本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體視網(wǎng)膜干細胞的細胞培養(yǎng)方法、試劑盒和應用。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜是位于眼底的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特化的一部分,起源于神經(jīng)外胚層，是一層對光敏感的、精細的膜樣結(jié)構(gòu)，是形成各種視功能的基礎(chǔ)。由胚胎時期神經(jīng)外胚葉形成的視杯發(fā)育而來，視杯外層形成單一的視網(wǎng)膜色素上皮層，視杯內(nèi)層則分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層。視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層由外向內(nèi)分別是:視錐、視桿層，外界膜，外核層，外叢狀層，內(nèi)核層，內(nèi)叢狀層，神經(jīng)節(jié)細胞層，神經(jīng)纖維層，內(nèi)界膜(屬müller細胞的基底膜)。

眼底疾病多數(shù)會導致嚴重的致盲眼病，視網(wǎng)膜神經(jīng)元的不可逆性的丟失是許多眼底疾病的最終結(jié)局，主要有各種視網(wǎng)膜疾病和年齡相關(guān)性黃斑變性。目前尚無有效的治療方法。如何地治療和預防眼底性疾病，再生和修復視網(wǎng)膜病變和黃斑病變，恢復眼底疾病患者的視功能，是當今神經(jīng)科學領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。近10年來，國內(nèi)外醫(yī)學界利用視網(wǎng)膜干細胞修復各種視網(wǎng)膜變性和損傷，給各種視網(wǎng)膜疾病、黃斑變性等致盲性眼底疾病的治療和預防帶來了曙光。

目前，應用型的視網(wǎng)膜干細胞多來源于：1、胚胎干細胞(escs)誘導的異體視網(wǎng)膜干細胞；2、睫狀上皮來源的干細胞或祖細胞，在體外進行培養(yǎng)；3、臍帶血干細胞/間充質(zhì)干細胞來源的視網(wǎng)膜細胞；4、誘導的多能干細胞(ips)來源的視網(wǎng)膜干細胞。

中國專利申請201480066229公開了一種提供用于產(chǎn)生分離的哺乳動物原始視網(wǎng)膜干細胞(prsc)的體外方法，其包括：(a)在不含飼養(yǎng)細胞、飼養(yǎng)層條件化培養(yǎng)基或血清的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自哺乳動物的分離的胚胎干細胞(esc)以產(chǎn)生并生長所述分離的esc的培養(yǎng)物；和(b)使這樣生長的所述分離的esc的所述培養(yǎng)物與wnt或tgf-β/bmp信號傳導抑制劑中的一種或多種接觸以使(a)的所述分離的esc分化成原始視網(wǎng)膜干細胞，由此產(chǎn)生分離的哺乳動物prsc。然而通過esc誘導制備視網(wǎng)膜干細胞的方法通常耗時較長，誘導產(chǎn)生時間需要8-15周，此外其制備的視網(wǎng)膜干細胞在應用時也會出現(xiàn)異體免疫排斥反應。

睫狀上皮來源的干細胞或祖細胞，在體外進行培養(yǎng)也有可能分化形成視網(wǎng)膜干細胞，然而研究已經(jīng)證明睫狀體細胞并不是真正意義上的視網(wǎng)膜干細胞，因此不適合應用于視網(wǎng)膜再生的治療。

中國專利申請201510636044公開了一種治療視網(wǎng)膜變性的干細胞制劑及其使用方法。通過將骨髓間充質(zhì)干細胞優(yōu)化培養(yǎng)和誘導分化，提高了其分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)前體樣細胞效率，其移植效果與視網(wǎng)膜前體細胞具有相似的功效，使移植區(qū)視網(wǎng)膜功能有效改善，為干細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病提供了一種理想的細胞來源。然而臍帶血干細胞/間充質(zhì)干細胞來源的視網(wǎng)膜細胞的方法，存在體外培養(yǎng)時間長達數(shù)周，穩(wěn)定性差，污染率高，獲得的視網(wǎng)膜細胞數(shù)量少，產(chǎn)量極少，生物特性不穩(wěn)定等問題。

