本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞及其制備方法和應用。

背景技術：

隨著腫瘤免疫學理論和臨床技術的發(fā)展，嵌合抗原受體t細胞療法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)(junech,blazarbr,rileyjl.engineeringlymphocytesubsets:tools,trialsandtribulations.natrevimmunol.2009；9:704-16)成為目前最有發(fā)展前景的腫瘤免疫療法之一。car-t細胞療法通過外源基因轉染技術，把識別腫瘤相關抗原的單鏈抗體(singlechainfragmentvariable，scfv)和t細胞活化序列的融合蛋白表達到t細胞表面，使可以特異識別腫瘤相關抗原的scfv通過跨膜區(qū)與t細胞胞內的活化增殖信號域偶聯(lián)。表達car的t細胞以抗原依賴、但非mhc限制的方式結合腫瘤抗原，啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應。第一代嵌合抗原受體(car)由腫瘤相關抗原接合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)以及免疫受體絡氨酸活化基序(itam，通常為cd3ζ或fcεriγ)組成，早期實驗證明了其有效性，然而第一代car只能引起短暫的t細胞增殖和較低的細胞因子分泌，不能提供長時間的t細胞擴增信號和持續(xù)的體內抗腫瘤效應。因此第二代、第三代car引入了共刺激分子信號序列，提高了t細胞的細胞毒活性、增殖性和存活時間，促進了細胞因子釋放。目前，car-t細胞療法在血液腫瘤的治療中取得了良好的療效，在實體瘤的治療方面仍處于研究階段。但是，極少抗原是腫瘤特異性的，car-t會產生一定的脫靶毒性，損傷正常細胞，影響其細胞免疫療效；而且由于腫瘤的異質性，同一個腫瘤往往存在多種腫瘤抗原，因此針對單一腫瘤抗原的car-t療效有限，而且容易復發(fā)。

egfrviii是在人腫瘤中最經(jīng)常出現(xiàn)的突變型egfr，并且在被稱為多形性成膠質細胞瘤的腦腫瘤中尤為普遍。據(jù)報道，egfrviii存在于56％的成膠質細胞瘤，16％的非小細胞肺癌和78％的乳腺癌中(carolj.wikstrand,laurap.hale,etal.monoclonalantibodiesagainstegfrviiiaretumorspecificandreactwithbreastandlungcarcinomasandmalignantgliomas.cancerres.1995jul15；55(14):3140-8)，而未在任何正常組織中發(fā)現(xiàn)該序列。在腦膠質瘤存活≥1年的患者中，egfrviii表達是一個獨立的陰性預后指標(heimbergerab,hlatkyr,sukid,etal.prognosticeffectofepidermalgrowthfactorreceptorandegfrviiiinglioblastomamultiformepatients.clincancerres.2005feb15；11(4):1462-6；heimbergerab1,sukid,yangd,etal.thenaturalhistoryofegfrandegfrviiiinglioblastomapatients.jtranslmed.2005oct19；3:38)。因此，egfrviii是潛在的理想腫瘤靶標。

程序性死亡受體1(pd-1)是由活化的t細胞和b細胞表達的一種關鍵的免疫檢驗點受體，并介導免疫抑制。目前已鑒定出2種pd1細胞表面糖蛋白配體，pd-l1和pd-l2，這兩種配體在抗原呈遞細胞及多種癌癥細胞上表達，并證實該配體在結合pd1后下調t細胞的激活和細胞因子的分泌(freemangj,longaj,iwaiy,etal.engagementofthepd-1immunoinhibitoryreceptorbyanovelb7familymemberleadstonegativeregulationoflymphocyteactivation.jexpmed.2000oct2；192(7):1027-34)。pd-l1在許多癌癥中過表達，并且常常與較差的預后有關(okazakit,honjot.pd-1andpd-1ligands:fromdiscoverytoclinicalapplication.intimmunol.2007jul；19(7):813-24)。另一方面，腫瘤浸潤性t淋巴細胞與正常組織中的t淋巴細胞和外周血t淋巴細胞相比，大多數(shù)腫瘤浸潤性t淋巴細胞主要表達pd-1，這指示腫瘤反應性t細胞上pd-1的上調能促成受損的抗腫瘤免疫應答(ahmadzadehm,johnsonla,heemskerkb,etal.tumorantigen-specificcd8tcellsinfiltratingthetumorexpresshighlevelsofpd-1andarefunctionallyimpaired.blood.2009aug20；114(8):1537-44)。對pd-1/pd-l1相互作用的抑制在臨床前模型中介導較強的抗腫瘤活性(us8008449/us7943743)，對pd1/pd-l1相互作用的抗體抑制劑用于腫瘤治療在臨床試驗階段也取得較理想的效果。目前，fda已批準部分pd1/pd-l1抗體抑制劑用于治療相關腫瘤。

