本發(fā)明涉及藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種黨參多糖cop-w1及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黨參(codonopsisradix)為桔?？泣h參屬植物，有健脾益肺，養(yǎng)血生津之功效，主治于脾肺氣虛，食少倦怠，咳嗽虛喘，氣血不足，面色萎黃，心悸氣短，津傷口渴，內(nèi)熱消渴等癥。在亞洲中部和東部地區(qū)分布有42個(gè)黨參物種，而在中國發(fā)現(xiàn)40種，主要分布于山西、陜西、四川、甘肅等省份。近年來的研究發(fā)現(xiàn)黨參中的主要成分包括甾醇類、三萜類、黨參苷類、內(nèi)酯類、生物堿類和多糖。而多糖作為生物活性物質(zhì)，能夠抗病毒，并其可提高機(jī)體免疫力，并具有低毒和低耐藥性等特點(diǎn)，已引起醫(yī)藥界的高度重視，顯示了廣闊的藥用前景。近年來不斷有實(shí)驗(yàn)對黨參多糖進(jìn)行研究分析，已發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗病毒和抗氧化等等，而多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)緊密相關(guān)。為了探索其藥理活性機(jī)制，則需要更加明確解析黨參均一多糖的結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種黨參多糖cop-w1；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該黨參多糖cop-w1的制備方法；

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供黨參多糖cop-w1在制備抗氧化劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：黨參多糖cop-w1，分子量為2.34×10⁴da，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖及半乳糖組成，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖及半乳糖的摩爾比為20.3：1：1.3：36.1；其結(jié)構(gòu)單元為：

黨參多糖cop-w1的制備方法，包括如下步驟：

1)將干燥黨參塊根，剪切成1-2cm的小節(jié)，用7-8倍量工業(yè)酒精加熱回流3-5次進(jìn)行脫脂；

2)將步驟1)中脫脂后的藥渣用5-7倍量水提3次，溫度為90℃，將水提液減壓濃縮后，加入質(zhì)量百分比為95％的乙醇至含醇量達(dá)80-82％，靜置24h，棄去上清液，收集沉淀；

3)將步驟2)中沉淀復(fù)溶后加胃蛋白酶至其含量為0.3-0.5％，于37℃下恒溫水浴12h，去除沉淀，重復(fù)至紫外掃描無蛋白特征吸收峰；

4)對步驟3)中上清液濃縮后加5-6倍量工業(yè)酒精，靜置24h，收集沉淀，重復(fù)3次后進(jìn)行冷凍干燥，得黨參粗多糖粉末；

5)將步驟4)中獲得的黨參粗多糖粉末用蒸餾水完全溶解后經(jīng)sephacryls-200hr凝膠柱分離，用0.2mol/l的nacl溶液洗脫，再用苯酚硫酸法檢測，收集洗脫曲線中的主峰部分；

6)將步驟5)中收集的洗脫液濃縮后，采用sephadexg-25凝膠柱分離，蒸餾水洗脫，再用3500da的透析袋透析2d脫鹽，最后收集袋內(nèi)的溶液進(jìn)行濃縮冷凍干燥，得到黨參多糖cop-w1。

黨參多糖cop-w1在制備抗氧化劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了通過水提醇沉法提取，sephacryls-200hr凝膠柱分離純化等方案，得到了分子量為2.34×10⁴da、由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖組成的具有分子量的黨參均一多糖，得到的黨參均一多糖具有抗氧化活性，可清除dpph自由基，具有一定的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為黨參粗多糖組分過sephacryls-200hr柱的洗脫曲線；

圖2為cop-w1的hpgpc凝膠色譜圖；

圖3為dextran系列多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4為六種標(biāo)準(zhǔn)單糖pmp衍生后hplc譜圖；