中國專利申請201210301765公開了一種誘導人多能干細胞分化為視網(wǎng)膜前體細胞的方法。該方法，將人胚胎干細胞或人誘導的多能干細胞在含有n2的培養(yǎng)基中誘導后，轉(zhuǎn)入含有神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、敲除的血清替代物和煙酰胺的視網(wǎng)膜誘導培養(yǎng)基，獲得視網(wǎng)膜前體細胞。誘導的多能干細胞(ips)是一種轉(zhuǎn)基因式的自體多能干細胞，然而其致癌風險高，生產(chǎn)工藝復雜，時間長，應用安全性引起嚴重關(guān)注。

在本發(fā)明中，應用多種小分子物質(zhì)組成的細胞培養(yǎng)液，使血液單個核細胞等人的體細胞逆向分化，在2周之內(nèi)即可產(chǎn)生數(shù)億數(shù)量級別的人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞。這種人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞是在不改變?nèi)说捏w細胞染色體dna序列，不插入任何外來基因或dna片段的情況下產(chǎn)生的，不僅為多種致盲性眼底疾病的治療和預防提供了一種新的選擇，而且對自體視網(wǎng)膜組織器官工程和自體視網(wǎng)膜干細胞生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了一種潛在的應用基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述技術(shù)問題或技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是：提供一組使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞的細胞培養(yǎng)液配方；提供一種采用該細胞培養(yǎng)液配方使人的體細胞產(chǎn)生血源性自體視網(wǎng)膜細胞的技術(shù)方法；提供一種制備自體視網(wǎng)膜干細胞的試劑盒。以解決目前視網(wǎng)膜干細胞制備方法中的耗時長、存在免疫排斥反應、不適用于視網(wǎng)膜再生治療、穩(wěn)定性差、污染率高、產(chǎn)量低、致癌風險高以及工藝復雜的諸多問題。

一個方面，本發(fā)明提供了使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體視網(wǎng)膜干細胞的一組培養(yǎng)液，所述的一組培養(yǎng)液包括細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2和細胞培養(yǎng)液a3；

其中，所述的細胞培養(yǎng)液a1為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

1-100μm的rho激酶抑制劑y-27632(c14h21n3o·2hcl)、1-100ng/ml的干細胞因子(scf)、1-100ng/ml的白細胞介素3(il3)、1-100ng/ml的白細胞介素6(il6)、1-100ng/ml的白細胞介素11(il11)、1-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子(m-csf)、1-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子(g-csf)、1-100μg/ml的巖藻多糖、1-100μg/ml的葡聚糖硫酸酯、1-100nm的amd3100(1,1'-[1,4-亞苯基雙(亞甲基)]雙[1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷])、1-100μm的m-阿侖膦酸鈉(m-alendronatesodiumtrihydrate)、1-100μm的氨羥二磷酸二鈉、5-30ng/ml的神經(jīng)生長因子和5-30μm的二甲亞砜(dmso)；

其中，所述的細胞培養(yǎng)液a2為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

1-100ng/ml的dkk1蛋白、1-100ng/ml的noggin蛋白、1-100ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、1-100ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、1-100ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、1-100ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、1-100ng/ml的smad3抑制劑sb431542、1-100ng/ml的lefly蛋白、100-1000nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、10-500nmol/l的激活素a(activina)、1-100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、1-100μm的rho激酶抑制劑y-27632、5-30ng/ml的白細胞介素3(il3)、5-30ng/mll的白細胞介素6(il6)、5-30ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)、1-100ng/ml的干細胞因子(scf)；