但將抗原受體egfrviii-cd3ζ以及抗原受體pd-l1-4-1bb同時整合入car結構，使其在t細胞表達，構建egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞進行car-t細胞免疫療法尚未有研究報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞，所述的雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞可以特異性識別和殺傷同時表達egfrviii以及pd-l1抗原的腫瘤細胞，具有非常強的特異性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術方案予以實現(xiàn)：

一種雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞，所述t淋巴細胞表面表達雙特異性嵌合抗原受體，其中的雙特異性嵌合抗原為pd-l1和選自如下抗原中的任意一種形成的組合：egfrviii、cd19、cd20、cd22、cd33、cd123、cd30、her2、muc1、psca、gd2、gd3、nkg2d、mesothelin、gpc3、il13rα2、ror1、α-folatereceptor或psma。

優(yōu)選地，所述的雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞，其t淋巴細胞表面表達特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ以及特異性嵌合抗原受體pd-l1-4-1bb。

優(yōu)選地，所述的特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.1所示；

所述的特異性嵌合抗原受體pd-l1-4-1bb的氨基酸序列如seqidno.2所示。

優(yōu)選地，所述的特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ的編碼核苷酸序列如seqidno.5所示；

所述的特異性嵌合抗原受體pd-l1-4-1bb的編碼核苷酸序列如seqidno.6所示。

優(yōu)選地，所述的特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ由cd8α信號肽(cd8αsp)、egfrviii抗體輕鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vl)、linker區(qū)、egfrviii抗體重鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vh)、人cd8α鉸鏈區(qū)(cd8αhinge)、人cd8α跨膜區(qū)(cd8αtm)和免疫受體絡氨酸活化基序cd3ζ串聯(lián)組成；

所述的特異性嵌合抗原受體pd-l1-4-1bb由cd8α信號肽(cd8αsp)、pd-l1抗體輕鏈可變區(qū)(pd-l1scfv-vl)、linker區(qū)、pd-l1抗體重鏈可變區(qū)(pd-l1scfv-vh)、人4-1bb鉸鏈區(qū)(4-1bbhinge)、人4-1bb跨膜區(qū)(4-1bbtm)和4-1bb胞內信號區(qū)串聯(lián)組成。

進一步優(yōu)選地，所述的特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ中，cd8α信號肽的編碼核苷酸序列如seqidno.9所示；egfrviii抗體輕鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.17所示；linker區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.10所示；egfrviii抗體重鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.18所示；人cd8α鉸鏈區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.11所示；人cd8α跨膜區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.12所示；免疫受體絡氨酸活化基序cd3ζ的編碼核苷酸序列如seqidno.13所示；

cd8α信號肽基因的編碼核苷酸序列如seqidno.9所示；pd-l1抗體輕鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.19所示；linker區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.10所示；pd-l1抗體重鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.20所示；人4-1bb鉸鏈區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.14所示；人4-1bb跨膜區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.1所示；4-1bb胞內信號區(qū)的編碼核苷酸序列如seqidno.16所示。

上述雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞的制備方法，其包含如下步驟：

(1)獲取特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ以及pd-l1-4-1bb的核酸序列；

(2)將異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ以及pd-l1-4-1bb的核酸序列分別克隆到表達載體中，獲得egfrviii-cd3ζ以及pd-l1-4-1bb表達質粒；

(3)將表達質粒轉染至293t細胞；包裝獲得病毒顆粒，經(jīng)離心濃縮后獲得慢病毒濃縮液；

(4)慢病毒濃縮液感染t淋巴細胞從而獲得雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞(egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞)。

優(yōu)選地，步驟(2)中的表達載體包含能表達氨基酸序列為seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3以及seqidno.4的編碼基因。

優(yōu)選地，步驟(2)中的表達載體慢病毒載體pcdh-ef1α-gfp或pcdh-ef1α-rfp；獲得pcdh-egfrviii-cd3ζ以及pcdh-pd-l1-4-1bb質粒。

