一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及谷胱甘肽的生產(chǎn)工藝，具體的說一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法。將釀酒酵母菌泥經(jīng)酸性熱水抽提離心，收集上清液調(diào)節(jié)pH至酸性后經(jīng)陽離子交換樹脂純化，并以可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫組分再經(jīng)凝膠柱純化洗脫，洗脫組分即為還原型谷胱甘肽。本發(fā)明采用合理的抽提條件，使谷胱甘肽最大程度地從細(xì)胞中溶解出來，并使谷胱甘肽在高溫條件下的損失達(dá)到最低。抽提液與谷胱甘肽溶液在酸性條件下處于水溶液中最穩(wěn)定的狀態(tài)，同時(shí)可去除部分雜質(zhì)。在谷胱甘肽的溶液與純化設(shè)備中充入惰性氣體，避免谷胱甘肽與空氣中的氧接觸，防止谷胱甘肽氧化。該方法步驟少，成本低，谷胱甘肽的得率與純度較高，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及谷胱甘肽的生產(chǎn)工藝，具體的說一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]還原性谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的一種含有巰基的三肽化合物，廣泛存在于植物和動(dòng)物的細(xì)胞中，是細(xì)胞的主要代謝產(chǎn)物。谷胱甘肽具有多種生理活性，如作為抗氧化劑保護(hù)酶和其它蛋白質(zhì)巰基；維持紅細(xì)胞膜的完整性；解除毒物及抗衰老等方面具有重要的作用。隨著研究的不斷深入，谷胱甘肽在臨床醫(yī)學(xué)、食品添加劑和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用日益正引起人們的關(guān)注，市場(chǎng)前景需求量不斷加大。
[0003]現(xiàn)今，國(guó)外已有關(guān)于谷胱甘肽分離純化的工藝，但都處于保密階段；國(guó)內(nèi)對(duì)于還原型谷胱甘肽的分離純化正處于研究階段，谷胱甘肽的生產(chǎn)和純化技術(shù)仍有待提高。
[0004]GSH的生產(chǎn)方法主要有:溶劑萃取法、化學(xué)合成法、生物發(fā)酵法和酶法。早期大多采用溶劑萃取法和化學(xué)合成法生產(chǎn)GSH，目前主要以生物發(fā)酵法，特別是酵母發(fā)酵法來進(jìn)行生產(chǎn)。
[0005]萃取法主要以富含GSH的動(dòng)植物組織和酵母為原料，通過添加適當(dāng)?shù)娜軇┗蚪Y(jié)合淀粉酶、蛋白酶處理，再分離精制而成。苑小林(苑小林，等.鮮酵母中谷胱甘肽(GSH)分離純化的初步研究[J].藥物生物技術(shù)，1998，5(2):89-91)曾報(bào)道溶劑萃取法具有收率低、成本聞、效益差等缺點(diǎn)。
[0006]化學(xué)合成法生產(chǎn)工藝較為成熟，但魏雪芹(魏雪芹，等.谷胱甘肽的生產(chǎn)及應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代面粉工業(yè)，2009，(2):52-54)通過研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)合成法存在成本高、反應(yīng)步驟多、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜等缺陷。并且合成后反應(yīng)液中的化合物復(fù)雜，分離困難，還會(huì)造成環(huán)境污染。
[0007]酶法合成GSH是利用生物體內(nèi)的天然谷胱甘肽合成酶，以L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸為底物，并添加少量三磷酸腺苷等即可合成GSH。酶法具有生產(chǎn)過程簡(jiǎn)化、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。但由于微生物細(xì)胞中GSH合成酶系的活性普遍較低，而且要有一個(gè)廉價(jià)的ATP再生方式，所以目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段(何俊勇.高產(chǎn)谷胱甘肽新菌種的選育及其工藝條件的研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學(xué)，2004)。
