專利名稱：基于納米金和硫堇信號(hào)放大檢測谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種修飾電極的制備和一種信號(hào)放大技術(shù)的研制，在其應(yīng)用上涉及谷胱甘肽含量的檢測。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)存在最豐富的小分子硫醇類化合物。還原型谷胱甘肽(GSH)(下稱谷胱甘肽)是細(xì)胞內(nèi)非蛋白硫氫基團(tuán)的主要組成部分，在活組織中具有多種重要的生理功能。它不僅有著很重要的生理作用，其在細(xì)胞中含量的變化還是某些疾病和癌癥的直接反映。
電化學(xué)方法具有操作簡單、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。
離子液體碳糊電極是一種把離子液體代替液體石蠟作為粘合劑而制成的碳糊電極，由于離子液體具有高的電子導(dǎo)電性、好的粘性、寬的電化學(xué)窗口，因此離子液體碳糊電極常作為電化學(xué)傳感器的基底電極，它具有比傳統(tǒng)的玻碳電極更好性能。
石墨烯具有熱導(dǎo)系數(shù)高、機(jī)械強(qiáng)度好、載荷子流動(dòng)性好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)。
電化學(xué)沉積納米金具有大的比表面積，提高電子傳遞能力的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用硫堇在金納米粒子表面的吸附作用構(gòu)建信號(hào)放大技術(shù)，以谷胱甘肽切割二硫鍵作用實(shí)現(xiàn)電化學(xué)方法高靈敏度測定谷胱甘肽。
本發(fā)明所提供的方法包括以下步驟
(I)以離子液體為修飾劑制備離子液體碳糊電極。
所述的方法，其所述的離子液體可為陽離子為季銨鹽離子、季鱗鹽離子、咪唑鹽離子和吡咯鹽離子；陰離子為鹵素離子、四氟硼酸根離子、六氟磷酸根離子組成的離子液體，如I-己基吡啶六氟磷酸鹽等。
(2)在氧化石墨烯溶液中利用恒電位沉積法在離子液體碳糊表面制得石墨修飾膜，然后以HAuCl4為原料，使用恒電位法電沉積金，即可得到納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極，得工作電極。
所述的方法，其所述的離子液體碳糊電極可為離子液體碳糊電極、金屬電極、非金屬電極或氧化電極。
(3)以L-胱氨酸(Cystine)或含有二硫鍵的物質(zhì)和功能化的DNAl修飾磁性微珠，制備功能化磁性微珠，磁性微珠作為載體負(fù)載含二硫鍵的物質(zhì)和功能化的DNAl。
(4)利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫鍵作用，將(3)中制備的功能化磁性微珠表面的DNAl切割下來，釋放DNAl ;隨后對釋放出的DNAl進(jìn)行測定，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽的測定。
(5)利用(4)中釋放出來的DNAl對納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極進(jìn)行修飾，在電極表面形成捕獲DNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中去捕獲電化學(xué)探針。
(6)電化學(xué)探針(EC probe)的制備。利用硫堇在納米金表面的吸附作用，制備硫堇修飾的金納米粒子，然后將DNA2負(fù)載其上，制備DNA2/硫堇/納米金信號(hào)放大單元，即電化學(xué)探針。
(7)電化學(xué)檢測。將DNAl/納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊工作電極浸入電化學(xué)探針溶液中，利用DNA雜交作用，DNAl將DNA2/硫堇/納米金信號(hào)放大單元捕獲在電極表面，引起電極表面電活性物質(zhì)濃度的變化，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽的檢測。
所述的方法，其所述的離子液體碳糊電極可為離子液體碳糊電極、金屬電極、非金屬電極或氧化電極。
所述的方法，其所述的電活性物質(zhì)為硫堇、聯(lián)吡啶釕、亞甲基蘭以及含正電荷的電活性物質(zhì)。


圖I為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)原理示意圖。
圖 2 為不同修飾電極在 I. Ommol L—1 [Fe (CN) 6] 3_/4_ 和 O. 5mol L—1 KCl 溶液中的循環(huán)伏安圖。
圖3為不同濃度目標(biāo)物的差分脈沖伏安法曲線。從a到f谷胱甘肽濃度依次為 1.0X IO-12,1.0X IO-11,1.0X IO-10,1.0X IO-9,1.0X IO-8,1.0X 10_7mol L' 插圖濃度的對數(shù)對峰電流的關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但本發(fā)明的實(shí)施方法不限于此。實(shí)例·
I本發(fā)明所用的試劑
