還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，包括以下步驟：將含納米金顆粒的溶液和氯金酸溶液分別用緩沖溶液稀釋后再混合，然后加入表面活性劑溶液混勻，向所得混合溶液中加入待測(cè)溶液，靜置5min～10min后，再加入H2O2水溶液形成反應(yīng)體系并啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)完成后，對(duì)所得產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)所得產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度變化定性判斷待測(cè)溶液中是否含有還原型谷胱甘肽，通過(guò)已測(cè)定的線性回歸方程定量檢測(cè)待測(cè)溶液中還原型谷胱甘肽的含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法靈敏度高、簡(jiǎn)單方便、且成本低廉。
【專利說(shuō)明】還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中測(cè)定氨基酸的方法，尤其涉及一種還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘妝(glutathiose,r-glutamyl cysteingl+glycine, GSH)是一種含 Y-酸胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，存在于幾乎身體的每一個(gè)細(xì)胞。谷胱甘肽有還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形式；還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是生物體內(nèi)的主要抗氧化劑，能抵抗氧化劑對(duì)硫氫基的破壞作用，保護(hù)細(xì)胞膜中含硫氫基的蛋白質(zhì)和酶不被氧化。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)生成少量H2O2時(shí)，GSH在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的作用下，把H2O2還原成水，其自身被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)。有報(bào)道稱兒童自閉癥的發(fā)展與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)，而多種人體疾病以及衰老也被指與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有明顯關(guān)聯(lián)。因此生物體內(nèi)氧化應(yīng)激水平在疾病預(yù)防等領(lǐng)域成為一項(xiàng)關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，而由于谷胱甘肽特殊的生物學(xué)功能，其含量成為細(xì)胞體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的指示劑。因此，建立一種能快速高效檢測(cè)谷胱甘肽含量的方法顯得尤為重要。
[0003]目前，對(duì)于還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法有酶法、熒光法、電化學(xué)測(cè)定方法、高效液相色譜法、紅外檢測(cè)分析法等。較常用的方法是基于Ellman試劑(5，5’ - 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，DTNB)與巰基反應(yīng)的DTNB檢測(cè)方法，但是該方法由于測(cè)定誤差使精確度受限，基于該方法建立的谷胱甘肽還原酶循環(huán)法需要使用價(jià)格昂貴的輔酶，應(yīng)用也有所限制。熒光法的反應(yīng)速度快、靈敏度高，但容易受干擾亦有其局限；電化學(xué)測(cè)定方法也有電極制作成本較高等限制。因此，雖然已建立了多種測(cè)定還原型谷胱甘肽的方法，但是研究一種靈敏度高、簡(jiǎn)單、成本低廉的測(cè)定還原型谷胱甘肽的方法仍具有較高科學(xué)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值，也成為了本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靈敏度高、簡(jiǎn)單方便、成本低廉的還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0006]將含納米金顆粒的溶液和氯金酸溶液分別用緩沖溶液稀釋后再混合，然后加入表面活性劑溶液混勻，向所得混合溶液中加入待測(cè)溶液，靜置5min?IOmin后，再加入H2O2水溶液形成反應(yīng)體系并啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)完成后，對(duì)所得產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)所得產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度變化定性判斷待測(cè)溶液中是否含有還原型谷胱甘肽，通過(guò)已測(cè)定的線性回歸方程定量檢測(cè)待測(cè)溶液中還原型谷胱甘肽的含量。
