本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種竹節(jié)蝦抗氧化肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
：竹節(jié)蝦(penaeusjaponicus)學(xué)名日本對蝦，隸屬于十足目、對蝦科，是世界上三大養(yǎng)殖蝦類中養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量最大的對蝦養(yǎng)殖品種，因其色彩艷麗且呈斑節(jié)狀，故而得名，有“蝦后”之譽。竹節(jié)蝦不僅個體大，而且肉質(zhì)鮮美，是海產(chǎn)品中的精品，因此很適合做壽司蝦等產(chǎn)品。目前，竹節(jié)蝦大多數(shù)被加工成去頭速凍蝦肉制品，用于內(nèi)銷或出口，以致在加工過程中大約有35％的蝦頭下腳料產(chǎn)生，其中，蝦頭肉約占蝦頭下腳料重量的30％。由于蝦頭中含胃囊、口器等砂石硬質(zhì)成分，無法直接食用，因此，如何對竹節(jié)蝦加工中的蝦頭副產(chǎn)物進行深加工以提高產(chǎn)品附加值是目前亟待解決的問題。目前國內(nèi)外學(xué)者對竹節(jié)蝦的研究大多集中于育苗、養(yǎng)殖、生物學(xué)形態(tài)和習(xí)性等方面，如申請?zhí)枮?01410346224.8(公開號為cn104115772a)的中國發(fā)明專利《一種竹節(jié)蝦的淡水養(yǎng)殖池管理方法》?？寡趸允墙陙韲鴥?nèi)外科學(xué)工作者對多肽生物活性研究中的一個新課題，來源于食物蛋白的抗氧化肽，不但具有良好的抗氧化活性，而且安全性極高，因而在保健食品以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。例如：專利號為zl201210230756.6(授權(quán)公告號為cn103524596a)的中國發(fā)明專利《一種鯊魚蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途》、專利號為zl201310152590.5(授權(quán)公告號為cn103194519a)的中國發(fā)明專利《一種豌豆蛋白酶解制備抗氧化肽的方法及應(yīng)用》等專利均公開了食物蛋白來源的抗氧化肽。然而，目前未有利用竹節(jié)蝦蝦頭提取分離抗氧化肽的研究報道，而對竹節(jié)蝦蝦頭的抗氧化成分進行研究，不僅能充分利用竹節(jié)蝦蝦頭下腳料，提高竹節(jié)蝦的產(chǎn)品附加值，而且對拓展抗氧化肽的研究具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種抗氧化活性強的竹節(jié)蝦抗氧化肽。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述竹節(jié)蝦抗氧化肽的制備方法。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種提高竹節(jié)蝦抗氧化肽在生物體內(nèi)穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明解決上述第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種竹節(jié)蝦抗氧化肽，其特征在于，所述竹節(jié)蝦抗氧化肽的氨基酸序列為gly-asn-gly-leu-pro。本發(fā)明解決上述第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種如上所述的竹節(jié)蝦抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：(1)原料預(yù)處理：將竹節(jié)蝦蝦頭清洗干凈，去除脂質(zhì)成分，勻漿絞成漿液備用；(2)超聲波輔助酶解：向上述漿液加入超純水制成溶液料液比為1:6～14w/v，調(diào)節(jié)ph值至中性，加入中性蛋白酶，45～65℃下超聲波輔助酶解20～60min，酶解結(jié)束后，沸水滅活，離心取上清液得酶解溶液；(3)超濾處理：將上述酶解溶液經(jīng)超濾分離后，得分子量大于10kda組、分子量范圍為5～10kda組、分子量范圍為3～15kda組以及分子量小于3kda組，凍干后分別測定各組的dpph清除率及還原力；(4)凝膠柱處理：在濾膜超濾分離后獲得的各組中，選取dpph清除率最高的組分加超純水配制成溶液，脫鹽后，經(jīng)sephadexg-25凝膠柱分離純化，收集各峰，凍干后測定各組的dpph清除率；(5)反相高效液相色譜處理：在凝膠柱分離后獲得的各組中，選取dpph清除率最高的組分加超純水配制成溶液，經(jīng)濾膜過濾后用反相高效液相進行分離純化，收集各洗脫峰，濃縮后分別測定各組的dpph清除率，其中dpph清除率最高的組即為所需的竹節(jié)蝦抗氧化肽。