①I-己基吡啶六氟磷酸鹽(HPPF6，>99%,中科院蘭州化物所綠色化學(xué)與催化中心)石墨粉(上海膠體化學(xué)廠，顆粒度< 30 μ m) 氯金酸(HAuCl4，中國上海試劑一廠)；④乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，美國Sigma公司)； N_羥基琥珀酰亞胺(NHS，上海延長生化公司)；⑥氨基磁珠(Aminated MB)(天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)；十二烷基磺酸鈉(SDS，上海亨達(dá)精細(xì)化學(xué)品有限公司)；⑦鐵氰化鉀(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)L-胱氨酸(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；⑨谷胱甘肽、⑩巰基乙酸(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；O硫堇(中國上海試劑一廠)。
2不同種類的緩沖溶液如下①IXTEA緩沖溶液(40.0mmol/L Tris,I. Ommol /T, EDTA, 40. Ommol /I,醋酸，pH = 8. O),② 50. Ommol /T, Tris-HCl 緩沖溶液(pH =7. O), 50. Ommo I/LTri s-EDTA (TE, pH = 8. O);③實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。
3 氧化石墨烯由改進(jìn)的 Hummer 法(Hummers, ff. S. , Offeman, R. E. , 1958.J. Am. Chem. Soc. 80,1339)合成。
4①DNAl、②DNA2序列由上海生工生物技術(shù)有限公司購得，序列如下
4. I DNAl :3’ -NH2-CCA GCA AGT TGG AGT CTG-5，；
4.2 DNA2 :3’ -SH-CAG ACT CCA ACT-5’ ；
4. 3 DNAl和DNA2的系列優(yōu)選為DNA1的3’端為氨基；其功能基團(tuán)與磁珠上連接的L-胱氨酸的羧基實(shí)現(xiàn)DNAl的固定。DNA2的3’端為巰基；其功能基團(tuán)與電極表面的金形成S-Au鍵實(shí)現(xiàn)DNA2的固定。DNAl的5’端與DNA2的3’端部分互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)雜交。
5電沉積法制備納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極
5. I離子液體碳糊電極制備。將3.2g碳粉、1.6g 1_己基吡啶六氟磷酸鹽和500 μ L液體石蠟混合，80°C研磨均勻后將適量填入玻璃管中，接銅絲作為導(dǎo)線，使用時(shí)在稱量紙上打磨至鏡面。
5. 2石墨烯修飾離子液體碳糊電極制備
5. 2. I將新制備的離子液體碳糊電極浸泡在I. Omg/mL的氧化石墨烯溶液中，緩慢攪拌并通入氮?dú)猓?br> 5. 2. 2在-I. 3V(vs. SCE)電還原600s，取出用二次蒸餾水充分沖洗后用N2吹干，即可在離子液體碳糊電極表面形成一層穩(wěn)定的電化學(xué)還原石墨烯修飾膜，此修飾電極表示為石墨烯修飾離子液體碳糊電極。
5. 3納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極制備將新制備的石墨烯修飾離子液體碳糊電極在5. Ommol/L HAuCl4和O. 5mol/L KNO3混合溶液中于-O. 4V (vs. SCE)電位范圍內(nèi)使用恒電位法電沉積，即可得到納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極。用二次水沖洗該電極，用N2吹干后備用。
5.4 在室溫(25°C 左右)下在含有 10. Ommol/L [Fe (CN)6]3* 和 O. 5mol/LKCl溶液中對電極進(jìn)行表征。
6膠體金的制備
6. 2然后用二次水沖洗干凈，烘干備用；
6. 3在IOOOmL圓底燒瓶中加入500mL，ImM的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰；
6. 4快速加入50mL，38. 8mM的Na3C6H5O7，再加熱10分鐘，攪拌15分鐘，然后冷卻至室溫后用0. 8μπι的尼龍膜過濾器過濾，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中于陰涼處保存；
6. 5用掃描電鏡觀察膠體金的粒徑為20_25nm。
7L-胱氨酸/DNAl修飾的磁性微珠制備過程如原理圖所示，具體過程如下
7. I 取 2mL ICT3M 的 L-胱氨酸溶液，加入 ImL EDC+NHS 混合溶液(5. OmMEDC, NHS和10. OmM Tris-HCl緩沖溶液，pH = 7. 4)，以活化L-胱氨酸的-C00H,反應(yīng)30分鐘；
7. 2加入50 μ L氨基磁珠，37°C恒溫下繼續(xù)反應(yīng)；
7. 3反應(yīng)后的物質(zhì)用PBS緩沖溶液洗滌三次，得到L-胱氨酸修飾的磁性微珠;