[0007]上述的檢測(cè)方法中，所述線性回歸方程為y=_0.0002x+0.3967，其中，y為所述產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度，x為所述待測(cè)溶液中還原型谷胱甘肽的含量，單位為nM。
[0008]上述的檢測(cè)方法中，所述線性回歸方程中還原型谷胱甘肽的檢測(cè)范圍為13nM~1333nM。
[0009]上述的檢測(cè)方法中，所述納米金顆粒主要由以下方法制備得到:所述納米金顆粒主要由以下方法制備得到:將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%~0.02%的氯金酸溶液加熱至沸騰并保持沸騰狀態(tài)2min~5min，然后一邊攪拌沸騰的氯金酸溶液一邊快速加入檸檬酸鈉溶液，攪拌速度為1000r/min~1500r/min，攪拌過(guò)程中持續(xù)加熱并保持?jǐn)嚢杷俣炔蛔?，直至所得溶液顏色由初始的淡黃色轉(zhuǎn)為橘紅色時(shí)停止加熱，繼續(xù)攪拌15min~20min,制得含納米金顆粒的溶液。
[0010]上述的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系的初始成分中，所述氯金酸的摩爾濃度為20 μ M~500 μ M，所述納米金顆粒的摩爾濃度為0.005875ηΜ~0.0235ηΜ,所述H2O2的摩爾濃度為100 μ M~400 μ Mo
[0011]上述的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系的初始成分中，所述氯金酸、納米金顆粒、H2O2 的摩爾比為 I: 1.175Χ10_7: 2。
[0012]上述的檢測(cè)方法中，所述表面活性劑優(yōu)選十六烷基三甲基氯化銨，所述表面活性劑的摩爾濃度優(yōu)選I μ M~3 μ Μ。
[0013]上述的檢測(cè)方法中，所述反應(yīng)的條件優(yōu)選為--反應(yīng)溫度25°C~35°C，pH值6.5~
7.0,反應(yīng)時(shí)間20min~25min。
[0014]上述的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液，所述PBS緩沖溶液的濃度優(yōu)選0.5mM~ImM。
`[0015]上述的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，所述納米金顆粒的粒徑為15nm~45nm,所述納米金顆粒的Zeta電位為-30mV~_40mV。
[0016]在本發(fā)明中，檢測(cè)GSH的方法主要是基于GSH對(duì)納米金顆粒的催化擴(kuò)增反應(yīng)的干擾。納米金顆粒能作為催化劑促進(jìn)H2O2與氯金酸之間的氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果是氯金酸被還原出新的納米金顆粒，增加了體系中原有的納米金顆粒的粒徑，從而改變了其表面等離子體共振吸收。而GSH的特殊結(jié)構(gòu)使其可通過(guò)-SH以及-C00_等多種基團(tuán)與納米金顆?；蚵冉鹚崤湮或希褿SH的結(jié)構(gòu)使其具有強(qiáng)大的空間位阻效應(yīng)干擾上述反應(yīng)，使得納米金顆粒催化擴(kuò)增反應(yīng)后的表面等離子體共振吸收峰520nm處強(qiáng)度隨體系中的GSH濃度發(fā)生相應(yīng)的變化，從而達(dá)到檢測(cè)目的。
[0017]在上述初始反應(yīng)液中，原料摩爾用量的確定是通過(guò)以下各組反復(fù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定的。
[0018]納米金顆粒用量的優(yōu)化:取不同摩爾濃度的含納米金顆粒的溶液各lmL，分別加入ImL氯金酸溶液，混勻后再加入0.6mL的10 μ M十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)溶液，向所得混合溶液中加入0.2mL含還原型谷胱甘肽的溶液，靜置5min后再加入0.2mL H2O2水溶液形成反應(yīng)體系并啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)20min后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)加入不同摩爾濃度納米金顆粒得到的各產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。在前述反應(yīng)體系的初始成分中，氯金酸的濃度為20 μ M，CTAC的濃度為2 μ M，H2O2的濃度為200 μ Μ，還原型谷胱甘肽的濃度為6660ηΜ。用PBS緩沖溶液代替前述檢測(cè)步驟中的含還原型谷胱甘肽的溶液重復(fù)前述過(guò)程，得到空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果。如圖1?圖5所示，Cl?C6為反應(yīng)體系初始成分中納米金顆粒的濃度 Cau,分別為:0.001469,0.002938,0.005875,0.01175,0.0235,0.047nM。由圖1 ?