其中，所述的細胞培養(yǎng)液a3為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

1-100ng/ml的dkk1蛋白、1-100ng/ml的noggin蛋白、1-100ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、1-100ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、1-100ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、1-100ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、1-100ng/ml的smad3抑制劑sb431542、1-100ng/ml的lefly蛋白、100-1000nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、10-500nmol/l的激活素a(activina)、1-100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、5-30μm的rho激酶抑制劑y-27632、5-30ng/ml的白細胞介素3(il3)、5-30ng/mll的白細胞介素6(il6)、1-100ng/ml的干細胞因子(scf)、1-100ng/ml的成纖維細胞生長因子2(fgf2)、1-100ng/ml的成纖維細胞生長因子8(fgf8)、1-100ng/ml的表皮生長因子(egf)、1-100ng/ml的gsk-3α/β抑制劑chir、1-100ng/ml的tgfβr-1/alk5抑制劑repsox(616452)、1-100ng/ml的fgfr1特異性拮抗劑su5402、1-100ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、1-100ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)、1-100ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(nt-3)、1-100ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和1-100ng/ml的生長因子(gf)。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體視網(wǎng)膜干細胞的一組培養(yǎng)液中：

其中，所述的細胞培養(yǎng)液a1為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

10μm的rho激酶抑制劑y-27632、10ng/ml的干細胞因子、10ng/ml的白細胞介素3、10ng/ml的白細胞介素6、10ng/ml的白細胞介素11、10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子、10ng/ml的粒細胞集落刺激因子、10μg/ml的巖藻多糖、10μg/ml的葡聚糖硫酸酯、10nm的amd3100、10μm的m-阿侖膦酸鈉、10μm的氨羥二磷酸二鈉、10ng/ml的神經(jīng)生長因子和10μm的二甲亞砜；

其中，所述的細胞培養(yǎng)液a2為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

10ng/ml的dkk1蛋白、10ng/ml的noggin蛋白、10ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、10ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、10ng/ml的胰島素樣生長因子、10ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、10ng/ml的smad3抑制劑sb431542、10ng/ml的lefly蛋白、500nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、100nmol/l的激活素a(activina)、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、100μm的rho激酶抑制劑y-27632、10ng/ml的白細胞介素3(il3)、10ng/mll的白細胞介素6(il6)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)和10ng/ml的干細胞因子(scf)；

其中，所述的細胞培養(yǎng)液a3為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

10ng/ml的dkk1蛋白、10ng/ml的noggin蛋白、10ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、10ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、10ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、10ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、10ng/ml的smad3抑制劑sb431542、10ng/ml的lefly蛋白、200nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、100nmol/l的激活素a(activina)、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、10μm的rho激酶抑制劑y-27632、10ng/ml的白細胞介素3(il3)、10ng/mll的白細胞介素6(il6)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)、10ng/ml的干細胞因子(scf)、10ng/ml的成纖維細胞生長因子2(fgf2)、10ng/ml的成纖維細胞生長因子8(fgf8)、10ng/ml的表皮生長因子(egf)、10ng/ml的gsk-3α/β抑制劑chir、10ng/ml的tgfβr-1/alk5抑制劑repsox(616452)、10ng/ml的fgfr1特異性拮抗劑su5402、10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)；10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(nt-3)、10ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和10ng/ml的生長因子(gf)。

另一個方面，本發(fā)明提供了上述細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2和細胞培養(yǎng)液a3在使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體視網(wǎng)膜干細胞中的應用。

再一個方面，本發(fā)明提供了一種用于制備自體視網(wǎng)膜干細胞的試劑盒，所述的試劑盒包括本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2和細胞培養(yǎng)液a3。

進一步地，所述的試劑盒還包括人的體細胞。

更進一步地，所述的試劑盒中的人的體細胞包括但不限于周圍血液細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞。

另一個方面，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病的藥物中的應用。

進一步地，所述的涉及器官再生再造和修復的疾病包括但不限于眼底疾病、眼底損傷、眼底組織衰老。

更進一步地，所述的及器官再生再造和修復的疾病包括但不限于視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和黃斑組織系統(tǒng)等細胞、組織和器官的病理損害、創(chuàng)傷壞死和各種退行性病變。