作為優(yōu)選，所述步驟(2)中，超聲頻率為10～30khz。作為優(yōu)選，所述步驟(4)中，洗脫液為超純水，流速為1.0ml·min-1。作為優(yōu)選，所述步驟(5)中，反相高效液相色譜的色譜條件為：采用c18色譜柱4.6×250mm，5μm，a相為含0.1％三氟乙酸的乙腈，b相為含0.1％三氟乙酸的超純水，柱溫25℃，流速1.0ml·min-1，洗脫過程為：0％～100％b洗脫8min，15％～85％b洗脫17min，30％～70％b洗脫10min，0％～100％b洗脫5min。本發(fā)明解決第三個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種提高如上所述的竹節(jié)蝦抗氧化肽在生物體內(nèi)穩(wěn)定性的方法，其特征在于，將所述竹節(jié)蝦抗氧化肽和雞卵清蛋白分別配置成同濃度的溶液，在配置的竹節(jié)蝦抗氧化肽溶液中加入雞卵清蛋白溶液，且雞卵清蛋白溶液與該竹節(jié)蝦抗氧化肽溶液的體積比為1:4～6。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供了一種全新的竹節(jié)蝦抗氧化肽，其具有較強的抗氧化活性且dpph清除率可達85％以上，可廣泛應(yīng)用于各種抗氧化產(chǎn)品中；本發(fā)明以竹節(jié)蝦蝦頭為原料，來源廣，成本低，解決了竹節(jié)蝦加工過程中產(chǎn)生的下腳料問題，對進一步提高竹節(jié)蝦的經(jīng)濟價值具有的理論意義，此外，本發(fā)明將超聲波處理和蛋白酶酶解結(jié)合，提高水解率，充分提取原料中的有效成分，提高得率，且提取方式溫和，不會對待提取的有效成分造成破壞，同時通過多重分離純化、逐步篩選，獲得結(jié)構(gòu)可靠的竹節(jié)蝦抗氧化肽。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中一定時間段內(nèi)不同水解蛋白酶的水解度變化示意圖；圖2為本發(fā)明實施例1中一定時間段內(nèi)不同水解蛋白酶的dpph清除率變化示意圖；圖3為本發(fā)明實施例1中超聲溫度對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響；圖4為本發(fā)明實施例1中超聲時間對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響；圖5為本發(fā)明實施例1中超聲頻率對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響；圖6為本發(fā)明實施例1中料液比對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響；圖7為本發(fā)明實施例1中超聲時間和超聲溫度對酶解產(chǎn)物dpph清除率影響的響應(yīng)分析結(jié)果圖；圖8為本發(fā)明實施例1中超聲頻率和超聲溫度對酶解產(chǎn)物dpph清除率影響的響應(yīng)分析結(jié)果圖；圖9為本發(fā)明實施例1中料液比和超聲溫度對酶解產(chǎn)物dpph清除率影響的響應(yīng)分析結(jié)果圖；圖10為本發(fā)明實施例1中超聲頻率和超聲時間對酶解產(chǎn)物dpph清除率影響的響應(yīng)分析結(jié)果圖；圖11為本發(fā)明實施例1中料液比和超聲時間對酶解產(chǎn)物dpph清除率影響的響應(yīng)分析結(jié)果圖；圖12為本發(fā)明實施例1中料液比和超聲頻率對酶解產(chǎn)物dpph清除率影響的響應(yīng)分析結(jié)果圖；圖13為本發(fā)明實施例1中shp4組分的sephadexg-25層析圖；圖14為本發(fā)明實施例1中shp4組分的sephadexg-25層析后各峰的dpph清除率；圖15為本發(fā)明實施例1中shp4-ii組分的反相高效液相分離圖譜；圖16為本發(fā)明實施例1中shp-d組分的反相高效液相分離圖譜；圖17為本發(fā)明實施例2中shp-d組分一級質(zhì)譜總離子流圖；圖18為本發(fā)明實施例2中shp-d組分分離純化后的多肽質(zhì)譜圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。