圖4可以看出，隨著溶液體系中納米金顆粒濃度的增加，空白對(duì)照及含還原型谷胱甘肽的溶液體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度均逐漸增強(qiáng)，然而由于GSH與納米金、金離子的螯合及其空間位阻效應(yīng)，不同納米金顆粒濃度下的520nm處吸光度均小于空白對(duì)照體系。但是從圖5可看出，在納米金顆粒濃度逐漸增加的同時(shí)，空白對(duì)照體系與含GSH的溶液體系的520nm處吸光度差值在C4 (即納米金顆粒濃度達(dá)到0.01175nM)時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降。這說(shuō)明在該納米金顆粒濃度下反應(yīng)完全，過(guò)少的納米金顆粒濃度沒有完全催化反應(yīng)，使得空白對(duì)照體系與含GSH體系差值不明顯；過(guò)高的納米金顆粒濃度會(huì)打破原有含GSH體系中GSH對(duì)納米金顆粒的螯合及其空間位阻效應(yīng)，使含GSH體系520nm處吸光度增高，從而造成空白對(duì)照體系與含GSH體系差值變小。由于本發(fā)明的原理是基于GSH對(duì)納米金顆粒催化擴(kuò)增反應(yīng)的干擾，所以，至加入H2O2溶液后的反應(yīng)體系初始成分中優(yōu)選
0.005875nM?0.0235nM納米金顆粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中0.01175nM納米金顆粒濃度為最優(yōu)選。
[0019]氯金酸用量的優(yōu)化:取不同摩爾濃度的氯金酸溶液各lmL，分別加入ImL納米金顆粒溶液，混勻后再加入0.6mL的10 μ M CTAC溶液，向所得混合溶液中加入0.2mLGSH溶液，靜置5min后加入0.2mL H2O2水溶液形成反應(yīng)體系啟動(dòng)反應(yīng),反應(yīng)20min后,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)加入不同摩爾濃度氯金酸得到的各產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。在前述反應(yīng)體系的初始成分中，納米金顆粒的濃度為0.01175nM，CTAC的濃度為2 μ M，H2O2的濃度為200 μ Μ，GSH的濃度為6660ηΜ。用PBS緩沖溶液代替前述檢測(cè)步驟中的GSH溶液重復(fù)前述過(guò)程，得到空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果。如圖6?圖10所示，Cl?C6為反應(yīng)體系初始成分中氯金酸的濃度(圖中以CAuCl4-1代表)，分別為:1、4、20、100、500、1000 μ M0由圖6?圖9可以看出，隨著溶液體系中氯金酸濃度的增加，空白對(duì)照體系及含GSH體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度都逐漸增強(qiáng)，然而由于GSH與氯金酸金離子也具有螯合及其空間位阻效應(yīng)，不同氯金酸濃度下的520nm處吸光度均小于空白對(duì)照體系。但是從圖10可看出，在氯金酸濃度逐漸增加的同時(shí)，空白對(duì)照體系與含GSH體系的520nm處吸光度差值在C4 (即氯金酸濃度達(dá)到100 μ M)時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，這說(shuō)明在該氯金酸濃度下反應(yīng)完全。作為納米金催化擴(kuò)增反應(yīng)的主要反應(yīng)物之一，與納米金濃度對(duì)檢測(cè)效果的影響一樣，過(guò)少或過(guò)多的氯金酸都可能影響GSH對(duì)納米金催化擴(kuò)增反應(yīng)的干擾效果，使得空白對(duì)照體系與含GSH體系差值不明顯。因此，至加入H2O2溶液后的反應(yīng)體系初始成分中優(yōu)選20 μ M?500 μ M作為氯金酸濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中最優(yōu)選100 μ M作為氯金酸濃度。
[0020]H2O2用量的優(yōu)化:取ImL納米金顆粒溶液加入ImL氯金酸溶液，混勻后再加入
0.6mL的10 μ M CTAC溶液，向所得混合溶液中加入0.2mL含GSH的溶液，靜置5min后加入
0.2mL不同摩爾濃度的H2O2水溶液形成反應(yīng)體系并啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)20min后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)加入不同摩爾濃度H2O2得到的各產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。在前述反應(yīng)體系的初始成分中，納米金顆粒的濃度為0.01175nM，氯金酸的濃度為IOOyMJTAC的濃度為