[0008]生物發(fā)酵法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)速率快等優(yōu)點(diǎn)，受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。目前應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)的谷胱甘肽，盡管在產(chǎn)量上有了大幅提高，但在分離純化的工藝仍有待提高。在國(guó)家專利(申請(qǐng)?zhí)?00510002408.3)中選擇含有-S-R基團(tuán)或-S-S-R基團(tuán)的可以與巰基特異性結(jié)合的離子交換樹脂法分離純化谷胱甘肽，夠制得獲得高純度的谷胱甘肽。但在層析過程中試用高濃度的酸或堿做洗脫液，谷胱甘肽的損失大。在國(guó)家專利(申請(qǐng)?zhí)?00810233835.6)中，選擇陽離子樹脂、吸附樹脂、乙醇結(jié)晶等方法獲得高純度的谷胱甘肽。但該工藝缺少在工藝過程中對(duì)谷胱甘肽的保護(hù)，并且在陽離子樹脂吸附過程中，含有一價(jià)陽離子的洗脫液會(huì)在后續(xù)工藝中大量殘留，影響谷胱甘肽純度。
[0009]目前，谷胱甘肽的生產(chǎn)純化工藝中存在成本高、收率低、純度低、環(huán)境污染等問題。提高收率與純度，降低工藝成本，減少對(duì)環(huán)境的污染是實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽工業(yè)生產(chǎn)的重心所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的在于一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0012]一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，將釀酒酵母菌泥經(jīng)酸性熱水抽提離心，收集上清液調(diào)節(jié)pH至酸性后經(jīng)陽離子交換樹脂純化，并以可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫組分再經(jīng)凝膠柱純化洗脫，洗脫組分即為還原型谷胱甘肽。 [0013]具體為:
[0014]I)將釀酒酵母菌泥加入水中并調(diào)節(jié)pH至酸性，再經(jīng)加熱浸提將菌液放置于沸水浴中浸提后置于冰浴冷卻至室溫，待用；
[0015]2)將上述冷卻后浸提液離心，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液中通入惰性氣體；
[0016]3)將上述上清液采用陽離子交換樹脂上進(jìn)行吸附，并以可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液洗脫，收集富含谷胱甘肽的收集液，收集液減壓蒸干固體，待用；
[0017]4)將上述減壓蒸干固體溶于水中并充入惰性氣體，而后經(jīng)凝膠柱純化洗脫，洗脫組分真空濃縮，濃縮液經(jīng)醇重結(jié)晶，結(jié)晶液減壓蒸干，獲得白色粉末狀谷胱甘肽純品固體。
[0018]將釀酒酵母的發(fā)酵液以濾膜壓濾方式獲得菌泥，即釀酒酵母菌泥；按質(zhì)量比1:4的比例將菌泥與去離子水混合，并用無機(jī)酸調(diào)節(jié)PH至1.0-3.0，而后加熱至85-95°C于沸水浴中浸提，浸提后采用冰浴冷卻至室溫。
[0019]所述壓濾的濾膜孔徑為0.22 μ m-10.0 μ m ;無機(jī)酸為硫酸，硝酸或鹽酸。
[0020]將上述冷卻后的浸提液于5000r/min的條件下離心10min，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液采用無機(jī)酸調(diào)節(jié)pH至1.0-3.0，而后以0.1-0.5mL/s充氣速度將惰性氣體通入其中。
[0021 ] 所述無機(jī)酸為硫酸，硝酸或鹽酸。
[0022]所述可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液為氯化銨、碳酸氫銨、氨水或鹽酸。
[0023]所述步驟3)和步驟4)減壓蒸干的條件，真空度為-0.79Mpa—0.04Mpa加熱溫度為 50-60。。。
[0024]所述陽離子交換樹脂柱為:(大孔樹脂DOOl X 7強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂)
[0025]本發(fā)明所提供的還原型谷胱甘肽生產(chǎn)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0026]1.在谷胱甘肽的貯存和分離的過程中，始終保持溶液處于酸性狀態(tài)，谷胱甘肽在酸性條件下以陽離子形式存在，性質(zhì)最為穩(wěn)定，不易氧化。
[0027]2.在谷胱甘肽的分離過程中充惰性氣體隔絕空氣，避免谷胱甘肽被環(huán)境中的氧氧化。