實施例1：竹節(jié)蝦抗氧化肽的制備1.1原料與試劑原料：竹節(jié)蝦蝦頭，購自舟山海圣生物有限公司。試劑：胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶，上述蛋白酶均購于廣西南寧龐博生物工程有限公司；gly、gly-gly-gly、維生素b12、抑肽酶、細(xì)胞色素c、牛血清白蛋白，乙腈(色譜級)、三氟乙酸(色譜級)、甲酸(色譜級)、色譜柱填料sephadexg-25(美國sigma公司)；無水乙醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)、鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。1.2儀器與設(shè)備waterssynapt超高壓液相色譜四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(美國waters公司)；uplcbehc18柱(2.lid×120mm)(美國waters公司)；sunfiretmc18柱(4.6×250mm)(美國waters公司)；allianncee2695高效液相色譜儀(美國waters公司)；aktapurifier100蛋白純化系統(tǒng)(瑞典amershambiosciences公司)；hitraptmdesalting預(yù)裝柱(美國ge公司)；2.6×100cm層析柱(北京滿倉科技有限公司)；pellicontm-2miniholdercatalogxx42pmini超濾設(shè)備(美國millipore公司)；bt4k-zl型冷凍干燥機(美國virtis公司)；dl-720a超聲波清洗器(上海雙旭電子有限公司)；uv-8900紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；fj300sh數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(上海隆括儀器設(shè)備有限公司)。1.3竹節(jié)蝦抗氧化肽的提取分離(1)原料預(yù)處理：將竹節(jié)蝦蝦頭清洗干凈，去除蝦黃等脂質(zhì)成分，用高速勻質(zhì)機勻漿絞成漿液備用。(2)超聲波輔助酶解：采用連續(xù)超聲輔助酶解方式，并且通過超級恒溫水浴實時控制超聲輔助酶解溫度，具體過程為：向上述漿液加入超純水制成溶液，料液比為1:6～14w/v，并調(diào)節(jié)ph值至中性，加入中性蛋白酶，45～65℃下超聲波輔助酶解20～60min，，酶解結(jié)束后，沸水浴10min滅活，離心(4000r/min，10min)取上清液得酶解溶液(命名為shp)，若離心后上清液中漂浮有少量油脂，可用吸管吸除。(3)超濾處理：將上述酶解溶液通過0.45μm濾膜微濾分離，先后截留分子量為10kda、5kda和3kda的超濾組分，得分子量大于10kda組、分子量范圍為5～10kda組、分子量范圍為3～15kda組以及分子量小于3kda組，凍干后分別測定各組的dpph清除率。其中dpph清除率的測定方法如下：取1ml水解液，加入1ml新配制濃度為0.1mmol/l的dpph乙醇溶液，混勻后在室溫避光條件下反應(yīng)20min，在517nm處測定吸光值為as；空白組為1ml無水乙醇代替dpph溶液，測吸光值為ax；對照組為1ml蒸餾水代替樣品，測定吸光值為ao；以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液進行空白調(diào)零。所有測定值均為三次平均值，dpph自由基的清除率(dsa)計算公式為：dsa＝[1-(as-ax)/ao]×100％(4)凝膠柱處理：在超濾分離后獲得的各組中，選取dpph清除率最高的組加超純水配制成溶液，經(jīng)hitraptmdesalting預(yù)裝柱脫鹽后，經(jīng)sephadexg-25凝膠柱分離純化，收集各峰，凍干后測定各組的dpph清除率，其中凝膠柱分離純化中洗脫液為超純水，流速為1.0ml·min-1。