7. 4在L-胱氨酸修飾的磁性微珠溶液中加入200 μ L ICT6M的氨基化DNAl，恒溫37°C下反應(yīng)12h ；
7. 5反應(yīng)后的物質(zhì)用PBS緩沖溶液洗滌三次，得L-胱氨酸/DNAl修飾的磁性微珠。
8負(fù)載硫堇金納米粒子探針的制備
8. I向巰基DNA2溶液中加入醋酸鹽緩沖溶液(pH = 5. 2)和10 μ L磷酸三氯乙酯，反應(yīng)lh，用以活化巰基；
8. 2取ImL上述8. I中剛合成好的新鮮的膠體金溶液，加入硫堇溶液，反應(yīng)O. 5h，使硫堇充分吸附在膠體金上；
8. 4把混合物放在15000轉(zhuǎn)的離心機(jī)中離心30分鐘，得到紅色沉淀；
8. 5把得到的紅色沉淀用PBS緩沖溶液洗滌并離心，重復(fù)三次，用PBS緩沖溶液(pH = 8. O)分散，即得到DNA2/硫堇金納米粒子探針，放在4°C下避光保存?！?br> 9谷胱甘肽含量的檢測
9. I取含谷胱甘肽的樣品溶液50 μ L加入到DNA1/L-胱氨酸修飾的磁性微珠溶液中，反應(yīng)12h，磁性分離，即得含有-SH的DNA上清液；
9. 2將5. O μ L上述10. I中的上清液滴涂在納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極表面，使其在室溫下雜交20分鐘后，依次用O. 5%的SDS溶液和二次水洗滌，即得到DNAl/納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極；
9.4電化學(xué)測定。以述9. 3所得電極為工作電極，利用差分脈沖伏安法在PBS緩沖溶液(pH = 8. O)中以100mV/S的掃速進(jìn)行掃描，電位掃描范圍為-O. 7-0. IV。
10結(jié)果與討論
10. I納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極的電化學(xué)表征
10. I. I圖2為離子液體碳糊電極，石墨烯修飾離子液體碳糊電極，納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極在I. Ommol Γ1 [Fe (CN) 6] 3_/4_和O. 5mol Γ1 KCl溶液中的循環(huán)伏安 10. I. 2曲線a上可以看到一對對稱的氧化還原峰，峰電位差為98mV，這說明離子液體碳糊電極中的離子液體起到了很好的導(dǎo)電作用；
10. I. 3在石墨烯修飾離子液體碳糊電極上(曲線b)，峰電流明顯增大、電位差明顯減小為74mV，這是由于離子液體碳糊電極的表面高導(dǎo)電性的石墨烯修飾膜極大的增加了電子傳遞能力；石墨烯可以與離子液體的芳香環(huán)發(fā)生共軛效應(yīng)，因此為電子從石墨烯膜到離子液體碳糊電極表面構(gòu)建了快速電子傳遞的通道；
10. I. 4響應(yīng)電流在納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極(曲線c)上繼續(xù)增大，同時(shí)電位差減小為62mV，這是由于電極表面的納米金和石墨烯層的協(xié)同放大效應(yīng)。電化學(xué)還原石墨烯不僅可以增加修飾電極的導(dǎo)電性，同時(shí)還可以為納米金的沉積提供更大的表面積，所以納米金/石墨烯復(fù)合修飾膜可以減小[Fe(CN)6]3_/4_向電極表面轉(zhuǎn)移電子的阻力；
10. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品的采集測定。
10. 2. I標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制不同濃度的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其電化學(xué)信號(hào)，氧化峰電流與谷胱甘肽濃度的對數(shù)值成良好的線性關(guān)系，線性范圍為1.0Xl(T12mol Γ1 I. 0Xl(T7mol Γ1，檢測限為 4. I X l(T13mol L—1(如圖 3)。
10. 2. 2樣品的采集測定。
10. 2. 3培養(yǎng)小鼠急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系p388，貼壁生長達(dá)到80%以上時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞液提取
I、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞用2mL胰酶消化2_3分鐘，倒掉胰酶，加入約5mL培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹散使細(xì)胞懸浮，離心收集細(xì)胞；
2、在細(xì)胞中加入3mL 4°C預(yù)冷的PBS(pH7. 2,0. 01M)，洗滌細(xì)胞，離心，然后
棄去洗液，重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液；
