本發(fā)明涉及還原型谷胱甘肽的制備技術領域，特別地，涉及一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法。
背景技術：
谷胱甘肽(簡稱gsh)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的三肽，分為還原型和氧化型兩種形式，其中還原型谷胱甘肽具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽還能參與生物轉化作用，從而把機體內有害的毒物轉化為無害的物質，排泄出體外，廣泛應用于食品、藥品領域。
目前谷胱甘肽的主要制備方法有溶劑萃取法、化學合成法、生物發(fā)酵法和酶法。采用溶劑萃取法從動植物組織中提取谷胱甘肽時，由于谷胱甘肽提取率低、成本高、有機溶劑污染嚴重、純度不高，現(xiàn)已很少使用?；瘜W合成法制備谷胱甘肽，由于活性產物不易分離，需要化學拆分，產品純度也不高，難以推廣。
酵母發(fā)酵法制備谷胱甘肽，工藝較成熟，發(fā)表的專利也較多，如cn200880019101.6、cn200810233834.1、cn200810039695.9，但上述制備方法中產物濃度和生產周期會受到酵母菌本體的先天限制，而且下游工藝的處理很復雜。
由于反應速度快、合成濃度高、產物純度高等天然優(yōu)勢，酶法合成谷胱甘肽作為新一代制備谷胱甘肽的方法，逐步取代以往傳統(tǒng)的萃取法、化學合成法和發(fā)酵法。專利cn200910199345.3利用一種雙功能谷胱甘肽合成酶，一步合成得到谷胱甘肽。然而，酶法合成gsh最大的問題是三磷酸腺苷(簡稱atp)的大量消耗，atp不僅價格昂貴而且大大抑制酶活。為解決該問題，cn201210201691.2使用酵母糖酵解再生atp與gsh合成偶聯(lián)，效果穩(wěn)定，但使用酵母會引入大量色素和雜質，增加了純化的困難。因此使用酶系再生atp成為酶法合成gsh的研究熱點。
近年來，基因表達技術的迅猛發(fā)展和酶法合成谷胱甘肽工藝水平的不斷提高，使得酶法合成谷胱甘肽大規(guī)模工業(yè)化應用變?yōu)楝F(xiàn)實。專利cn201510762184.x利用多聚磷酸鹽酶系(pap、ppk、adk)再生atp，超濾除酶后，通過離子交換法回收流穿液中的atp、adp、amp，但該方法中atp用量偏大，并會進一步降解為amp，同時高能磷酸化合物回收工藝步驟多且較為復雜。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，以解決酶法合成谷胱甘肽atp使用量大、再生過程復雜的技術問題。
本發(fā)明采用的技術方案如下：
一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：(1)盛有丙酮酸類物質及磷酸類物質的反應容器中通入氧氣或空氣，加入丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶；(2)步驟(1)反應結束后，向反應容器中通入氮氣或惰性氣體，利用gshf合成還原型谷胱甘肽；利用乙酸激酶原位再生atp；(3)分離產物gsh和反應液中的atp、adp。
進一步地，丙酮酸氧化酶的來源為氣球菌屬；gshf的來源為鏈球菌屬；乙酸激酶的來源為線粒體或嗜熱芽胞桿菌。
進一步地，步驟(3)包括：(a)向反應容器中加入高分子聚合物；(b)利用酶膜反應器截留反應后的酶、atp和adp，與產物gsh分離。
進一步地，步驟(3)還包括步驟(b)中分離的反應后的酶、atp和adp的循環(huán)利用，即將分離的反應后的酶、atp和adp添加至反應容器中參與生成谷胱甘肽及再生atp的連續(xù)反應。
進一步地，酶膜反應器的截留分子量為1～10kda。
進一步地，循環(huán)利用的次數(shù)為1～30次。
進一步地，高分子聚合物為陽離子高分子聚合物，陽離子高分子聚合物為聚合伯胺型陽離子、聚合仲胺型陽離子、聚合叔胺型陽離子、聚合季胺型陽離子中的一種或幾種。