再一個方面，本發(fā)明提供了一種使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體視網(wǎng)膜干細胞的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：

(1)將自體來源的體細胞作為原料細胞以2×10⁶-5×10⁶的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中；

(2)在37℃和5％的co2的環(huán)境中，將原料細胞在細胞培養(yǎng)液a1中培養(yǎng)1-3天，得到細胞1；所述的細胞培養(yǎng)液a1為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

1-100μm的rho激酶抑制劑y-27632(c14h21n3o·2hcl)、1-100ng/ml的干細胞因子(scf)、1-100ng/ml的白細胞介素3(il3)、1-100ng/ml的白細胞介素6(il6)、1-100ng/ml的白細胞介素11(il11)、1-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子(m-csf)、1-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子(g-csf)、1-100μg/ml的巖藻多糖、1-100μg/ml的葡聚糖硫酸酯、1-100nm的amd3100(1,1'-[1,4-亞苯基雙(亞甲基)]雙[1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷])、1-100μm的m-阿侖膦酸鈉(m-alendronatesodiumtrihydrate)、1-100μm的氨羥二磷酸二鈉、5-30ng/ml的神經(jīng)生長因子、5-30μm的二甲亞砜(dmso)；

(3)在37℃和5％的co2的環(huán)境中，將步驟(2)得到的細胞1再于細胞培養(yǎng)液a2中培養(yǎng)3～6天，得到細胞2；所述的細胞培養(yǎng)液a2為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

1-100ng/ml的dkk1蛋白、1-100ng/ml的noggin蛋白、1-100ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、1-100ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、1-100ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、1-100ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、1-100ng/ml的smad3抑制劑sb431542、1-100ng/ml的lefly蛋白、100-1000nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、10-500nmol/l的激活素a(activina)、1-100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、1-100μm的rho激酶抑制劑y-27632、5-30ng/ml的白細胞介素3(il3)、5-30ng/mll的白細胞介素6(il6)、5-30ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)、1-100ng/ml的干細胞因子(scf)；

(4)在37℃和5％的co2的環(huán)境中，將步驟(3)得到的細胞2再于細胞培養(yǎng)液a3中培養(yǎng)3～6天，得到細胞3，細胞3即為自體視網(wǎng)膜干細胞；所述的細胞培養(yǎng)液a3為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

1-100ng/ml的dkk1蛋白、1-100ng/ml的noggin蛋白、1-100ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、1-100ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、1-100ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、1-100ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、1-100ng/ml的smad3抑制劑sb431542、1-100ng/ml的lefly蛋白、100-1000nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、10-500nmol/l的激活素a(activina)、1-100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、5-30μm的rho激酶抑制劑y-27632、5-30ng/ml的白細胞介素3(il3)、5-30ng/mll的白細胞介素6(il6)、1-100ng/ml的干細胞因子(scf)、1-100ng/ml的成纖維細胞生長因子2(fgf2)、1-100ng/ml的成纖維細胞生長因子8(fgf8)、1-100ng/ml的表皮生長因子(egf)、1-100ng/ml的gsk-3α/β抑制劑chir、1-100ng/ml的tgfβr-1/alk5抑制劑repsox(616452)、1-100ng/ml的fgfr1特異性拮抗劑su5402、1-100ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、1-100ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)、1-100ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(nt-3)、1-100ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、1-100ng/ml的生長因子(gf)。

在一個優(yōu)選地實施方案中，所述的制備方法包括以下步驟：

(1)將自體來源的體細胞作為原料細胞以2×10⁶-5×10⁶的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中；

(2)在37℃和5％的co2的環(huán)境中，將原料細胞在細胞培養(yǎng)液a1中培養(yǎng)3天，得到細胞1；所述的細胞培養(yǎng)液a1為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