(5)反相高效液相色譜處理：在凝膠柱分離后獲得的各組中，選取dpph清除率最高的組分加超純水配制成溶液，經(jīng)濾膜過濾后用反相高效液相進行分離純化，收集各洗脫峰，濃縮后分別測定各組的dpph清除率，其中dpph清除率最高的組即為所需的竹節(jié)蝦抗氧化肽。反相高效液相色譜的色譜條件為：采用c18色譜柱4.6×250mm，5μm，a相為含0.1％三氟乙酸的乙腈，b相為含0.1％三氟乙酸的超純水，柱溫25℃，流速1.0ml·min-1，洗脫條件如表1所述。表1rp-hplc洗脫條件時間/min流速/(ml·min-1)a/％b/％01.0010081.00100251.01585351.03070401.001001.3.1水解酶的篩選選擇胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶五種蛋白水解酶，上述五種蛋白水解酶分別在各自最適條件下酶解竹節(jié)蝦頭，1～8h范圍內(nèi)各時間點酶解竹節(jié)蝦頭的水解度和dpph自由基清除能力變化分別如圖1和圖2所示。由圖1可見，中性蛋白酶酶解得到的酶解液和堿性蛋白酶得到酶解液水解度相當(dāng)。由圖2可見，中性蛋白酶在其最適條件下的達到酶解過程中酶解液的dpph自由基清除能力最好。綜上所述，中性蛋白酶是竹節(jié)蝦頭抗氧化活性肽較為理想的蛋白酶。1.3.2超聲條件的確定(1)超聲溫度對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響：在超聲時間為40min、超聲頻率為20khz、料液比為1:8(w/v)的條件下，超聲溫度分別設(shè)定為45℃、50℃、55℃、60℃、65℃。(2)超聲時間對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響：在超聲溫度為55℃、超聲頻率為20khz、料液比為1:8(w/v)的條件下，超聲時間分別設(shè)定為20min、30min、40min、50min、60min。(3)超聲頻率對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響：在超聲溫度為55℃、料液比為1:8(w/v)，超聲時間為40min的條件下，超聲頻率分別設(shè)定為10khz、15khz、20khz、25khz、30khz，。(4)料液比對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響：在超聲溫度為55℃、超聲時間為40min、超聲頻率為20khz的條件下，將料液比分別設(shè)定為1:6、1:8、1:10、1:12、1:14(w/v)。每組優(yōu)化實驗均進行三次平行實驗，最終取平均值。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用design-expert.8.0.5b軟件進一步優(yōu)化，以超聲溫度、超聲時間、超聲頻率、料液比4個因素為自變量，酶解產(chǎn)物的dpph清除率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平試驗，因素水平見表2。表2響應(yīng)面試驗設(shè)計超聲溫度對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響如圖3所示，由圖3可知，超聲溫度對dpph清除率及水解度有較大的影響。當(dāng)超聲溫度小于55℃時，酶解產(chǎn)物的水解度隨著溫度的升高而增加，至55℃時，其水解度達到最高值(54.05％)，超過55℃時，水解度隨著溫度的升高呈下降趨勢。當(dāng)超聲溫度為55、60℃時，dpph清除率分別為61.26％、62.00％，兩者無顯著性差異。這是因為適當(dāng)?shù)纳郎乜梢源龠M酶的活力，使水解更加充分，但過高的溫度則會抑制酶活。綜合考慮，本發(fā)明選擇55℃為適宜的超聲溫度。超聲時間對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響如圖4所示，由圖4可知，在超聲時間為20～60min的時間范圍內(nèi)，蝦頭酶解產(chǎn)物的dpph清除率和水解度均呈先上升后下降的趨勢。