進一步地，高分子聚合物與反應底物中atp的摩爾比為0.8～50∶1。
進一步地，陽離子高分子聚合物為二烯丙基季銨鹽、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯酰胺的季銨鹽衍生物、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺中的一種或幾種。
進一步地，步驟(1)至步驟(3)在同一容器中進行。
進一步地，步驟(1)中丙酮酸類物質為丙酮酸、丙酮酸鹽、丙酮酸酯中的一種或幾種；磷酸類物質為磷酸或磷酸鹽。
進一步地，步驟(2)中合成還原型谷胱甘肽的反應底物為谷氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽、半胱氨酸或其鹽、鎂離子及atp。
進一步地，步驟(2)的反應溫度為10～30℃，反應的ph值為6.0～8.5。
進一步地，步驟(1)的反應容器中，丙酮酸氧化酶的濃度為0.2～5g/l，丙酮酸類物質的質量濃度為0.1～5％，磷酸類物質的質量濃度為0.5～5％；丙酮酸與磷酸的摩爾比為1∶0.3～5.0，丙酮酸與丙酮酸氧化酶的質量比為1∶0.02～0.5。
進一步地，步驟(2)的反應容器中，gshf的濃度為0.2～5g/l，乙酸激酶的濃度為0.2～5g/l，谷氨酸或其鹽質量濃度為0.1～3％，甘氨酸或其鹽質量濃度為0.1～3％，半胱氨酸或其鹽質量濃度為0.1～3％，鎂離子質量濃度為0.5～3％，atp質量濃度為0.01～0.25％。
本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，利用丙酮酸氧化酶(簡稱pox)和乙酸激酶(簡稱ack)偶聯(lián)雙功能谷胱甘肽合成酶(簡稱gshf)合成還原型谷胱甘肽，得到產物的同時原位再生atp，atp的消耗和再生同時進行，使高能磷酸化合物的循環(huán)限定在atp和二磷酸腺苷(簡稱adp)之間，且大量以atp形式存在，而不會進一步降解成單磷酸腺苷(簡稱amp)，使atp的再生更為經濟。
2、本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，反應物中僅需要投入濃度極低的atp即可，而無需atp投入的摩爾數(shù)大于生成的谷胱甘肽摩爾數(shù)，成本低且不會抑制酶活。
3、本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，解除了高濃度高能磷酸化合物即底物atp和產物adp、amp對谷胱甘肽合成反應的抑制作用，使谷胱甘肽的生成濃度達到20g/l以上，且反應時間縮短。
4、本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，建立了新型的、更為簡化和經濟的酶法合成谷胱甘肽與atp再生的偶聯(lián)體系，操作簡單，成本低廉，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產。
除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。下面將參照附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
附圖說明
構成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：
圖1是本發(fā)明優(yōu)選實施例的多酶體系制備還原型谷胱甘肽和atp原位再生的工藝流程圖。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：(1)盛有丙酮酸類物質及磷酸類物質的反應容器中通入氧氣或空氣，加入丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶；(2)步驟(1)反應結束后，向反應容器中通入氮氣或惰性氣體，利用gshf合成還原型谷胱甘肽；利用乙酸激酶原位再生atp；(3)分離產物gsh和反應液中的atp、adp。