10μm的rho激酶抑制劑y-27632(c14h21n3o·2hcl)、10ng/ml的干細胞因子(scf)、10ng/ml的白細胞介素3(il3)、10ng/ml的白細胞介素6(il6)、10ng/ml的白細胞介素11(il11)、10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子(m-csf)、10ng/ml的粒細胞集落刺激因子(g-csf)、10μg/ml的巖藻多糖、10μg/ml的葡聚糖硫酸酯、10nm的amd3100(1,1'-[1,4-亞苯基雙(亞甲基)]雙[1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷])、10μm的m-阿侖膦酸鈉(m-alendronatesodiumtrihydrate)、10μm的氨羥二磷酸二鈉、10ng/ml的神經(jīng)生長因子和10μm的二甲亞砜(dmso)；

(3)在37℃和5％的co2的環(huán)境中，將步驟(2)得到的細胞1再于細胞培養(yǎng)液a2中培養(yǎng)6天，得到細胞2；所述的細胞培養(yǎng)液a2為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

10ng/ml的dkk1蛋白、10ng/ml的noggin蛋白、10ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、10ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、10ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、10ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、10ng/ml的smad3抑制劑sb431542、10ng/ml的lefly蛋白、500nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、100nmol/l的激活素a(activina)、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、100μm的rho激酶抑制劑y-27632、10ng/ml的白細胞介素3(il3)、10ng/mll的白細胞介素6(il6)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)和10ng/ml的干細胞因子(scf)；

(4)在37℃和5％的co2的環(huán)境中，將步驟(3)得到的細胞2再于細胞培養(yǎng)液a3中培養(yǎng)6天，得到細胞3，細胞3即為自體視網(wǎng)膜干細胞；所述的細胞培養(yǎng)液a3為含有以下成分的dmem培養(yǎng)液：

10ng/ml的dkk1蛋白、10ng/ml的noggin蛋白、10ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt、10ng/ml的sonichedgehog蛋白(shh蛋白)、10ng/ml的胰島素樣生長因子(igf)、10ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(cki-7)、10ng/ml的smad3抑制劑sb431542、10ng/ml的lefly蛋白、200nmol/l的視黃酸(retinoicacid)、100nmol/l的激活素a(activina)、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、10μm的rho激酶抑制劑y-27632、10ng/ml的白細胞介素3(il3)、10ng/mll的白細胞介素6(il6)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(ngf)、10ng/ml的干細胞因子(scf)、10ng/ml的成纖維細胞生長因子2(fgf2)、10ng/ml的成纖維細胞生長因子8(fgf8)、10ng/ml的表皮生長因子(egf)、10ng/ml的gsk-3α/β抑制劑chir、10ng/ml的tgfβr-1/alk5抑制劑repsox(616452)、10ng/ml的fgfr1特異性拮抗劑su5402、10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(nt-3)、10ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和10ng/ml的生長因子(gf)。

進一步地，所述的制備方法中，所述的原料細胞包括但不限于人的周圍血細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞。

更進一步地，所述的制備方法中，所述的原料細胞包括但不限于通過商業(yè)途徑得到的非永生化或永生化的人的各種體細胞株，例如周圍血液細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞；常規(guī)血庫保存的各種血液細胞，例如紅細胞、白細胞；新鮮分離制備的人的各種體細胞，例如皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，由上述制備方法制備得到的自體視網(wǎng)膜干細胞可以通過以下方法進行檢測：利用視網(wǎng)膜干細胞的特異細胞表型rx、chx10以及pax6等作為檢測指標，采用細胞形態(tài)學和細胞特異免疫熒光技術(shù)，觀測各種視網(wǎng)膜干細胞的生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度。

另一個方面，本發(fā)明還提供了由上述試劑盒和制備方法制備得到的視網(wǎng)膜干細胞在制備視網(wǎng)膜細胞和視網(wǎng)膜組織工程中的應用。

本發(fā)明所述的gsk-3α/β抑制劑chir為chir99021或chir98014。

本發(fā)明中所述細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2和細胞培養(yǎng)液a3中的涉及到的所有成分可以通過商業(yè)途徑直接購買，也可以從生物體中提??；其中的蛋白質(zhì)類成分還可以是通過基因重組技術(shù)獲得的相應重組蛋白。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具備以下有益效果：