2μ M，GSH的濃度為6660ηΜ。用PBS緩沖溶液代替前述檢測(cè)步驟中的GSH溶液重復(fù)前述過(guò)程，得到空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果。如圖11?圖15所示，Cl?C6為溶液體系中H2O2的濃度(SPCH2O2),分別為:40、80、100、200、400、1000μΜ。由圖11?14可以看出，隨著溶液體系中H2O2濃度的增加，空白對(duì)照體系及含GSH體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度都逐漸增強(qiáng)。但是從圖15可看出，在H2O2濃度逐漸增加的同時(shí)，空白對(duì)照體系與含GSH體系的520nm處吸光度差值在C4 (即H2O2濃度達(dá)到200 μ Μ)時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，這說(shuō)明在該H2O2濃度下反應(yīng)完全。作為納米金催化擴(kuò)增反應(yīng)的主要反應(yīng)物之一，與納米金以及氯金酸濃度對(duì)檢測(cè)效果的影響一樣，過(guò)少或過(guò)多的H2O2都可能影響GSH對(duì)納米金催化擴(kuò)增反應(yīng)的干擾效果，使得空白對(duì)照體系與含GSH體系差值不明顯。因此，至加入H2O2溶液后的反應(yīng)體系初始成分中優(yōu)選100 μ M?400 μ M的H2O2濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中最優(yōu)選200 μ M作為H2O2濃度。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0022]本發(fā)明的檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單、成本低廉，操作方便、不需要特殊的昂貴儀器、且具有對(duì)環(huán)境無(wú)害的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法可有效應(yīng)用于還原型谷胱甘肽的定量檢測(cè)，拓寬了檢測(cè)方法的選擇范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度納米金顆粒得到的空白對(duì)照體系的紫外可見吸收光譜。
[0024]圖2為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度納米金顆粒得到的空白對(duì)照體系在520nm處的吸光度。
[0025]圖3為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度納米金顆粒得到的含GSH產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。
[0026]圖4為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度納米金顆粒的含GSH產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度。
[0027]圖5為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度納米金顆粒的空白對(duì)照體系與含GSH產(chǎn)物體系在520nm處吸光度的差值。
[0028]圖6為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度氯金酸的空白對(duì)照體系的紫外可見吸收光譜。
[0029]圖7為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度氯金酸的空白對(duì)照體系在520nm處的吸光度。
[0030]圖8為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度氯金酸的含GSH產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光
-1'TfeP曰。
[0031]圖9為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度氯金酸的含GSH產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度。
[0032]圖10為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度氯金酸的空白對(duì)照體系與含GSH產(chǎn)物體系在520nm處吸光度的差值。
[0033]圖11為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度H2O2的空白對(duì)照體系的紫外可見吸收光譜。
[0034]圖12為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度H2O2的空白對(duì)照體系在520nm處的吸光度。
[0035]圖13為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度H2O2的含GSH產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。
[0036]圖14為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度H2O2的含GSH產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度。
[0037]圖15為本發(fā)明中加入不同摩爾濃度H2O2的空白對(duì)照體系與含GSH產(chǎn)物體系在520nm處吸光度的差值。
[0038]圖16為本發(fā)明實(shí)施例中建立線性回歸方程時(shí)加入不同摩爾濃度GSH得到的各產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。