3、細(xì)胞重新懸浮于 3mL PBS-EDTA 緩沖溶液中(PBSE，pH7. 4,0. 10M)，均質(zhì)化后加入3%高氯酸以沉淀細(xì)胞中的蛋白物質(zhì)，整個(gè)操作在冰上進(jìn)行；
4、4°C下 14，OOOrpm 離心 5 分鐘；
5、收集上清液用于，檢測；
6、差分脈沖伏安法在PBS緩沖溶液(pH = 8. O)中以100mV/s的掃速進(jìn)行掃描，電位掃描范圍為-O. 7-0. IV ；·
7、在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對提取好的小鼠急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系p388上清液(每份400μ 進(jìn)行檢測，測定含量為1.62X10-8mol/L。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、代替、組合、簡化，較為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于納米金和硫堇信號(hào)放大技術(shù)及其在測定谷胱甘肽的應(yīng)用，其特征包括以下步驟 (a)以離子液體為修飾劑，制備離子液體碳糊電極； (b)以電化學(xué)還原石墨烯和納米金共沉淀修飾離子液體碳糊電極； (c)以L-胱氨酸和DNA修飾磁性微珠； (d)利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫鍵作用，切割釋放DNA； (e)以釋放的DNA對納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極電極進(jìn)行修飾； (f)以金納米粒子和硫堇信號(hào)放大構(gòu)建信號(hào)放大技術(shù)和谷胱甘肽切割L-胱氨酸作用，建立一種高靈敏度測定谷胱甘肽的新方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于(a)中以離子液體I-己基吡啶六氟磷酸鹽為修飾劑制備離子液體碳糊電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于(b)中利用恒電位電沉積法制備金納米金/石墨烯修飾電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于(c)中以L-胱氨酸或含有二硫鍵的物質(zhì)和功能化的DNAl修飾磁性微珠,制備功能化磁性微珠。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于(d)中利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫鍵作用，將功能化磁性微珠表面DNAl切割下來，釋放DNAl。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于(e)中利用釋放的DNAl對納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極電極進(jìn)行修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于(f)中利用納米金對硫堇的吸附作用，制備硫堇修飾的金納米粒子，然后將DNA2負(fù)載其上，制備DNA2/硫堇/納米金信號(hào)放大單元；利用DNA雜交作用，DNAl將DNA2/硫堇/納米金信號(hào)放大單元捕獲在電極表面，引起電極表面電活性物質(zhì)濃度的變化，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽的檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于工作電極為離子液體修飾碳糊電極、金屬電極、非金屬電極或氧化電極。
全文摘要
本發(fā)明實(shí)施例公開了一種基于納米金和硫堇信號(hào)放大技術(shù)和電化學(xué)檢測還原型谷胱甘肽(GSH，下稱谷胱甘肽)的方法。以L-胱氨酸和DNA1修飾磁性微珠，利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫鍵作用將磁性微珠表面的DNA1切割釋放下來；將釋放出來的DNA1對納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極進(jìn)行修飾。將DNA2負(fù)載在硫堇修飾的金納米粒子表面得電化學(xué)探針。將DNA1/納米金/石墨烯修飾離子液體碳糊電極浸入電化學(xué)探針溶液中，DNA1將DNA2/硫堇/納米金信號(hào)放大單元捕獲在電極表面，引起電極表面電化學(xué)探針濃度的變化，進(jìn)行電化學(xué)測定。本發(fā)明利用納米金和硫堇信號(hào)放大技術(shù)和電化學(xué)檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對谷胱甘肽高靈敏度測定。
文檔編號(hào)G01N27/30GK102914570SQ20121020814
公開日2013年2月6日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者混旭, 孫偉, 朱歡歡 申請人:青島科技大學(xué)