這是因為時間過短會導(dǎo)致酶解反應(yīng)不夠充分，而時間過長酶解產(chǎn)物則容易轉(zhuǎn)化為其他副產(chǎn)物，影響其得率。當(dāng)超聲時間為40min時，兩者均達到最高值，水解度為51.28％，dpph清除率為67.72％。因此，本發(fā)明選擇40min為最佳超聲時間。超聲頻率對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響如圖5所示，圖5可知，隨著超聲頻率的增加，竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物的dpph清除率和水解度先升高后降低，當(dāng)超聲頻率為20khz時，水解度和dpph清除率最高，分別為55.15％和62.21％。這是因為隨著超聲頻率的增加，酶和底物碰撞頻率也隨之增加，最終加快了酶解反應(yīng)速率，但是若超聲頻率過大時，酶構(gòu)象會發(fā)生改變，反而降低酶活，影響了酶解效果。因此，本發(fā)明選擇20khz為最佳超聲頻率。料液比對竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物dpph清除率和水解度的影響如圖6所示，圖6可知，當(dāng)料液比小于1:10(w/v)時，竹節(jié)蝦蝦頭酶解產(chǎn)物的dpph清除率隨著料液比的增加不斷增大，當(dāng)料液比大于1:10(w/v)時，dpph清除率則不斷減小。在料液比在1:6～1:8(w/v)的范圍內(nèi)，蝦頭酶解產(chǎn)物的水解度呈上升趨勢，當(dāng)料液比大于1:8(w/v)時，則水解度幾乎不再增加。一般情況下，料液比過大或過小都會影響酶催化速度以及產(chǎn)物分子的擴散。綜合考慮，本發(fā)明選取料液比1:10(w/v)較適宜，并且當(dāng)料液比為1:10(w/v)時，dpph清除率為64.66％，水解度為55.67％。1.3.3竹節(jié)蝦蝦頭酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化(1)響應(yīng)面分析及回歸模型綜合前期的單因素試驗結(jié)果，選擇超聲溫度(a)、超聲時間(b)、超聲頻率(c)、料液比(d)作為變量，以design-expert.8.0.5b軟件設(shè)計中心組合試驗，探究酶解的最佳工藝，試驗次數(shù)為29，其中5個為中心點，試驗設(shè)計和結(jié)果如表3所示。對酶解數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，擬合得到二次回歸方程：y＝68.40+1.27a+0.80b+3.81c-3.94d+3.52ac-11.68cd-14.43a2-11.57b2-11.23c2-14.63d2。表3中心組合設(shè)計及結(jié)果將上述二次回歸方程進行方差分析檢驗，由表4方差分析的影響因素結(jié)果可知，超聲溫度(a)、超聲時間(b)、超聲頻率(c)、料液比(d)4個因素在酶解過程中均起重要作用。模型f值42.27(p<0.0001)，表明該二次方程模型顯著，失擬項p＝0.1353>0.05，表明失擬性不顯著，綜上所述，回歸方程對實際試驗的擬合度較高，此方程可應(yīng)用于實際試驗。通過3d響應(yīng)面圖可以更清晰比較各個因素對響應(yīng)值的影響程度。由圖7～圖12的design-expert.8.0.5b軟件處理得到的響應(yīng)面分析結(jié)果可知，該模型存在最大值。根據(jù)所得模型對各因素進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：超聲溫度55.35℃，超聲時間40.60min，超聲頻率21.55khz，料液比1:9.48(w/v)，此條件下的dpph清除率預(yù)測值是69.58％。一般情況下，若響應(yīng)面分析法所建數(shù)學(xué)模型與實際實驗值擬合度不高，則利用該模型推斷進行最佳化分析所得方案可能與實際值有一定出入，為了驗證該方案的可靠性，因此有必要對推斷方案進行試驗。將試驗條件修正為超聲溫度55℃，超聲時間40min，超聲頻率20khz，料液比1:10(w/v)，以該條件做3次平行進行酶解驗證，結(jié)果表明，dpph清除率的平均值為69.50％±1.58％，通過spssstatistics19軟件計算，在設(shè)定顯著性水平p<0.01前提下，預(yù)測值和實際值無顯著性差異，表明該模型方程擬合試驗數(shù)據(jù)較好，該預(yù)測模型可行。