圖5為cop-w1pmp衍生后hplc譜圖；

圖6為cop-w1的ir譜圖；

圖7為cop-w1甲基化后的總離子流色譜圖；

圖8為2,3,4-me3-galp的質(zhì)譜圖；

圖9為2,3,4,6-me4-galp的質(zhì)譜圖；

圖10為3,4-me2-galp的質(zhì)譜圖；

圖11為2,3,6-me3-manp的質(zhì)譜圖；

圖12為2,3,6-me3-galp的質(zhì)譜圖；

圖13為2,4-me2-manp的質(zhì)譜圖；

圖14為2,4,6-me3-galp的質(zhì)譜圖；

圖15為2,3,4-me3-manp的質(zhì)譜圖；

圖16為cop-w1的¹h譜圖；

圖17為cop-w1的¹³c譜圖；

圖18為cop-w1的hsqc譜圖；

圖19為cop-w1的hmbc譜圖；

圖20為cop-w1的¹h-¹hcosy譜圖；

圖21為vc對dpph自由基的清除率；

圖22為cop-w1和vc對dpph自由基的清除率對比圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例1：黨參多糖cop-w1的制備

1.黨參粗多糖的提?。?/p>

將干燥黨參塊根，剪切成1cm左右小節(jié)，用7倍量工業(yè)酒精加熱回流3次，脫脂后的藥渣用5倍量水提3次，溫度為90℃，水提液減壓濃縮，加入95％乙醇至含醇量達(dá)80％，靜置24h，棄去上清液，收集沉淀；沉淀復(fù)溶后加胃蛋白酶至其含量為0.3％，于37℃下恒溫水浴12h，去除沉淀，重復(fù)4次至紫外掃描無蛋白特征吸收峰；上清液濃縮后加5倍量工業(yè)酒精，靜置24h，收集沉淀，重復(fù)3次后冷凍干燥，得黨參粗多糖粉末。

2.黨參多糖的純化：

取黨參粗多糖1g，用10ml水溶解，經(jīng)sephacryls-200hr柱分離，0.2mol/l的nacl溶液洗脫，苯酚硫酸法檢測，收集洗脫曲線中的主峰部分，濃縮后采用sephadexg-25凝膠柱分離，蒸餾水洗脫，再用3500da的透析袋透析2d脫鹽，之后冷凍干燥，得到黨參多糖cop-w1。

3.黨參多糖cop-w1的純度鑒定：

高效液相色譜條件：ultrahydrogel250色譜柱，流動(dòng)相為0.2mol/l的nano3溶液，流速為0.6ml/min，柱溫35℃，檢測器為rid(示差折光檢測器)。多糖cop-w1用適量水溶解，進(jìn)樣量為20μl，結(jié)果色譜圖中呈單一對稱峰，說明該組分為均一多糖。

4.黨參多糖cop-w1分子量的確定：

取1mg分子量為1k、5k、12k、25k、50kda的普魯蘭多糖分別溶于1ml水中，色譜條件同上，用高效液相分析。記錄保留時(shí)間，以分子量的對數(shù)(logm)為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝2.544+0.6998x-0.0473x²，將cop-w1出峰時(shí)間代入曲線方程，得cop-w1的分子量為2.34×10⁴da。

實(shí)施例2：黨參均一多糖cop-w1的結(jié)構(gòu)表征

1.多糖組分分析：

取少量的cop-w1經(jīng)4mol/lcf3cooh在110℃條件下水解4h，水解反應(yīng)結(jié)束后蒸干水解液，加100μl0.6mol/lnaoh溶液充分溶解，加200μl0.5mol/lpmp甲醇溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，密封，漩渦混勻，于70℃水浴下反應(yīng)100min，冷卻，再加200μl0.3mol/lhcl溶液中和，加水至終體積為1ml，再用1ml氯仿萃取，收集上層水相，重復(fù)萃取3次，用0.22μm微孔濾膜過濾，取20μl進(jìn)行hplc分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖pmp衍生物出峰時(shí)間對照確定：cop-w1主要是甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖組成，摩爾比為20.3:1:1.3:36.1。