上述步驟中，丙酮酸類物質、磷酸類物質在丙酮酸氧化酶的作用下被氧化為乙酰磷酸和雙氧水。反應底物在gshf作用下合成還原型谷胱甘肽，同時atp降解為adp。在乙酸激酶的作用下，上述得到的乙酰磷酸將生成的adp再生為atp，實現(xiàn)atp的原位再生。將產物gsh與反應液中的atp和生成的adp分離開，產物gsh可以進入下一步的提取步驟，atp、adp則可以循環(huán)利用，參與下一次反應。
本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，利用丙酮酸氧化酶(簡稱pox)和乙酸激酶(簡稱ack)偶聯(lián)雙功能谷胱甘肽合成酶(簡稱gshf)合成還原型谷胱甘肽，得到產物的同時原位再生atp，atp的消耗和再生同時進行，使高能磷酸化合物的循環(huán)限定在atp和二磷酸腺苷(簡稱adp)之間，且大量以atp形式存在，而不會進一步降解成單磷酸腺苷(簡稱amp)，使atp的再生更為經濟。步驟(1)中還加入過氧化氫酶。步驟(1)中生成乙酰磷酸的同時，會有雙氧水生成，而雙氧水的存在會抑制pox的活性。加入過氧化氫酶可以將生成的雙氧水分解為水和氧氣，從而避免雙氧水對pox活性的影響。
本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，反應物中僅需要投入濃度極低的atp即可，而無需投入atp的摩爾數(shù)大于生成的谷胱甘肽摩爾數(shù)，成本低且不會抑制酶活。
本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，解除了高濃度高能磷酸化合物即底物atp和產物adp、amp對谷胱甘肽合成反應的抑制作用，使谷胱甘肽的生成濃度達到20g/l以上，且反應時間縮短。
本發(fā)明的多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，建立了新型的、更為簡化和經濟的酶法合成谷胱甘肽與atp再生的偶聯(lián)體系，操作簡單，成本低廉，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產。
優(yōu)選的，丙酮酸氧化酶的來源為氣球菌屬；gshf的來源為鏈球菌屬；乙酸激酶的來源為線粒體或嗜熱芽胞桿菌。采用上述來源的丙酮酸氧化酶、gshf和乙酸激酶參與還原型谷胱甘肽的制備，能夠實現(xiàn)低濃度atp即可滿足反應需要，并能夠原位再生，避免對谷胱甘肽合成反應的抑制，提高谷胱甘肽的產量，且縮短反應時間。
優(yōu)選的，步驟(3)具體為：(a)向反應容器中加入高分子聚合物；(b)利用酶膜反應器截留反應后的酶、atp和adp，與產物gsh分離。上述的反應中加入高分子聚合物可以與atp、adp結合，從而在酶膜反應器中被截留，與產物gsh和反應殘留物分離，酶膜反應器的利用也便于反應后的酶、atp和adp保留下來參與下一次反應。酶膜反應器的應用，使atp無需經過超濾和離子交換等步驟即可進行原位再生、回收和多批次使用，工藝步驟得到極大地簡化。
優(yōu)選的，酶膜反應器的截留分子量為1～10kda。更優(yōu)選的，酶膜反應器的截留分子量為2.5～10kda。采用上述截留分子量的酶膜反應器更有利于反應后的酶、atp、adp的截留和產物gsh透過反應器而進入下一步的提取工序。
優(yōu)選的，步驟(3)還包括步驟(b)中分離的反應后的酶、atp和adp的循環(huán)利用，即將分離的反應后的酶、atp和adp添加至反應容器中參與生成谷胱甘肽及再生atp的連續(xù)反應。優(yōu)選的，循環(huán)利用的次數(shù)為1～30次。更優(yōu)選的，循環(huán)利用的次數(shù)為6～25次。
優(yōu)選的，高分子聚合物為陽離子高分子聚合物，為聚合伯胺型陽離子、聚合仲胺型陽離子、聚合叔胺型陽離子、聚合季胺型陽離子中的一種或幾種。更優(yōu)選的，陽離子高分子聚合物為二烯丙基季銨鹽、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯酰胺的季銨鹽衍生物、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺中的一種或幾種。采用上述陽離子高分子聚合物能夠與atp、adp更好地結合，以便于在酶膜反應器中被截留，從而與產物gsh分離。