表4回歸系數(shù)模型及方差分析注:＊＊表示差異極顯著(p＜0.01)；*表示差異顯著(p＜0.05)。然而，實際試驗操作中會產(chǎn)生熱效應(yīng)，尤其是超聲過程中產(chǎn)生的熱效應(yīng)對酶解產(chǎn)物的活性會有較大影響，原因可能是隨著溫度升高，分子活動加強，化學(xué)鍵不穩(wěn)定，多肽易脫氫而無法與自由基結(jié)合，從而降低酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。具體對本發(fā)明而言，由后續(xù)的實施例2可知，本發(fā)明中的竹節(jié)蝦抗氧化肽的氨基酸序列為gly-asn-gly-leu-pro(如seq1所示)，隨著溫度升高，分子活動加強，化學(xué)鍵不穩(wěn)定，酶解產(chǎn)物易脫氫產(chǎn)生氫離子，無法與自由基結(jié)合，從而降低多肽的抗氧化活性，同時多肽結(jié)構(gòu)gly和asn中的氨基和末尾的羧基易脫氫產(chǎn)生氫離子，進一步導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抗氧化活性降低。因此，本發(fā)明在上述最佳工藝條件的基礎(chǔ)上將超聲波輔助酶解條件調(diào)整為：超聲溫度為52℃，超聲時間為35min，料液比為1:9，超聲溫度和超聲時間的調(diào)整能從一定程度上減少熱效應(yīng)對多肽的影響，從而進一步保證酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，有效避免其生物活性降低，從而保證其生物學(xué)價值。1.3.4超聲輔助酶解和非超聲輔助酶解的比較由表5可知，在非超聲輔助酶解的條件下，當(dāng)酶解時間為2h時，其水解度最高，為34.19％；而超聲波輔助酶解僅需40min，水解度就達到52.14％，說明超聲輔助酶解不僅能提高酶解程度，還縮短了酶解時間，節(jié)約能源。在試驗的設(shè)計范圍內(nèi)，超聲輔助酶解蝦頭得到的酶解產(chǎn)物，其dpph清除率最高達68.34％，比非超聲輔助酶解高18.21％，說明超聲輔助酶解還能夠提高酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。表5超聲輔助酶解和非超聲輔助酶解的比較結(jié)果1.3.5超濾處理以超聲溫度55℃，超聲時間40min，超聲頻率20khz，料液比1:10(w/v)的優(yōu)化條件制備酶解產(chǎn)物shp，利用超濾分離設(shè)備對shp進行初步分離，分別得到shp1、shp2、shp3、shp4四個組分，分別測定不同相對分子質(zhì)量的抗氧化活性，結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量大小對其抗氧化活性具有顯著性影響。其中，shp4(<3kda)組分的dpph清除率和還原性均最高，分別為73.35％和0.66(如表6所示)。因此，將shp4確定為進一步研究對象。表6不同相對分子質(zhì)量組分的抗氧化活性注：dpph清除率和還原力測定肽和bht的濃度均為2mg·ml-1。1.3.6凝膠柱處理將超濾分離得到的shp4組分通過sephadexg-25凝膠層析柱分離，以超純水為洗脫液，樣品濃度為20mg·ml-1，上樣量為5.0ml，流速為1.0ml·min-1，用自動收集器收集，每管2.0ml。將同一峰的收集液合并，經(jīng)冷凍干燥后分別測定各個峰的dpph清除率。由圖13可知，經(jīng)過sephadexg-25凝膠層析分離后，樣品分離得到shp4-i、shp4-ii、shp4-iii、shp4-iv4個組分，組分shp4-i最先被洗脫出來，代表該組分多肽分子量最大，組分shp4-iv最后洗脫出來，代表分子量最小，組分shp4-ii的峰面積最大，說明該組分多肽在4個組分中含量最高。如圖14所示，在多肽含量為2.0mg·ml-1時，4個組分的dpph清除率分別為43.51％±3.45％、83.04％±2.61％、58.29％±1.67％、24.61％±3.71％，其中，組分shp4-ii的dpph清除率最高，表明該組分含有更多具有抗氧化活性的多肽。