1、應用人自體血液細胞作為原料細胞制備視網(wǎng)膜干細胞，原料來源更加多樣、方便、安全且易獲得。

2、本發(fā)明研發(fā)了一組由各種小分子物質(zhì)組成的能使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞的細胞培養(yǎng)液配方，使得視網(wǎng)膜干細胞的制備更加方便易行，且更加容易進行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

3、本發(fā)明提供的應用小分子物質(zhì)組成的細胞培養(yǎng)液配方，在不改變?nèi)说捏w細胞染色體dna序列，不插入任何外來基因或dna片段的情況下，快速使人的自體血液細胞逆向分化產(chǎn)生人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞，更加安全有效。

4、本發(fā)明提供的制備方法經(jīng)放大實驗后的生產(chǎn)工藝流程可以被嚴格地、多次地、系統(tǒng)地進行流式細胞技術(shù)檢測和免疫細胞化學技術(shù)檢測，因此，作為自體種子細胞和自體再生修復細胞，本發(fā)明還大大具備對自體視網(wǎng)膜干細胞和視網(wǎng)膜細胞進行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

5、與利用基因重組技術(shù)的ips干細胞誘導產(chǎn)生的自體視網(wǎng)膜干細胞相比較，本發(fā)明提供了一種在不改變體細胞染色體dna序列，不插入任何外來基因或dna片段的情況下，本發(fā)明應用多種小分子物質(zhì)組成的一組細胞培養(yǎng)液配方和制備方法，使血液單個核細胞快速逆向分化，生產(chǎn)人自體視網(wǎng)膜干細胞，這是一種新型技術(shù)方法。所生產(chǎn)的人自體視網(wǎng)膜干細胞接近于自然干細胞，且無ips的致癌風險、生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)耗時短、安全性高。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液配方、試劑盒和制備方法技術(shù)獨創(chuàng)新穎，為解決眼科類疾病治療領(lǐng)域目前所存在的困難提供了新的思路和途徑，并解決了人自體視網(wǎng)膜干細胞的方便快捷的來源困難的問題。

6、與利用胚胎干細胞(escs)誘導的異體視網(wǎng)膜干細胞以及臍帶血干細胞/間充質(zhì)干細胞誘導產(chǎn)生的視網(wǎng)膜干細胞技術(shù)相比較，本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)液、試劑盒和制備方法原料來源更簡易方便、生產(chǎn)速度更快、培養(yǎng)時間更短、產(chǎn)量巨大、純度更高、生產(chǎn)更穩(wěn)定、污染機率小、不存在異體免疫排斥問題，且制備得到的自體視網(wǎng)膜干細胞生物特性更加穩(wěn)定。

7、本發(fā)明提供的自體視網(wǎng)膜干細胞的制備方法經(jīng)驗證可備工藝放大，相應地生產(chǎn)技術(shù)和工藝流程可以被嚴格地、多次地、系統(tǒng)地全程監(jiān)控，可以進行規(guī)模性生產(chǎn)，具有大規(guī)模工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)自體視網(wǎng)膜干細胞和視網(wǎng)膜細胞的潛力。因此，在眼科醫(yī)學領(lǐng)域，作為眼底自體種子細胞和再生修復細胞、自體組織器官工程和自體視網(wǎng)膜干細胞生產(chǎn)儲存庫等產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1是實施例3中的原料細胞以及尤其制備得到的人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞的顯微視圖。

圖2是實驗例1中人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞與一抗以及二抗反應后的熒光照片。

具體實施方式

以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應用于符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的范圍。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

以下實施例中未作具體說明的分子生物學試驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行；所述試劑盒生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1使人的體細胞逆向分化產(chǎn)生自體視網(wǎng)膜干細胞的一組培養(yǎng)液