2.多糖ir分析：

樣品采用kbr壓片法進(jìn)行ir掃描，從ir圖中cop-w1呈現(xiàn)典型的多糖吸收特征，其中3446.35cm^-1為o-h鍵的伸縮振動(dòng)峰，2919.77cm^-1為c-h鍵的伸縮振動(dòng)峰，1457.96cm^-1為c-h鍵的變角振動(dòng)峰，1112.65cm^-1為吡喃環(huán)中c-o鍵的伸縮振動(dòng)峰，而1636.65cm^-1為co2或共生水引起的伸縮振動(dòng)峰，875.68cm^-1為β構(gòu)型及甘露糖的特征峰，840.96cm^-1為α構(gòu)型的特征峰，需注意的是，在1720cm^-1附近沒有糖醛酸的特征吸收峰，說明該糖是中性糖。

3.多糖甲基化分析：

甲基化反應(yīng)：取10mg干燥的cop-w1加入到25ml的圓底燒瓶中，加2ml無水dmso溶液超聲30min溶解，加30mg干燥的naoh粉末超聲反應(yīng)3h，冰浴下沿壁緩慢滴加1mlch3i，避光超聲反應(yīng)2h，加3ml水結(jié)束反應(yīng)，按1:1加chcl3萃取，收集有機(jī)相，重復(fù)3次，干燥后重復(fù)甲基化至ir掃描圖譜中沒有羥基峰。整個(gè)反應(yīng)過程均在20℃，n2保護(hù)下進(jìn)行。

后續(xù)反應(yīng)：向甲基化后的樣品中加4ml2mol/l的tfa，于110℃下水解5h，水解后加4ml甲醇旋干除去多余的tfa，重復(fù)3次，再加0.5ml水溶解；取0.2ml水解液，加30mgnabh4，室溫下反應(yīng)3h，反應(yīng)過程中間歇振搖，結(jié)束后滴加25％冰乙酸至無氣泡產(chǎn)生，加2ml甲醇旋干，重復(fù)3次；向還原產(chǎn)物中加1.5ml乙酸酐，于100℃下反應(yīng)1h后，加2ml二甲苯旋干，重復(fù)3次以除去多余的乙酸酐；向乙酰化產(chǎn)物中各加2ml氯仿和水，振蕩，靜置，收集下層有機(jī)相，用1ml水洗滌3次，再加少量無水硫酸鈉除水，待gc-ms分析。

gc-ms色譜條件：色譜柱：hp-5ms毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)；載氣：he；加熱器溫度：250℃；程序升溫：初始溫度140℃，以10℃/min升至200℃，保持5min，再以8℃/min升至240℃；分流比：50:1；進(jìn)樣量：5μl。

表1cop-w1甲基化分析數(shù)據(jù)

甲基化的結(jié)果表明，cop-w1糖鏈的糖殘基共有8種連接方式，其中沒有關(guān)于glc和rha的糖殘基，是因?yàn)閮煞N糖的含量很小，在pmp-hplc結(jié)果中只占2％左右；而gal和man的比例(9:6)與pmp-hplc的結(jié)果(9:5)基本接近，證實(shí)了甲基化的可靠性；甲基化反應(yīng)后的非還原末端殘基(端基galp)與分枝糖殘基(1,2,6-linkedgalp和1,3,6-linkedmanp)的摩爾比為2.9:3.7，誤差可能是糖鏈中含有端基glc或端基rha引起的。

4.多糖nmr分析：

取30mg干燥的cop-w1，溶于0.5mld2o中，進(jìn)行一維和二維nmr分析。

在cop-w1的nmr譜圖中，沒有g(shù)lc殘基的特征信號(hào)，在高場區(qū)也未出現(xiàn)rha殘基的甲基碳c6(δ18左右)信號(hào)，是因?yàn)閮煞N糖的含量很小，與甲基化的結(jié)果相同；在¹³cnmr譜圖中δ160～180ppm處無碳信號(hào)，說明無糖醛酸，與ir分析結(jié)果相同。