上述雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。

優(yōu)選地，所述的腫瘤為egfrviii以及pd-l1表達陽性的腫瘤。

為了和本發(fā)明所述的雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞作對比，本發(fā)明還提供了分別識別egfrviii抗原以及pd-l1抗原的egfrviii-car-t細胞以及pd-l1-car-t細胞。

所述的egfrviii-car-t細胞表面表達特異性嵌合抗原受體egfrviii-car；所述的pd-l1-car-t細胞表面表達特異性嵌合抗原受體pd-l1-car；所述的egfrviii-car的氨基酸序列如seqidno.3所示，pd-l1-car的氨基酸序列如seqidno.4所示；所述的egfrviii-car的編碼核苷酸序列如seqidno.7所示，pd-l1-car的編碼核苷酸序列如seqidno.8所示。

所述的egfrviii-car由cd8α信號肽(cd8αsp)、egfrviii抗體輕鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vl)、linker區(qū)、egfrviii抗體重鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vh)、人cd8α鉸鏈區(qū)(cd8αhinge)、人cd8α跨膜區(qū)(cd8αtm)、4-1bb胞內信號區(qū)和免疫受體絡氨酸活化基序cd3ζ串聯(lián)組成；

所述的pd-l1-car由cd8α信號肽(cd8αsp)、pd-l1抗體輕鏈可變區(qū)(pd-l1scfv-vl)、linker區(qū)、pd-l抗體重鏈可變區(qū)(pd-l1scfv-vh)、人cd8α鉸鏈區(qū)(cd8αhinge)、人cd8α跨膜區(qū)(cd8αtm)、4-1bb胞內信號區(qū)和免疫受體絡氨酸活化基序cd3ζ串聯(lián)構成。

本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種全新的雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞，所述的雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞可以特異性識別和殺傷同時表達egfrviii以及pd-l1抗原的腫瘤細胞，對表達任一種腫瘤抗原的細胞無明顯殺傷作用，可以克服現(xiàn)有car-t細胞療法由于靶抗原不完全特異而引起的脫靶毒性，更加特異性的識別并殺傷腫瘤細胞。

附圖說明

圖1為特異性嵌合抗原受體egfrviii-cd3ζ、pd-l1-4-1bb、egfrviii-car以及pd-l1-car的結構示意圖。

圖2為本發(fā)明所述的雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞構型圖。

圖3為pcdh-egfrviii-cd3ζ、pcdh-pd-l1-4-1bb、pcdh-egfrviii-car以及pcdh-pd-l1-car慢病毒表達載體質粒信息圖。

圖4為腦膠質瘤細胞系u251細胞及過表達細胞表面靶抗原的細胞egfrviii及pd-l1的表達情況。

圖5為體外情況下，本發(fā)明的egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞與egfrviii/pd-l1表達不同的u251細胞共培養(yǎng)后活化情況。

圖6為體外情況下，本發(fā)明的egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞殺傷u251腫瘤細胞的效果。

圖7為小鼠腦膠質瘤模型中小鼠腫瘤體積變化。

圖8為小鼠腦膠質瘤模型中小鼠生存曲線圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

以下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規(guī)方法。下述實施例中所

用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到，其中：

dmem培養(yǎng)基、rpmi-1640培養(yǎng)基購自hyclone公司。

t4dna連接酶、限制性核酸內切酶ecori、xbai購自thermofisherscientific公司。

瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒、普通dna產物純化試劑盒、質粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