[0028]3.在陽離子交換樹脂純化過程中，以可揮發(fā)性銨鹽、可分解性銨鹽和可揮發(fā)性無機(jī)酸做洗脫液。在之后的真空干燥中，洗脫液可完全除去，避免了洗脫液對(duì)谷胱甘肽純度的干擾。[0029]4.本發(fā)明采用合理的抽提條件，使谷胱甘肽最大程度地從細(xì)胞中溶解出來，并使谷胱甘肽在高溫條件下的損失達(dá)到最低。抽提液與谷胱甘肽溶液在酸性條件下處于水溶液中最穩(wěn)定的狀態(tài)，同時(shí)可去除部分雜質(zhì)。在谷胱甘肽的溶液與純化設(shè)備中充入惰性氣體，避免谷胱甘肽與空氣中的氧接觸，防止谷胱甘肽氧化。采用可揮發(fā)的銨鹽和揮發(fā)性無機(jī)酸做陽離子樹脂的洗脫液，可排除洗脫液中鹽性成分對(duì)谷胱甘肽純度的影響。利用陽離子樹脂與葡聚糖凝膠純化谷胱甘肽，可直接結(jié)晶。該方法步驟少，成本低，谷胱甘肽的得率與純度較高，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，包括以下步驟:
[0031](I)壓濾發(fā)酵液:發(fā)酵液下罐后，以濾膜壓濾方式獲得菌泥，得釀酒酵母y菌泥；谷胱甘肽的發(fā)酵水平至少應(yīng)達(dá)到15mg/g。
[0032](2) 酸性熱水抽提:稱量菌泥質(zhì)量，按適當(dāng)比例加入去離子水，無機(jī)酸調(diào)節(jié)至酸性，加熱浸提將菌液放置于沸水浴中浸提后一段時(shí)間后立即置于冰浴冷卻至室溫；抽提液的加熱溫度為85-95°C。
[0033](3)收集提取液:離心提取液，除酵母殘?jiān)酶缓入赘孰牡奶崛∫骸?br> [0034](4)調(diào)節(jié)提取液pH:以無機(jī)酸調(diào)節(jié)提取液pH至酸性，此時(shí)谷胱甘肽在水溶液中最穩(wěn)定，不易氧化。
[0035](5)惰性氣體保護(hù):向提取液和層析柱樹脂水層以上空間中通入惰性氣體；所述的惰性氣體為氮?dú)饣蚝猓栊詺怏w充入量不少于十個(gè)原容器體積，充氣速度不大于
0.5mL/s。
[0036](6)陽離子交換樹脂純化:將提取液在酸性的條件下在陽離子交換樹脂上進(jìn)行吸附，可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液洗脫，得到富含谷胱甘肽的溶液。
[0037](7)真空干燥:將陽離子交換樹脂過程收集的洗脫液減壓蒸干，得白色粉末狀固體。
[0038](8)惰性氣體保護(hù):將得到的白色固體溶于去離子水一定濃度的溶液，并向溶液中通入惰性氣體。所述的惰性氣體為氮?dú)饣蚝?，惰性氣體充入量不少于十個(gè)原容器體積，充氣速度不大于0.5mL/s。
[0039](9)Sephadex G-10純化:溶液在凝膠上進(jìn)行吸附，以去離子水洗脫，得富含谷胱甘肽的溶液。
[0040](10)真空濃縮:將經(jīng)分子篩層析的洗脫液減壓蒸干濃縮，使谷胱甘肽的濃度大于200mg/mL。
[0041](11)結(jié)晶:在谷胱甘肽溶液中加入乙醇至終濃度70%以上，無機(jī)酸調(diào)整至酸性，4 °C冰箱結(jié)晶。
[0042](12)真空干燥:將上述結(jié)晶液減壓蒸干，獲得白色粉末狀谷胱甘肽純品固體。
[0043]實(shí)施例1
[0044]取IOL發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液6L，在0.22 μ m的濾膜下壓濾，得釀酒酵母y235菌泥(該菌購(gòu)自美國(guó)紅星酵母產(chǎn)品公司y-30，原菌號(hào):As2.501)，獲得的菌泥用0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌，并以5000r/min條件下離心10min，反復(fù)三次，得到干凈的菌泥。[0045]稱量菌泥質(zhì)量為64.2g，按質(zhì)量比1:4加入去離子水，以硫酸調(diào)節(jié)提取液pH2.0，將提取液放置于95°C水浴中浸提IOmin后，立即置于冰浴冷卻至室溫。以5000r/min離心提取液lOmin，去除酵母殘?jiān)?，得富含谷胱甘肽的提取?50mL，紫外吸收法測(cè)量提取液中GSH的含量為0.92g。以H2SO4調(diào)節(jié)提取液pH至3.0,0.5mL/s的速度向提取液中通入氮?dú)?，同時(shí)向裝好的層析柱樹脂水層以上空間及各容器中充入氮?dú)?。將提取液在PH3.0的條件下吸附于大孔樹脂DOOl X 7，以0.lmol/L的150mL氨水洗脫。收集洗脫液，將溶液在真空，60°C條件下真空干燥，得到白色粉末狀固體。將得到的白色固體溶于5mL去離子水，向溶液及各容器中充入氮?dú)?。將溶液在S^hadex G-1O凝膠上進(jìn)行吸附，去離子水洗脫，得到富含谷胱甘肽的溶液32.5mL。將所得溶液于60°C條件下真空干燥，使谷胱甘肽的濃度大于200mg/mL。在谷胱甘肽溶液中加入乙醇，乙醇加入體積占谷胱甘肽溶液總體積的70%，調(diào)pH3.0，4°C環(huán)境結(jié)晶。于60°C條件下真空干燥，得白色粉末狀固體0.68g，紫外吸收法測(cè)定谷胱甘肽的質(zhì)量為0.67g。GSH的最終收率為73.1 %，純度98.1 %。
[0046]實(shí)施例2