包括細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2和細胞培養(yǎng)液a3。

在10～100級潔凈度的安全操作臺里操作，4～10℃的低溫條件下配制。

細胞培養(yǎng)液a1的配制：

在500mldmem培養(yǎng)液(購自gico公司)中加入以下成分：

10μm的rho激酶抑制劑y-27632(購自sigma公司)、10ng/ml的干細胞因子(購自r&d公司)、10ng/ml的白細胞介素3(購自r&d公司)、10ng/ml的白細胞介素6(購自r&d公司)、10ng/ml的白細胞介素11(購自r&d公司)、10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子(購自r&d公司)、10ng/ml的粒細胞集落刺激因子(購自r&d公司)、10μg/ml的巖藻多糖、(購自sigma公司)10μg/ml的葡聚糖硫酸酯(購自sigma公司)、10nm的amd3100(購自sigma公司)、10μm的m-阿侖膦酸鈉(購自sigma公司)、10μm的氨羥二磷酸二鈉(購自sigma公司)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(購自r&d公司)和10μm的二甲亞砜(購自sigma公司)；充分溶解，然后經(jīng)0.22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液a1。

細胞培養(yǎng)液a2的配制：

在500mldmem培養(yǎng)液(購自gico公司)中加入以下成分：

10ng/ml的dkk1蛋白(購自r&d公司)、10ng/ml的noggin蛋白(購自r&d公司)、10ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt(購自r&d公司)、10ng/ml的sonichedgehog蛋白(購自r&d公司)、10ng/ml的胰島素樣生長因子(購自r&d公司)、10ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(購自sigma公司)、10ng/ml的smad3抑制劑sb431542(購自sigma公司)、10ng/ml的lefly蛋白(購自r&d公司)、500nmol/l的視黃酸(購自sigma公司)、100nmol/l的激活素a(購自r&d公司)、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(購自r&d公司)、100μm的rho激酶抑制劑y-27632(購自sigma公司)、10ng/ml的白細胞介素3(購自r&d公司)、10ng/mll的白細胞介素6(購自r&d公司)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(購自r&d公司)和10ng/ml的干細胞因子(購自r&d公司)；充分溶解，然后經(jīng)0.22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液a2。

細胞培養(yǎng)液a3的配制：

在500mldmem培養(yǎng)液中加入以下成分：

10ng/ml的dkk1蛋白(購自r&d公司)、10ng/ml的noggin蛋白(購自r&d公司)、10ng/ml的γ-分泌酶抑制劑dapt(購自r&d公司)、10ng/ml的sonichedgehog蛋白(購自r&d公司)、10ng/ml的胰島素樣生長因子(購自r&d公司)、10ng/ml的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子7(購自sigma公司)、10ng/ml的smad3抑制劑sb431542(購自sigma公司)、10ng/ml的lefly蛋白(購自r&d公司)、200nmol/l的視黃酸(購自sigma公司)、100nmol/l的激活素a(購自r&d公司)、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(購自r&d公司)、10μm的rho激酶抑制劑y-27632(購自sigma公司)、10ng/ml的白細胞介素3(購自r&d公司)、10ng/mll的白細胞介素6(購自r&d公司)、10ng/ml的神經(jīng)生長因子(購自r&d公司)、10ng/ml的干細胞因子(購自r&d公司)、10ng/ml的成纖維細胞生長因子2(購自r&d公司)、10ng/ml的成纖維細胞生長因子8(購自r&d公司)、10ng/ml的表皮生長因子(購自r&d公司)、10ng/ml的gsk-3α/β抑制劑chir(購自sigma公司)、10ng/ml的tgfβr-1/alk5抑制劑repsox(購自r&d公司)、10ng/ml的fgfr1特異性拮抗劑su5402(購自sigma公司)、10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(購自r&d公司)；10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(購自r&d公司)、10ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子(購自r&d公司)和10ng/ml的生長因子(購自r&d公司)；充分溶解，然后經(jīng)0.22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液a3。