[0039]圖17為本發(fā)明實(shí)施例中建立線性回歸方程時(shí)GSH溶液中GSH的摩爾濃度與產(chǎn)物體系在520nm處吸光度的線性關(guān)系圖。
[0040]圖18為本發(fā)明實(shí)施例中加入不同種氨基酸的產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度對(duì)比圖，其中，A為空白對(duì)照樣，B為絲氨酸溶液，C為繳氨酸溶液，D為天冬氨酸溶液，E為甘氨酸溶液，F(xiàn)為蘇氨酸溶液，G為丙氨酸溶液，H為還原型谷胱甘肽溶液。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042]實(shí)施例:
[0043]一種本發(fā)明的還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0044](I)納米金顆粒的制備:取0.lg/L的氯金酸溶液(溶劑為水)IOOmL于磁力攪拌器上加熱至沸騰并保持沸騰狀態(tài)2min，然后一邊攪拌沸騰的氯金酸溶液一邊快速加入質(zhì)量濃度為10g/L的檸檬酸鈉溶液6mL，攪拌速度為1000r/min，攪拌過(guò)程中持續(xù)加熱并保持?jǐn)嚢杷俣炔蛔儯敝了萌芤侯伾沙跏嫉牡S色轉(zhuǎn)為橘紅色后停止加熱，繼續(xù)攪拌15min，在室溫(一般指25°C?35°C)下冷卻后，制得含納米金顆粒的溶液。
[0045](2)建立線性回歸方程:用ImM的PBS緩沖溶液稀釋上述制得的含納米金顆粒的溶液，調(diào)節(jié)其濃度為0.03525nM ;再用ImM的PBS緩沖溶液稀釋氯金酸溶液，調(diào)節(jié)其濃度為300 μ Μ,將稀釋后的含納米金顆粒的溶液和稀釋后的氣金酸溶液各取ImL混合后，再加入
0.6mL摩爾濃度為10 μ M的CTAC溶液混勻，得到混合溶液，共制備8份同樣的混合溶液。將還原型谷胱甘肽(購(gòu)自Sigma-Aldrich)用ImM的PBS溶液進(jìn)行稀釋，得到摩爾濃度為10、
13、33、67、133、333、667、1333、3333、6667ηΜ的還原型谷胱甘肽溶液(GSH溶液)。向前述8份混合溶液中加入0.2mL前述不同摩爾濃度的GSH溶液，靜置5min后加入0.2mL摩爾濃度為3000 μ M的H2O2水溶液形成反應(yīng)體系并啟動(dòng)反應(yīng)，在反應(yīng)體系的初始成分中，氯金酸、納米金顆粒、CTAC, H2O2的摩爾濃度分別為100 μ Μ、0.01175ηΜ、2 μ Μ、200 μ Μ,反應(yīng)20min后，檢測(cè)各組產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜。如圖16所示，加入不同濃度GSH得到的產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度隨GSH濃度的增加，逐漸減小至穩(wěn)定，也因此證實(shí)了可以使用產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜在520nm處吸光度作為還原型谷胱甘肽的定量檢測(cè)指標(biāo)。如圖17所示，通過(guò)測(cè)定一系列含不同摩爾濃度的GSH的產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜，得出GSH溶液中GSH的摩爾濃度與產(chǎn)物體系在520nm處吸光度之間呈線性關(guān)系的范圍為13nM?1333nM，線性回歸方程為y=_0.0002x+0.3967 ;y為產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度，X為GSH溶液中GSH的含量(即摩爾濃度，單位nM)，相關(guān)系數(shù)為0.9853，并通過(guò)測(cè)量三次空白試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得本檢測(cè)方法的檢出限為7nM。將檢出限7nM代入上述線性回歸方程中，得到溶液中GSH的含量在檢出限時(shí)產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度為0.3953，可根據(jù)該吸光度定性判斷溶液中是否含有GSH。
[0046]當(dāng)待測(cè)溶液(取代上述的還原型谷胱甘肽溶液)加入本發(fā)明的反應(yīng)體系中，所得產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度小于0.3953時(shí)即可定性判斷待測(cè)溶液中含有GSH，將產(chǎn)物體系在520nm處的吸光度代入上述線性回歸方程，即可計(jì)算得出待測(cè)溶液中還原型谷胱甘肽的含量。[0047](3)特異性測(cè)定:分別配制濃度為0.6mM的絲氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸溶液，用前述溶液替代上述步驟(2)中的GSH溶液，檢測(cè)步驟和其它成分及濃度與上述步驟(2)所列條件均相同，反應(yīng)完成后，檢測(cè)各產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜，以空白對(duì)照(用ImM PBS緩沖溶液替代GSH溶液)和加入3333nM GSH溶液的反應(yīng)體系為對(duì)照。結(jié)果如圖18所示，3333nM的GSH即可對(duì)納米金顆粒催化擴(kuò)增反應(yīng)造成明顯干擾，產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜在520nm處吸光度明顯下降，而其它氨基酸類物質(zhì)在0.6mM的濃度下沒有對(duì)納米金顆粒催化擴(kuò)增反應(yīng)起明顯干擾作用。由于其它氨基酸物質(zhì)通常只通過(guò)單一的基團(tuán)與金屬原子螯合，而GSH的結(jié)構(gòu)使其具有強(qiáng)大的空間位阻效應(yīng)，使得GSH與其它物質(zhì)相t匕，與金屬原子之間的作用強(qiáng)度更大，對(duì)納米金催化擴(kuò)增反應(yīng)的干擾也更強(qiáng)，因此本方法得以特異性檢測(cè)GSH。