在cop-w1的hsqc譜圖中，可確定各個(gè)糖殘基的異頭碳?xì)洌篴(100.4/4.98)、b(100.5/4.93)、c(106.6/5.07)、d(107.4/4.82)、e(107.9/4.89)、f(100.6/5.06)、g(106.0/4.97)、h(106.1/4.93)。

在cop-w1的hmbc譜圖中，顯示了不同糖殘基中碳和氫的相關(guān)峰，從而可推測出糖殘基的連接次序。其中交叉峰gh1-hc6(4.97/69.3)、hh1-fc4(4.93/73.9)、fh1-hc6(5.06/69.3)、hh1-dc3(4.93/81.6)、dh1-gc6(4.82/67.8)、gh1-gc6(4.97/67.8)，表明了糖殘基d、f、g、h之間的連接方式為：

注：x+y＝4

交叉峰e(cuò)h1-hc3(4.89/82.3)、ch1-ec6(5.07/70.4)、bh1-cc4(4.93/76.1)、bc1-ch4(100.5/3.63)，表明了糖殘基b、c、e、h之間的連接方式為：

交叉峰ah1-ec2(4.98/81.5)、ac1-eh2(100.4/3.63)、bh1-ac6(4.93/69.2)、bc1-ah6(100.5/3.62)，表明了糖殘基a、b、e之間的連接方式為：

綜上分析，預(yù)測出的均一多糖cop-w1的結(jié)構(gòu)單元如下：

注：x+y＝4

r＝端基glc或端基rha

表2cop-w1碳?xì)浠瘜W(xué)位移歸屬

實(shí)施例3：黨參均一多糖cop-w1的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

精密稱取dpph3.9mg，溶于100ml無水乙醇溶液中，避光振搖30min，使其充分溶解，配置成濃度為0.1mmol/l的dpph乙醇溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，于uv下光譜掃描，其最大吸收波長為516nm。將cop-w1溶于純水中，配成0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、和4.8mg/ml的初始濃度梯度，抗壞血酸(vc)作為陽性對照品，配成0.01875、0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8mg/ml的初始濃度梯度。

分別量取1ml樣品溶液和dpph溶液，混勻，避光條件下反應(yīng)30min，以50％的乙醇溶液為參比，于516nm處測定吸光度值as，每個(gè)濃度樣品重復(fù)測定3次；分別量取1ml純水和dpph溶液，混勻后測定dpph空白溶液的吸光度值ao；再分別量取1ml樣品溶液和無水乙醇，混勻后測定空白樣品的吸光度值ab；依照同樣方法，測定對照品vc的吸光度值。多糖對dpph自由基的清除率按照下述公式計(jì)算：

根據(jù)自由基清除率的公式計(jì)算得出，cop-w1對dpph自由基的清除能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，在濃度為2.40mg/ml時(shí)，cop-w1的清除率已達(dá)到82.9％，說明cop-w1具有良好的清除自由基的能力，且cop-w1對dpph自由基的半清除率ic50為0.610mg/ml。

表3cop-w1和vc對dpph自由基的清除率(％)

實(shí)施例4：黨參均一多糖cop-w1片劑的制備

取實(shí)施例1中獲得的黨參均一多糖cop-w12g、羥丙甲纖維素4g、羧甲淀粉鈉10g、微晶纖維素10g、乳糖115g、藥用淀粉50g、硬脂酸鎂1g，將主藥與輔料充分混勻后投入高速攪拌機(jī)中，噴霧加水適量，整粒，水分控制在3～4％，然后壓片，制成1000片，包薄膜衣。每片含主藥成分0.2mg。

實(shí)施例5：黨參均一多糖cop-w1膠囊劑的制備

取實(shí)施例1中獲得的黨參均一多糖cop-w12g、微晶纖維素25g、藥用淀粉70g，將藥用淀粉先干燥，過120目篩，再與cop-w1、微晶纖維素混合，過兩次120目篩，填入硬膠囊中，制成1000粒本發(fā)明膠囊。每粒硬膠囊含主藥成分0.2mg。