應(yīng)性更強。

熱穩(wěn)定性結(jié)果(圖6)表明，木聚糖酶和乙酰酯酶在40℃以下時相對穩(wěn)定，40℃處理11h小時后木聚糖酶殘余活性為71％，乙酰酯酶殘余活性為65％；50℃保溫時，酶活力隨時間的延長而逐漸喪失，5h后木聚糖酶殘余酶活力為34％，乙酰酯酶殘余酶活力為44％。木聚糖酶和乙酰酯酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

木聚糖酶和乙酰酯酶的最適ph及ph穩(wěn)定性：由圖7可知，木聚糖酶的最適ph為5.0，偏酸性。ph在3.0-5.0時，木聚糖酶的活力逐漸增加，當ph在4.0-7.0的范圍內(nèi)，酶活力維持在82％以上，表現(xiàn)出較強的活力；ph在5.0-10.0時，酶活力逐漸降低，當ph>9.0時相對酶活力低于40％。由此可知，木聚糖酶為酸性酶，在ph4.0-7.0能更好的發(fā)揮作用。

乙酰酯酶的相對活力在ph為9.0時最高，在ph<5.0的酸性環(huán)境中，酶活力幾乎為0。ph在5.0-6.0時，酶活力緩慢增加，ph在6.0-9.0時，酶活力快速增加至最大，該酶的最適ph為9.0，ph達到10.0時，酶活力僅有略微降低，仍達到90％左右。乙酰酯酶為堿性酶，在ph8.0-10.0能更好的發(fā)揮作用。

ph穩(wěn)定性表明(圖8)，木聚糖酶和乙酰酯酶在ph5.0-9.0范圍內(nèi)保溫1h后殘余酶活在76％以上，活性較穩(wěn)定，特別是ph為10.0時，乙酰酯酶活性仍有81％。說明菌株piromycessp.cn6分泌的木聚糖酶在ph5.0-8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，乙酰酯酶在ph5.0-10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

金屬離子對菌株cn6木聚糖酶和乙酰酯酶的影響：由圖9可知，k⁺、ca²⁺、co²⁺對木聚糖酶有激活作用，cu²⁺、mg²⁺、zn²⁺、fe²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。ca²⁺、mg²⁺、k⁺對乙酰酯酶有激活作用，fe²⁺、co²⁺、zn²⁺和mn²⁺抑制該酶活性。

表2瘤胃真菌分離株纖維素降解酶活性

同列無字母或肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。數(shù)值表示為平均值±標準差，下同。

表3各菌株培養(yǎng)液中5種酶活性的相關(guān)系數(shù)

*：相關(guān)系數(shù)達到顯著水平(p<0.05)，**：相關(guān)系數(shù)達到極顯著水平(p<0.01)，未標注的表明差異不顯著(p>0.05)。

實施例2piromycessp.cn6對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)成分及體外消化率的影響

2.1材料與方法

青貯原料：西北農(nóng)林科技大學畜牧教學基地栽培的全株玉米(中原單32)，乳熟期刈割，含水量在64％左右，揉碎至1-3cm。全株玉米的組成成分如表4所示。

表4全株玉米的營養(yǎng)成分

復(fù)合酶制劑：日本snowbrandseed公司生產(chǎn)的青貯專用添加劑，固體劑型，含纖維素酶和木聚糖酶，活力分別為90fpu/g及6000iu/g。

真菌接種劑：菌株piromycessp.cn6為實驗室前期從西農(nóng)莎能奶山羊分離獲得的高植物細胞壁降解酶活性瘤胃厭氧真菌，菌液為接種菌株5d后的培養(yǎng)液，真菌數(shù)量>10⁶tfuml^-1。

試驗采用單因子完全隨機設(shè)計，分別設(shè)置對照組(ck)、真菌組(fu)和酶制劑組(en)。每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1kg切短全株玉米。對照組均勻噴灑100ml的蒸餾水，真菌組均勻噴灑100ml厭氧真菌培養(yǎng)液，酶制劑組均勻噴灑100ml含33mg復(fù)合酶制劑的蒸餾水，青貯調(diào)制在厭氧工作站中完成。將處理后的玉米秸稈迅速裝入聚乙烯真空包裝袋中壓實并用真空包裝機真空封口，室溫條件下(25～32℃)儲藏，發(fā)酵10d、30d、60d后開封，去除表層青貯飼料，充分混均后取樣，立即于-80℃保存，待測。

樣品采集與指標測定

感官評定：全株玉米青貯30d后開封，棄掉表層的青貯樣品，按照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會感官青貯評分標準及等級評定方法從色澤、氣味和結(jié)構(gòu)等方面對青貯玉米進行綜合評定。發(fā)酵品質(zhì)：稱取10g青貯樣品放入100ml錐形瓶，加入90ml蒸餾水，充分混均后用封口膜封口，在4℃下靜置24h，再分別通過4層紗布和定性濾紙過濾，獲得青貯玉米浸提液，用于ph、氨態(tài)氮(nh3-n)和有機酸的測定。使用日立l-2000型高效液相色譜儀測定浸提液中的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。氨態(tài)氮含量的測定采用苯酚-次氯酸比色法。

營養(yǎng)成分評價：進行青貯飼料的采集，采用常規(guī)法測定樣品的干物質(zhì)(dm)含量、粗蛋白(cp)含量、可溶性碳水化合物(wsc)含量、粗脂肪(ee)含量、中性洗滌纖維(ndf)和酸性洗滌纖維(adf)含量。進行干物質(zhì)回收率(dmr)的測定。