pcdh-ef1α-gfp/pcdh-ef1α-rfp及其包裝質粒plp1、plp2、plp/vsvg是由購自addgene公司的慢病毒載體改構而成。

trans1-t1phageresistant化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

lipofectaminetm2000transfectionreagent轉染試劑購自invitrogen公司。

293t包裝細胞、bhk21乳倉鼠腎成纖維細胞和u251腦膠質瘤細胞購自美國atcc。

胎牛血清購自gibco公司。

所有引物及基因合成均由上海生工生物科技有限公司合成。

peg6000和nacl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

人rhil-2、cd3/cd28抗體等購自ebioscience公司。

retronectin購自takara公司。

抗pd-l1、cd3、cd25等流式抗體購自biolegend公司。

t細胞分選試劑盒購自miltenyibiotec公司。

nsg小鼠購自北京維通達生物技術有限公司。

實施例1egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb基因序列的確定

1.1從美國國立醫(yī)學圖書館網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)genbank數(shù)據(jù)庫獲得人cd8α信號肽基因(seqidno.9)、linker區(qū)(gly4-ser)3(seqidno.10)、人cd8α鉸鏈區(qū)(cd8αhinge)(seqidno.11)、人cd8α跨膜區(qū)(cd8αtm)(seqidno.12)、免疫受體絡氨酸活化基序cd3ζ(seqidno.13)、人4-1bb鉸鏈區(qū)(4-1bbhinge)(seqidno.14)、人4-1bb跨膜區(qū)(4-1bbtm)(seqidno.15)和4-1bb胞內信號區(qū)(seqidno.16)序列，結合egfrviii抗體輕鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vl)(seqidno.17)、egfrviii抗體重鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vh)(seqidno.18)、pd-l1抗體輕鏈可變區(qū)(pd-l1scfv-vl)(seqidno.19)、pd-l1抗體重鏈可變區(qū)(pd-l1scfv-vh)(seqidno.20)序列，組合而成完整的egfrviii-cd3ζ(seqidno.5)、pd-l1-4-1bb(seqidno.6)、egfrviii-car(seqidno.7)、pd-l1-car(seqidno.8)序列信息。egfrviii-cd3ζ、pd-l1-4-1bb、egfrviii-car以及pd-l1-car結構見圖1。

實施例2pcdh-egfrviii-cd3ζ、pcdh-pd-l1-4-1bb、pcdh-egfrviii-car及pcdh-pd-l1-car質粒的構建

2.1全基因合成：

由上海生工生物科技有限公司合成完整的egfrviii-cd3ζ(seqidno.5)、pd-l1-4-1bb(seqidno.6)、egfrviii-car(seqidno.7)、pd-l1-car(seqidno.8)序列，并分別在其5’端添加xbai酶切位點，3’端添加ecori酶切位點。

2.2將egfrviii-cd3ζ、pd-l1-4-1bb、egfrviii-car以及pd-l1-car分別克隆到pcdh-ef1α-gfp或pcdh-ef1α-rfp慢病毒表達載體中。具體如下：將pcdh-ef1α-gfp載體、pcdh-ef1α-rfp載體、egfrviii-cd3ζ片段、pd-l1-4-1bb片段、egfrviii-car片段、pd-l1-car片段分別用xbai/ecori酶切，分別回收8192bp、8111bp、1297bp、1258bp、1483bp、1477bp片段。分別使用t4dna連接酶連接酶切后的pcdh-ef1α-gfp載體與egfrviii-cd3ζ、egfrviii-car、pd-l1-car，pcdh-ef1α-rfp載體與pd-l1-4-1bb，用連接產物轉化trans1-t1感受態(tài)過夜培養(yǎng)，挑取單克隆培養(yǎng)提取質粒并測序，獲得pcdh-egfrviii-cd3ζ、pcdh-pd-l1-4-1bb、pcdh-egfrviii-car及pcdh-pd-l1-car質粒。慢病毒表達載體質粒信息見圖3。

實施例3慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定

3.1慢病毒的包裝：

3.1.1細胞處理：轉染前24h收集處于對數(shù)生長期的第3-10代293t細胞，將293t細胞接種于10cm細胞培養(yǎng)皿中，接種量為1×10^7，細胞在含有10ml10％fbs的dmem培養(yǎng)基中生長，置于37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時，細胞密度達到60-80％即可進行轉染。

3.1.2向293t細胞中共轉染慢病毒表達載體質粒(pcdh-egfrviii-cd3ζ、pcdh-pd-l1-4-1bb、pcdh-egfrviii-car、pcdh-pd-l1-car)及其包裝質粒(plp1，plp2，plp/vsvg)；

3.1.3轉染后24小時，于熒光顯微鏡下觀察293t細胞轉染后gfp/rfp熒光表達情況。分別于轉染后48小時、72小時收集293t培養(yǎng)上清中，3000rpm離心15分鐘，分別收集細胞及上清，反復凍融三次裂解細胞，離心收集上清；

3.1.4用0.45μm濾器過濾病毒上清，分別獲得pcdh-egfrviii-cd3ζ、pcdh-pd-l1-4-1bb、pcdh-egfrviii-car、pcdh-pd-l1-car病毒溶液。

3.2慢病毒的濃縮及病毒滴度測定

3.2.1分別收集細胞及培養(yǎng)上清，使用peg6000濃縮病毒，向病毒溶液中加入1/4體積的peg6000/nacl溶液(25％peg6000+4.4％nacl)，混勻，4℃靜置1小時；