優(yōu)選的，高分子聚合物與反應底物中atp的摩爾比為0.8～50∶1。更優(yōu)選的，高分子聚合物與反應容器中atp的摩爾比為0.8～10∶1。再優(yōu)選的，高分子聚合物與反應容器中atp的摩爾比為1～5∶1。采用過量的高分子聚合物能夠保證atp、adp完全與之結合，從而保證將所有atp和adp通過酶膜反應器截留，便于與產物gsh分離。
優(yōu)選的，步驟(1)至步驟(3)在同一容器中進行。步驟(1)至步驟(3)的反應可以在同一反應容器中進行，反應容器中可以設有酶膜，用于截留反應后酶、atp和adp，與產物gsh分離。
優(yōu)選的，步驟(1)中丙酮酸類物質為丙酮酸、丙酮酸鹽、丙酮酸酯中的一種或幾種；磷酸類物質為磷酸或磷酸鹽。采用上述丙酮酸類物質、磷酸類物質，在丙酮酸氧化酶的作用下被氧化為乙酰磷酸，作為將步驟(2)中生成的adp原位再生為atp的反應物，為atp的再生做準備。
優(yōu)選的，步驟(2)中合成還原型谷胱甘肽的反應底物為谷氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽、半胱氨酸或其鹽、鎂離子及atp。
優(yōu)選的，步驟(2)的反應溫度為10～30℃，反應的ph值為6.0～8.5。更優(yōu)選的，反應溫度為15～20℃，反應的ph值為6.5～7.5。采用上述反應條件，更利于還原型谷胱甘肽的生成和atp的再生，提高還原型谷胱甘肽的產量，縮短反應時間。
優(yōu)選的，步驟(1)的反應容器中，丙酮酸氧化酶的濃度為0.2～5g/l，更優(yōu)選的2～3.5g/l，丙酮酸類物質的質量濃度為0.1～5％，更優(yōu)選的1.5～3％，磷酸類物質的質量濃度為0.5～5％，更優(yōu)選的1.5～3.5％；丙酮酸與磷酸的摩爾比為1∶0.3～5.0，丙酮酸與丙酮酸氧化酶的質量比為1∶0.02～0.5。
優(yōu)選的，當反應容器的體積為2500l，反應液為1500l時，步驟(1)中通入氧氣時的流量為1～50m3/h，更優(yōu)選的12～16m3/h；通入空氣時的流量為1～150m3/h，更優(yōu)選的30～100m3/h，通入氧氣或空氣的時間為1～2h。
優(yōu)選的，步驟(2)的反應容器中，gshf的濃度為0.2～5g/l，更優(yōu)選的1～2.5g/l，乙酸激酶的濃度為0.2～5g/l，更優(yōu)選的1～1.5g/l。谷氨酸或其鹽質量濃度為0.1～3％，更優(yōu)選的1.5～2.5％，甘氨酸或其鹽質量濃度為0.1～3％，更優(yōu)選的0.5～1.5％，半胱氨酸或其鹽質量濃度為0.1～3％，更優(yōu)選的1.5～2.5％，鎂離子質量濃度為0.5～3％，更優(yōu)選的1～2％，atp質量濃度為0.01～0.25％，更優(yōu)選的0.05～0.1％。
優(yōu)選的，步驟(2)中通入氮氣或惰性氣體時的流量為1～50m3/h，更優(yōu)選的2～20m3/h，通入氮氣或惰性氣體的時間為1～30min。
上述反應物的用量中，atp的用量極低，成本大大地降低，同時不會因為atp的大量使用而抑制酶的活性。這是由于步驟(1)中生成的乙酰磷酸在乙酸激酶的作用下使atp原位再生。
優(yōu)選的，產物gsh與反應殘留物通過離子交換法分離。
實施例
需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發(fā)明。
以下各實施例中的化學試劑均為市售。
實施例1
本發(fā)明的優(yōu)選實施例提供了一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，參照圖1所示，包括以下步驟：