掃描電子顯微鏡觀察：參照rezaeian等(2004，mycologicalresearch.108(10):1215-1226)方法處理真菌組青貯30d的玉米莖葉，用掃描電鏡觀察葉片表面損壞及真菌附著情況。

青貯玉米飼料的體外發(fā)酵：參照adesogan等(2005，animalfeedscienceandtechnology.119(3):333-344)文章中描述方法，略加改進后應(yīng)用體外模擬培養(yǎng)液測定發(fā)酵30d青貯玉米干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維48h體外消化率。具體方法為：預(yù)先用丙酮洗滌ankomf57濾袋3-5min并完全干燥，稱量每個濾袋并記錄重量，去皮后直接在濾袋中稱量0.5g左右風干青貯飼料樣品。濾袋封口后放置于39℃預(yù)熱的daisyⅱincubator培養(yǎng)箱消化罐中，每個罐放置23個含樣品濾袋和2個空白濾袋，平衡分布在消化罐分隔板的兩側(cè)。迅速向消化罐分別加入39℃預(yù)熱的瘤胃緩沖液1600ml和四層紗布過濾后的瘤胃液400ml。立即將消化罐放置于培養(yǎng)箱中，打開加熱和轉(zhuǎn)動開關(guān)。培養(yǎng)48h小時后取出消化罐倒出液體，用冷水沖洗濾袋直至干凈為止。

2.2試驗結(jié)果

青貯玉米的感官評定：對發(fā)酵30d的青貯飼料進行感官評定，分析得出(表5)真菌組和酶制劑組為1級優(yōu)良，表現(xiàn)為莖葉結(jié)構(gòu)保持良好，色澤呈淡黃色，有明顯的芳香味。對照組為2級較好，表現(xiàn)為莖葉結(jié)構(gòu)保持較好，色澤呈淡黃色，芳香味不如添加劑組強。

表5青貯玉米的感官評定(n＝5)

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果：由圖10可知，發(fā)酵30d青貯玉米莖葉表明附著大量瘤胃厭氧真菌，同時青貯玉米莖葉表面結(jié)構(gòu)破壞嚴重。由此可知，瘤胃厭氧真菌能夠在全株玉米青貯前期大量繁殖并且成功附著在莖葉表面。

不同處理對青貯30d發(fā)酵品質(zhì)的影響：由表6可知，發(fā)酵第10d，酶制劑組ph顯著低于對照組和真菌組ph(p<0.05)，真菌組ph和對照組差異不顯著(p>0.05)。發(fā)酵第30d，真菌組和酶制劑組ph均顯著低于對照組ph(p<0.05)。發(fā)酵第60d，不同處理對青貯玉米的ph無顯著性影響(p>0.05)。發(fā)酵第30d和60d，各組ph顯著低于第10d(p<0.05)，但第30d和60d之間的差異均不顯著(p>0.05)。

表6不同處理對青貯玉米ph的影響

ab：同行無字母或肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，同行肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。xy：同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

由表7可知，發(fā)酵第30d，與對照組相比，真菌接種劑和復(fù)合酶制劑可顯著降低青貯飼料乙酸含量和nh3-n/tn(p<0.05)，顯著提高青貯玉米的乳酸含量、乳酸/乙酸比值(p<0.05)。三個處理組均未檢測出丁酸，說明青貯發(fā)酵以乳酸發(fā)酵為主。

表7不同處理對青貯30d發(fā)酵品質(zhì)的影響

不同處理對青貯玉米ndf和adf含量的影響：由圖11可知，與對照組相比，真菌接種劑和復(fù)合酶制劑可顯著降低發(fā)酵10d、30d、60d青貯玉米的ndf和adf含量(p<0.05)。

不同處理對青貯30d玉米營養(yǎng)物質(zhì)和干物質(zhì)回收率的影響：由表8可知，與對照組相比，真菌接種劑和復(fù)合酶制劑均可顯著降低發(fā)酵30d青貯飼料的ndf和adf含量(p<0.05)，顯著提高青貯飼料wsc和cp含量(p<0.05)。不同處理對發(fā)酵30d青貯飼料的dm和ee含量無顯著影響(p>0.05)。不同處理對發(fā)酵30d青貯飼料干物質(zhì)回收率(dmr)無顯著性影響(p>0.05)。

表8不同處理對青貯30d玉米營養(yǎng)物質(zhì)的影響

不同處理對青貯玉米體外消化率的影響：由表9可知，與對照組相比，真菌接種劑和復(fù)合酶制劑可顯著降低發(fā)酵30d青貯飼料dm、ndf和adf體外消化率(p<0.05)。

表9不同處理對青貯玉米體外消化率的影響

本發(fā)明中，全株玉米經(jīng)30d青貯后，真菌組青貯飼料ndf和adf含量分別降低9.59％、8.67％，酶制劑組青貯飼料ndf和adf含量分別降低8.98％、6.86％。與酶制劑組相比，真菌組青貯飼料的ndf和adf含量分別降低1.55％、1.94％。另外，本發(fā)明中瘤胃厭氧真菌還能夠提高青貯飼料ivdmd、ivndfd和ivadfd。同樣，相比酶制劑組，真菌組青貯飼料干物質(zhì)、ndf和adf的體外消化率分別提高3.44％、5.13％和6.15％。

上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。

sequencelisting

<110>西北農(nóng)林科技大學

<120>高植物細胞壁降解活性瘤胃真菌及其在飼料青貯中的應(yīng)用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>引物jb206

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