3.2.2于4℃，5000rpm離心30分鐘；

3.2.3棄上清，加入2ml病毒溶解液(10mmtris-hcl(ph8.0)，2mmmgcl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并于-80℃儲存。得慢病毒濃縮液。

3.2.4測定病毒滴度。預先接種bhk21細胞至24孔板，10^5/孔，置于37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時；

3.2.5溶解病毒，準備從10^-2到10^-7的10倍稀釋病毒樣品；

3.2.6去除細胞培養(yǎng)液，加入含有不同病毒量的細胞培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時；

3.2.7去除細胞培養(yǎng)液，加入1％fbs的dmem培養(yǎng)液，置于37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時；

3.2.8去除細胞培養(yǎng)液，加入含2ug/ml嘌呤霉素、1％fbs的dmem培養(yǎng)液，置于37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時；

3.2.9去除細胞培養(yǎng)液，加入結晶紫染色液，計數(shù)被染色克隆數(shù)，并計算病毒滴度。

3.2.10將病毒稀釋至10^7tu/ml，于-80℃儲存。

實施例4t細胞的分離培養(yǎng)及慢病毒轉導t細胞

4.1使用淋巴細胞分離液ficoll密度梯度離心獲得人pbmc細胞；

4.2使用miltenyibiotec公司的t細胞分離試劑從人pbmc細胞中分離獲得t淋巴細胞；

4.3向細胞中加入cd3/cd28磁珠，將細胞置于rpmi-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時；

4.4將細胞轉入retronectin預包被的moi＝10的慢病毒(裝有慢病毒濃縮液)培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％co2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4.5流式細胞儀檢測t細胞表面gfp及rfp的表達。制備得到egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞、egfrviii-car-t細胞以及pd-l1-car-t細胞。所述的egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞的構型圖見圖2所示。

實施例5體外共培養(yǎng)測定car-t細胞的激活及體外殺傷活性

5.1分析car-t細胞激活

5.1.1細胞處理：分別對egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞及u251細胞進行計數(shù)；

5.1.2將egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞與u251細胞按3：1比例混合，置于37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時；

5.1.3收集細胞后，1000rpm離心10min，pbs洗滌1次，用pbs重懸細胞，分別使用抗人cd3/cd25抗體染色，檢測t細胞表面的活化標志cd25的表達水平。結果見圖4和圖5。

在圖4中，a為腦膠質瘤細胞系u251；b為過表達egfrviii的u251細胞(u251(+/-))；c為過表達pd-l1的u251細胞(u251(-/+))；d為同時過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞(u251(+/+))。如圖所見，u251細胞不表達egfrviii，低表達pd-l1，經(jīng)轉導egfrviii和pd-l1基因后，細胞表面同時高表達egfrviii和pd-l1。

在圖5中，a為腦膠質瘤細胞系u251；b為過表達egfrviii的u251細胞(u251(+/-))；c為過表達pd-l1的u251細胞(u251(-/+))；d為同時過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞(u251(+/+))；egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞與u251細胞體外共培養(yǎng)48h后，流式細胞術檢測t細胞活化標志物cd25的表達；如圖所示，同時過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞可以極大限度的激活car-t細胞，而單陽性egfrviii/pd-l1的u251細胞激活car-t細胞效果不佳，提示egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞脫靶毒性低，僅對egfrviii/pd-l1雙陽性細胞進行有效殺傷。

5.2分析car-t細胞體外殺傷活性

5.1.1將egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞、egfrviii-car-t細胞、pd-l1-car-t細胞及u251細胞按3：1混合培養(yǎng)48小時；

5.1.2收集細胞后，1000rpm離心10min，pbs洗滌1次，用pbs重懸細胞，分別使用7aad染色，檢測car-t細胞殺傷腫瘤細胞活性。結果見圖6，在圖6中，a為體外培養(yǎng)的t細胞；b為轉導egfrviii-car的t細胞；c為轉導pd-l1-car的t細胞；d為同時轉導egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb的t細胞(即本發(fā)明所述的egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞)。如圖所示，egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞可以殺傷egfrviii/pd-l1雙陽性細胞，對表達其中任一抗原的細胞系殺傷效果較弱。