將該組分的抗氧化活性與超濾液相比，dpph清除率提高了7.83％，與標(biāo)樣bht相當(dāng)，說明sephadexg-25凝膠層析達到了進一步純化的作用。1.3.7反相高效液相色譜處理將sephadexg-25凝膠層析分離得到的活性組分shp4-ii用rp-hplc進一步純化分離，得到shp-a、shp-b、shp-c、shp-d4個主要肽峰(如圖15所示)。分別收集4個峰，凍干后以dpph清除率為指標(biāo)測定其抗氧化活性，在多肽含量為1.5mg·ml-1時，4個組分的dpph清除率分別為45.21％±1.25％、52.66％±2.19％、63.73％±2.01％、85.69％±3.12％，組分shp4-d具有較強的抗氧化活性。收集該組分用來進行純度檢測分析，以含0.1％三氟乙酸的乙腈/含0.1％三氟乙酸的超純水為流動相，流速1.0ml·min-1，洗脫模式為含0.1％三氟乙酸的乙腈在20min內(nèi)濃度由0變化到20％的線性洗脫模式，根據(jù)檢測結(jié)果可知，該組分有較好的分離度(如圖16所示)。實施例2：抗氧化肽結(jié)構(gòu)鑒定經(jīng)反相高效液相分離純化后的抗氧化組分shp-d采用uplc-tof-ms/ms技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，其一級質(zhì)譜總離子流圖譜見圖17所示。由圖17可見，該組分呈現(xiàn)單一峰，因此可以認(rèn)為該肽段相對較純，將該峰進行二級質(zhì)譜分析，并采用masslynx軟件中peptidesequencing對其結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，從shp-d組分鑒定出1個可靠性在90％以上的多肽序列，其結(jié)構(gòu)為gly-asn-gly-leu-pro(如圖18所示)。實施例3：竹節(jié)蝦抗氧化肽生物穩(wěn)定性測定配制人工胃液以及人工腸液備用，其中人工胃液的配制過程如下：分別量取稀鹽酸16.4ml，蒸餾水800ml，將它們進行混合，再加入胃蛋白酶10g，震蕩均勻，置于容量瓶中，并定容至1000ml。人工腸液的配制：稱取6.8g的磷酸二氫鉀，將其溶解于500ml的蒸餾水中，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph值至6.8，并取10g的胰蛋白酶，將其溶解在一定量的蒸餾水中，震蕩均勻，并且定容到1000ml。配制相同濃度(10mg/ml)的雞卵清蛋白溶液和竹節(jié)蝦抗氧化肽溶液，以(1:4、1:5、1:6)的比例混合，再加入等量的配好備用的人工胃液或腸液，添加雞卵清蛋白溶液和人工胃液(腸液)的竹節(jié)蝦抗氧化肽溶液在37℃的水浴鍋中靜置3h，再在沸水浴中15min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min、溫度為-4℃的條件下離心10min后，并測定其dpph自由基清除率和abts自由基清除率，重復(fù)實驗3次，雞卵清蛋白對竹節(jié)蝦抗氧化肽dpph清除率的影響如表7所示，雞卵清蛋白對竹節(jié)蝦抗氧化肽abts清除率的影響如表8所示。表7竹節(jié)蝦抗氧化肽dpph清除率活性保持率/％雞卵清蛋白與竹節(jié)蝦抗氧化肽溶液的比例胃蛋白酶胰蛋白酶未添加雞卵清蛋白溶液84.12±1.0465.51±0.811:490.59±0.4768.83±0.551:595.19±0.6673.12±1.341:688.60±0.6466.33±0.79表8竹節(jié)蝦抗氧化肽abts清除率活性保持率/％由上述表7和表8可知，添加雞卵清蛋白在模擬胃液和腸液的環(huán)境下對竹節(jié)蝦抗氧化肽均有較好的保護作用，并且與模擬腸液環(huán)境比較，雞卵清蛋白在模擬胃液環(huán)境下對竹節(jié)蝦抗氧化肽的生物活性具有更好的保護作用。sequencelisting<110>浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院<120>一種竹節(jié)蝦抗氧化肽及其制備方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>8<212>prt<213>竹節(jié)蝦（penaeusjaponicus）<400>1glyasnglyleupro15當(dāng)前第1頁12