[0047]取IOL發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液6L，在0.22 μ m的濾膜下壓濾，得釀酒酵母y235菌泥，獲得的菌泥以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液洗漆,并于5000r/min條件下離心10min,反復(fù)三次，得到干凈的菌泥。 稱量菌泥質(zhì)量65.4g，熱水抽提后得富含谷胱甘肽的提取液260mL，紫外吸收法測(cè)量提取液中GSH的含量為0.93g。而后按上述實(shí)施例中記載不在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下進(jìn)行操作，得白色粉末狀固體0.62g，紫外吸收法測(cè)定谷胱甘肽的質(zhì)量為0.61g。GSH的最終收率為65.4%，純度96.8%0
[0048]實(shí)施例3
[0049]取IOL發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液6L，按上述實(shí)施例的方式獲得菌泥。稱量菌泥質(zhì)量62.5g，熱水抽提后得富含谷胱甘肽的提取液250mL，紫外吸收法測(cè)量提取液中GSH的含量為0.89g。以大孔樹脂DOOl X 7陽離子交換樹脂對(duì)富含谷胱甘肽進(jìn)行純化，0.lmol/L鹽酸做洗脫液。而后按上述實(shí)施例中記載在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下進(jìn)行操作，得白色粉末狀固體0.51g，紫外吸收法測(cè)定谷胱甘肽的質(zhì)量為0.50g。GSH的最終收率為56.3 %，純度97.7 %。
【權(quán)利要求】
1.一種從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:將釀酒酵母菌泥經(jīng)酸性熱水抽提離心，收集上清液調(diào)節(jié)PH至酸性后經(jīng)陽離子交換樹脂純化，并以可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫組分再經(jīng)凝膠柱純化洗脫，洗脫組分即為還原型谷胱甘肽。
2.按權(quán)利要求1所述的從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于具體為: 1)將釀酒酵母菌泥加入水中并調(diào)節(jié)PH至酸性，再經(jīng)加熱浸提將菌液放置于沸水浴中浸提后置于冰浴冷卻至室溫，待用； 2)將上述冷卻后浸提液離心，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液中通入惰性氣體； 3)將上述上清液采用陽離子交換樹脂上進(jìn)行吸附，并以可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液洗脫，收集富含谷胱甘肽的收集液，收集液減壓蒸干固體，待用； 4)將上述減壓蒸干固體溶于水中并充入惰性氣體，而后經(jīng)凝膠柱純化洗脫，洗脫組分真空濃縮，濃縮液經(jīng)醇重結(jié)晶，結(jié)晶液減壓蒸干，獲得白色粉末狀谷胱甘肽純品固體。
3.按權(quán)利要求1或2從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:將釀酒酵母的發(fā)酵液以濾膜壓濾方式獲得菌泥，即釀酒酵母菌泥；按質(zhì)量比1:4的比例將菌泥與去離子水混合，并用無機(jī)酸調(diào)節(jié)PH至1.0-3.0，而后加熱至85-95°C于沸水浴中浸提，浸提后采用冰浴冷卻至室溫。
4.按權(quán)利要求3從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:所述壓濾的濾膜孔徑為0.22 μ m-10.0 μ m ;無機(jī)酸為硫酸，硝酸或鹽酸。
5.按權(quán)利要求1或2從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:將上述冷卻后浸提液離心，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液采用無機(jī)酸調(diào)節(jié)PH至1.0-3.0,而后以01.-0.5mL/s充氣速度將惰性氣體通入其中。
6.按權(quán)利要求5從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:所述無機(jī)酸為硫酸，硝酸或鹽酸。
7.按權(quán)利要求1或2從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:所述可揮發(fā)性銨鹽或可揮發(fā)性無機(jī)酸溶液為氯化銨、碳酸氫銨、氨水或鹽酸。
8.按權(quán)利要求2從酵母菌體中純化還原型谷胱甘肽的方法，其特征在于:所述步驟3)和步驟4)減壓蒸干的條件，真空度為-0.79Mpa一-0.04Mpa加熱溫度為50_60°C。
【文檔編號(hào)】C07K5/037GK103923167SQ201310010072
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】張惠文, 王碩, 徐明愷, 張成剛, 蘇振成 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所