實施例2用于制備自體視網(wǎng)膜干細胞的試劑盒

包括實施例1中的細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2、細胞培養(yǎng)液a3；還包括人的體細胞。

實施例3采用周圍靜脈血制備視網(wǎng)膜干細胞的方法

1、血液樣本來源：無菌采集由科研工作人員捐贈的周圍靜脈血。采集周圍靜脈血前應征得供血本人或直系親屬的同意，并記錄供血本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫(yī)院所有相關(guān)的病毒檢查結(jié)果。

2、分離單個核細胞：血液樣本采用ficoll標準分離技術(shù)分離單個核細胞，作為原料細胞，原料細胞的顯微視圖如圖1-a所示。

3、視網(wǎng)膜干細胞的制備：

采用實施例1制備的細胞培養(yǎng)液a1、細胞培養(yǎng)液a2和細胞培養(yǎng)液a3；

將獲得的單個核細胞以5x10⁶的密度，用細胞培養(yǎng)液a1，在37℃和5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，得到細胞1；然后換用細胞培養(yǎng)液a2，對細胞1以5x10⁶的密度在37℃和5％的co2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)3-6天，得到細胞2；然后換用細胞培養(yǎng)液a3，對細胞2以5x10⁶的密度在37℃和5％的co2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)3-6天，得到細胞3，細胞3即為人血源性自體視網(wǎng)膜干細胞，其顯微視圖如圖1-b和圖1-c所示；輕輕吹打細胞3，使細胞3完全懸浮后，收集細胞3于離心管中，進行離心操作，然后使用生理鹽水對懸浮的細胞3進行清洗操作，重復清洗操作3次后，將細胞3懸浮于生理鹽水中。

實驗例1血源性自體視網(wǎng)膜干細胞的檢測

利用視網(wǎng)膜干細胞的特異細胞表型(rx、chx10和pax6)、色素上皮干細胞的特異細胞表型(mitf)等作為檢測指標，采用細胞免疫熒光技術(shù)檢測實施例3制備的血源性自體視網(wǎng)膜干細胞的陽性率、生成速度、生成率、生成數(shù)量和純度

免疫熒光檢測方法：

將實施例3制備的血源性自體視網(wǎng)膜干細胞涂于聚-d-賴氨酸的載玻片上，用細胞制片離心機在1800rcf下轉(zhuǎn)動拋片2分鐘制成細胞玻片并做好標記，將細胞玻片晾干后存放于-20℃冰箱中凍存；從-20℃冰箱中取出細胞玻片在室溫晾干，在反面用記號筆劃定區(qū)域。然后使用4％多聚甲醛固定，經(jīng)過0.1％的tritonx-100打孔5分鐘以及磷酸鹽緩沖液(pbs，ph值為7.4)的清洗后，使用10％正常山羊血清在室溫的條件下封閉1小時，得到樣品；將第一抗體試劑加入樣品中，所使用的第一抗體為兔抗人ddx4/pax6多克隆抗體(1:100稀釋)，在4℃的條件下使樣品中的抗原與第一抗體反應12小時(過夜)；然后在使用磷酸鹽緩沖液(pbs)清洗樣品后，將與第一抗體相對應的第二抗體加入到樣品中，第二抗體為fitc標記標記的羊抗兔igg(1:200稀釋)使樣品中的第一抗體與第二抗體反應1小時；在室溫的條件下使用dapi(1:1000)進行染核步驟。在使用磷酸鹽緩沖液pbs清洗后，對樣品進行封片劑封片操作，所使用封邊劑為甘油/pbs封片劑(甘油：pbs＝1：9，ph8.0-8.5)。最后使用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，在6-8小時內(nèi)完成各種拍照。

圖2示出了實施例3制得的血源性自體視網(wǎng)膜干細胞在與一抗(兔抗人ddx4/pax6單克隆抗體)及二抗(fitc標記標記的羊抗兔igg)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分，從而說明實施例3中所制得的細胞確系視網(wǎng)膜干細胞。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。