[0048](4)精確度測(cè)定:配制已知濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用上述本發(fā)明的方法測(cè)定該標(biāo)準(zhǔn)溶液加入反應(yīng)體系后的紫外可見光吸收光譜，并由此計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液中的GSH濃度，與已知濃度進(jìn)行比對(duì)，以此檢測(cè)本方法的精確度。同時(shí)采用傳統(tǒng)的DTNB方法做對(duì)比，檢測(cè)及計(jì)算結(jié)果如表1所示:
[0049]表1還原型谷胱甘肽檢測(cè)結(jié)果對(duì)比
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種還原型谷胱甘肽的檢測(cè)方法，包括以下步驟: 將含納米金顆粒的溶液和氯金酸溶液分別用緩沖溶液稀釋后再混合，然后加入表面活性劑溶液混勻，向所得混合溶液中加入待測(cè)溶液，靜置5min?IOmin后，再加入H2O2水溶液形成反應(yīng)體系并啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)完成后，對(duì)所得產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)所得產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度變化定性判斷待測(cè)溶液中是否含有還原型谷胱甘肽，通過(guò)已測(cè)定的線性回歸方程定量檢測(cè)待測(cè)溶液中還原型谷胱甘肽的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述線性回歸方程為y=-0.0002x+0.3967，其中，y為所述產(chǎn)物體系的紫外可見吸收光譜中520nm處的吸光度，x為所述待測(cè)溶液中還原型谷胱甘肽的含量，單位為nM。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述線性回歸方程中還原型谷胱甘肽的檢測(cè)范圍為13ηΜ?1333ηΜ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述納米金顆粒主要由以下方法制備得到:將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%?0.02%的氯金酸溶液加熱至沸騰并保持沸騰狀態(tài)2min?5min,然后一邊攪拌沸騰的氯金酸溶液一邊快速加入檸檬酸鈉溶液，攪拌速度為IOOOr/min?1500r/min，攪拌過(guò)程中持續(xù)加熱并保持?jǐn)嚢杷俣炔蛔儯敝了萌芤侯伾沙跏嫉牡S色轉(zhuǎn)為橘紅色時(shí)停止加熱，繼續(xù)攪拌15min?20min，制得含納米金顆粒的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系的初始成分中，所述氯金酸的摩爾濃度為20μΜ?500μΜ，所述納米金顆粒的摩爾濃度為0.005875ηΜ ?0.0235ηΜ,所述 H2O2 的摩爾濃度為 100 μ M ?400 μ Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系的初始成分中，所述氯金酸、納米金顆粒、H2O2的摩爾比為I: L175X10—7: 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述表面活性劑為十六烷基三甲基氯化銨，所述表面活性劑的摩爾濃度為I μ M?3 μ Μ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述反應(yīng)的條件為:反應(yīng)溫度25°C?35°C，pH值6.5?7.0，反應(yīng)時(shí)間20min?25min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液，所述PBS緩沖溶液的濃度為0.5mM?ImM。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述納米金顆粒的粒徑為15nm?45nm,所述納米金顆粒的Zeta電位為-30mV?_40mV。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103512855SQ201310449795
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】賴萃, 曾光明, 黃丹蓮, 晏銘, 趙美花, 許飄, 黃超, 李寧杰, 危臻, 張辰, 李雪, 徐娟娟 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)