實施例6體內car-t細胞的抗腫瘤作用

將25只6-8周齡的nsg小鼠隨機分為五組，分別在皮下植入5x10^5u251(+/+)細胞、u251細胞、u251(+/-)細胞、u251(-/+)細胞、u251(+/+)細胞，觀察和測量腫瘤生長情況，直至腫瘤生長至200mm³，分別通過尾靜脈注射10^6egfrviii-cd3ζ+pd-l1-4-1bb-car-t細胞，觀察并記錄腫瘤體積的變化。結果見圖7，在圖7中，a為植入過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞(u251(+/+))，注射pbs對照；b為植入腦膠質瘤細胞系u251；c為植入過表達egfrviii的u251細胞(u251(+/-))；d為植入過表達pd-l1的u251細胞(u251(-/+))；e為植入過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞(u251(+/+))；b/c/d/e組分別注射egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞進行治療。由圖可得，在進行egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t治療后，植入過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞組的小鼠腫瘤得到明顯抑制，隨著時間延長，腫瘤體積明顯縮小直至消失；而植入單陽性腫瘤細胞(即單獨植入過表達egfrviii或植入過表達pd-l1)組小鼠出現(xiàn)腫瘤生長抑制或腫瘤縮小情況，但隨著時間延長，腫瘤繼續(xù)增長，與植入u251細胞組無明顯差異。

car-t細胞治療腦膠質瘤小鼠模型效果測定：在用car-t細胞治療后，觀察和測量腫瘤的生長，并記錄小鼠存活率。結果見圖8，在圖8中，a為植入過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞(u251(+/+))，注射pbs對照；b為植入腦膠質瘤細胞系u251；c為植入過表達egfrviii的u251細胞(u251(+/-))；d為植入過表達pd-l1的u251細胞(u251(-/+))；e為植入過表達egfrviii和pd-l1的u251細胞(u251(+/+))；b/c/d/e組分別注射egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞進行治療。由圖可得，egfrviii-cd3ζ/pd-l1-4-1bb-car-t細胞治療egfrviii/pd-l1雙抗原組小鼠完全成活，而其他組小鼠由于腫瘤體積過大而死亡或實施安樂死。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

sequencelisting

<110>時力生物科技（北京）有限公司

<120>一種雙特異性嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞及其制備方法和應用

<130>

<160>20

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>428

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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151015

hisalaalaargprogluileglnleuvalglnserglyalagluval

202530

lyslysproglygluserleuargilesercyslysglyserglyphe

354045

asnilegluasptyrtyrilehistrpvalargglnmetproglylys

505560

glyleuglutrpmetglyargileaspprogluasnaspgluthrlys

65707580

tyrglyproilepheglnglyhisvalthrileseralaaspthrser

859095

ileasnthrvaltyrleuglntrpserserleulysalaseraspthr

100105110

alamettyrtyrcysalapheargglyglyvaltyrtrpglyglngly

115120125

thrthrvalthrvalserseraspvalvalmetthrglnserproasp

130135140

serleualavalserleuglygluargalathrileasncyslysser

145150155160

serglnserleuleuaspseraspglylysthrtyrleuasntrpleu

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glnglnlysproglyglnproprolysargleuileserleuvalser

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lysleuaspserglyvalproaspargpheserglyserglysergly

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valtyrtyrcystrpglnglythrhispheproglythrpheglygly

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glythrlysvalgluilelysthrthrthrproalaproargpropro

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thrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargproglu

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valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysargvallysphe

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serargseralaaspalaproalatyrlysglnglyglnasnglnleu

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argglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

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gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

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serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheseraspser

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trpilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

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alatrpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspserval

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lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr

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leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

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alaargarghistrpproglyglypheasptyrtrpglyglnglythr

245250255

leuvalthrvalseralaserthrlysalailegluvalmettyrpro

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proprotyrleuaspasnglulysserasnglythrileilehisval

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lysglylyshisleucysproserproleupheproglyproserlys

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prophetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrser

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leuleuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysarg

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serargleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargpro

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glyprothrarglyshistyrglnprotyralaproproargaspphe

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alaalatyrargserlysargglyarglyslysleuleutyrilephe

370375380

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cyssercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleu

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thrthrvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

130135140

serglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspvalvalmetthr

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leuasntrpleuglnglnlysproglyglnproprolysargleuile

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serleuvalserlysleuaspserglyvalproaspargphesergly

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lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

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aag363