(1)在反應容器中，150l去離子水反應體系中含有丙酮酸3kg，磷酸2.8kg，用氫氧化鈉調節(jié)ph值為6.7，加入250gpox酶液和330gcat酶液，反應期間控制反應溫度為15℃，加入烯酸控制ph值為6.7，氧氣流量為2m3/h，反應容器中的壓力為0.08mpa，反應1.25h結束。其中pox酶的來源為氣球菌屬。
(2)反應容器中通入氮氣0.5h，控制氮氣的流量為2m3/h；投入反應底物谷氨酸2.8kg，甘氨酸1.5kg，半胱氨酸1.2kg，atp0.02kg，氯化鎂1kg。投入gshf酶200g，乙酸激酶300g，反應期間利用稀堿控制ph值為8.0，溫度為25℃，反應1h結束。用高效液相色譜檢測反應容器中生成的還原型谷胱甘肽，濃度為20g/l；同時結果顯示，atp大量存在，無adp和amp產生。其中，gshf的來源為鏈球菌屬；乙酸激酶的來源為線粒體或嗜熱芽胞桿菌。
(3)利用超濾和離子交換方法將產物gsh和反應液中的atp、adp分離。超濾采用截留分子量為10kda的超濾膜，先將要分離的混合液濃縮至死體積，再用純化水頂洗至5倍體積即可。離子交換方法，選擇市售的陽離子樹脂，按吸附量10～50mggsh/克樹脂吸附，流速2～6bv/h，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化鈉溶液洗脫，收集即可。
(4)用鹽酸調節(jié)產物gsh溶液(包括反應殘留物)ph值為3.0，用市售的大孔強陽型離子交換樹脂吸附溶液中的產物和其它反應殘留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化鈉溶液洗脫，用高效液相色譜檢測直至85％以上的目標產物被洗脫，即得到分離純化的還原型谷胱甘肽。
實施例2
本發(fā)明的優(yōu)選實施例提供了一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，參照圖1所示，包括以下步驟：
(1)在反應容器中，150l去離子水反應體系中含有丙酮酸3kg，磷酸2.8kg，用氫氧化鈉調節(jié)ph值為6.7，加入250gpox酶液和330gcat酶液，反應期間控制反應溫度為15℃，加入烯酸控制ph值為6.7，氧氣流量為2m3/h，反應容器中的壓力為0.08mpa，反應1.25h結束。其中pox酶的來源為氣球菌屬。
(2)反應容器中通入氮氣0.5h，控制氮氣的流量為2m3/h；投入反應底物谷氨酸2.8kg，甘氨酸1.5kg，半胱氨酸1.2kg，atp0.02kg，氯化鎂1kg。投入gshf酶200g，乙酸激酶300g，反應期間利用稀堿控制ph值為8.0，溫度為25℃，反應1h結束。用高效液相色譜檢測反應容器中生成的還原型谷胱甘肽，濃度為21g/l；同時結果顯示，atp大量存在，無adp和amp產生。其中，gshf的來源為鏈球菌屬；乙酸激酶的來源為線粒體或嗜熱芽胞桿菌。
(3)將步驟(2)中反應容器中的溶液轉移到酶膜反應器中，并加入0.2kg市售的二甲基二烯丙基氯化銨，其中酶膜反應器的截留分子量為10kda，物料在酶膜反應器中循環(huán)。當檢測到還原型谷胱甘肽全部過膜后，直接將未過膜的反應后的酶、atp和adp轉至下一批反應。實驗證明，反應后的酶、atp和adp的循環(huán)利用次數(shù)為1～30次，優(yōu)選6～25次。
(4)用鹽酸調節(jié)過膜液即產物gsh溶液(包括反應殘留物)ph值為3.0，用市售的大孔強陽型離子交換樹脂吸附溶液中的產物和其它反應殘留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化鈉溶液洗脫，用高效液相色譜檢測直至85％以上的目標產物被洗脫，即得到分離純化的還原型谷胱甘肽。
實施例1沒有使用酶膜反應器，而是利用了超濾和離子交換方法分離產物，而實施例2中利用了酶膜反應器，兩個實施例的區(qū)別如表1所示。
表1實施例1與實施例2的區(qū)別
實施例3
本發(fā)明的優(yōu)選實施例提供了一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，參照圖1所示，包括以下步驟：
(1)在反應容器中，100l去離子水反應體系中含有丙酮酸1.8kg，磷酸2.1kg，用氫氧化鈉調節(jié)ph值為7.0，加入200gpox酶液和300gcat酶液，反應期間控制反應溫度為21℃，加入烯酸控制ph值為6.7，空氣流量為5m3/h，反應容器中的壓力為0.08mpa，反應1.5h結束。其中pox酶的來源為氣球菌屬。
(2)反應容器中通入氬氣0.5h，控制氮氣的流量為4m3/h；投入反應底物谷氨酸2kg，甘氨酸0.9kg，半胱氨酸1kg，atp0.02kg，氯化鎂0.8kg。投入gshf酶150g，乙酸激酶350g，反應期間利用稀堿控制ph值為7.5，溫度為22℃，反應1h結束。用高效液相色譜檢測反應容器中生成的還原型谷胱甘肽，濃度為22.3g/l；同時結果顯示，atp大量存在，無adp和amp產生。其中，gshf的來源為鏈球菌屬；乙酸激酶的來源為線粒體或嗜熱芽胞桿菌。
(3)將步驟(2)中反應容器中的溶液轉移到酶膜反應器中，并加入0.5kg市售的聚丙烯亞胺，其中酶膜反應器的截留分子量為5kda，物料在酶膜反應器中循環(huán)。當檢測到還原型谷胱甘肽全部過膜后，直接將未過膜的反應后的酶、atp和adp轉至下一批反應。實驗證明，反應后的酶、atp和adp的循環(huán)利用次數(shù)為1～30次，優(yōu)選6～25次。
(4)用鹽酸調節(jié)過膜液即產物gsh溶液(包括反應殘留物)ph值為3.2，用市售的大孔強陽型離子交換樹脂吸附溶液中的產物和其它反應殘留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化鈉溶液洗脫，直至85％以上的目標產物被洗脫，即得到分離純化的還原型谷胱甘肽。
實施例4
本發(fā)明的優(yōu)選實施例提供了一種多酶體系制備還原型谷胱甘肽的方法，參照圖1所示，包括以下步驟：
(1)在反應容器中，180l去離子水反應體系中含有丙酮酸3.2kg，磷酸3.3kg，用氫氧化鈉調節(jié)ph值為7.2，加入300gpox酶液和400gcat酶液，反應期間控制反應溫度為18℃，加入烯酸控制ph值為7.0，空氣流量為3m3/h，反應容器中的壓力為0.08mpa，反應1.5h結束。其中pox酶的來源為氣球菌屬。
(2)反應容器中通入氮氣0.5h，控制氮氣的流量為5m3/h；投入反應底物谷氨酸3.1kg，甘氨酸2kg，半胱氨酸2kg，atp0.18kg，氯化鎂1.8kg。投入gshf酶400g，乙酸激酶450g，反應期間利用稀堿控制ph值為7.8，溫度為20℃，反應1h結束。用高效液相色譜檢測反應容器中生成的還原型谷胱甘肽，濃度為21g/l；同時結果顯示，atp大量存在，無adp和amp產生。其中，gshf的來源為鏈球菌屬；乙酸激酶的來源為線粒體或嗜熱芽胞桿菌。
(3)將步驟(2)中反應容器中的溶液轉移到酶膜反應器中，并加入0.6kg市售的甲基丙烯酸酯，其中酶膜反應器的截留分子量為1kda，物料在酶膜反應器中循環(huán)。當檢測到還原型谷胱甘肽全部過膜后，直接將未過膜的反應后的酶、atp和adp轉至下一批反應。實驗證明，反應后的酶、atp和adp的循環(huán)利用次數(shù)為1～30次，優(yōu)選6～25次。
(4)用鹽酸調節(jié)過膜液即產物gsh溶液(包括反應殘留物)ph值為3.0，用市售的大孔強陽型離子交換樹脂吸附溶液中的產物和其它反應殘留物，1n氨水溶液淋洗1.5bv，再用0.8m氯化鈉溶液洗脫，直至85％以上的目標產物被洗脫，即得到分離純化的還原型谷胱甘肽。
對比例1
本對比例與實施例3大致相同，步驟(2)中沒有加入乙酸激酶，用高效液相色譜檢測反應容器中生成的還原型谷胱甘肽，濃度僅為1g/l；同時結果顯示，atp基本都變?yōu)閍mp。
對比例2
本對比例與實施例3大致相同，步驟(2)中沒有加入乙酸激酶，投入atp的質量為8g/l，用高效液相色譜檢測反應容器中生成的還原型谷胱甘肽，濃度僅為12g/l。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。