本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及黨參果膠多糖及其應(yīng)用和藥物。

背景技術(shù)：

黨參為桔?？浦参?，包括黨參(codonopsispilosula(franch.)nann.f)，素花黨參(codonopsispilosulanann.fvarmodesta(nann.f)l.t.shen)和川黨參(codonopsistangsheno.liv)的干燥根。黨參性味甘平，有補(bǔ)中益氣，健脾益肺，生津和胃的功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黨參具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善胃腸功能、調(diào)節(jié)血糖、清除自由基、抗炎、抗氧化等功能。植物化學(xué)研究表明，黨參主要含有生物堿、苯丙素類、三萜類、聚乙炔類、甾醇、揮發(fā)油、黃酮類及多糖類化合物等多種化合物；其中，黨參多糖是黨參的主要活性成分之一。

目前，對黨參多糖，尤其是對黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a的在抗腫瘤方面的藥用價值，我們的了解還很少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖cpp1c，具有較高的藥用價值。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于提供上述的黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四目的在于提供上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五目的在于提供上述的黨參果膠多糖在制備阻滯癌細(xì)胞周期的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六目的在于提供上述的黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第七目的在于提供上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞抗凋亡蛋白的表達(dá)的藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明的第八目的在于提供一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物的活性成分為上述的黨參果膠多糖。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖cpp1c，黨參果膠多糖cpp1c由鼠李糖rha、阿拉伯糖ara、半乳糖gal和半乳糖醛酸gala按照摩爾比2.99:1.154:1.94:33.29構(gòu)成；黨參果膠多糖cpp1c的糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala和1→6連接的半乳糖gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

上述的黨參果膠多糖還包括黨參果膠多糖cpp1a。黨參果膠多糖cpp1a的糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala、1→6連接的半乳糖gal和1→4連接的葡萄糖glu；黨參果膠多糖cpp1c的主要糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala和1→6連接的半乳糖gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備阻滯癌細(xì)胞周期的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞抗凋亡蛋白的表達(dá)的藥物中應(yīng)用。

一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物的活性成分為上述的黨參果膠多糖。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了黨參果膠多糖，尤其是首次發(fā)現(xiàn)了黨參果膠多糖cpp1c的藥用價值，特別是在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；黨參果膠多糖cpp1c安全有效且無毒副作用，藥理活性強(qiáng)；在制備抑制癌細(xì)胞生長，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，阻滯癌細(xì)胞周期，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞抗凋亡蛋白的表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，具有較好的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，利用黨參果膠多糖制備的抗腫瘤藥物具有較好的抗腫瘤性能。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2提供的高效凝膠色譜結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖右旋糖酐對照品相對分子量與保留時間關(guān)系圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2提供的cpp1c的高效凝膠色譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5提供的cpp1c對人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela的抑制結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5提供的cpp1a對人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela的抑制結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例6提供的瑞士染色后細(xì)胞形態(tài)結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例7提供的cpp1c和cpp1a抑制hepg2細(xì)胞遷移結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例8提供的cpp1c和cpp1a抑制hepg2細(xì)胞周期結(jié)果圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例9提供的cpp1c和cpp1a分別對bax、bcl-2及procaspase-3蛋白表達(dá)的影響的結(jié)果圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例9提供cpp1c和cpp1a對bax、bcl-2及procaspase-3蛋白表的達(dá)影響的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實(shí)施例提供的黨參果膠多糖及其的應(yīng)用和藥物進(jìn)行具體的說明。

癌癥(cancer)是目前人類面臨的第一大健康威脅，但是大多數(shù)的癌癥目前還沒有有效的治療藥物；因?yàn)椋┘?xì)胞有著其不同于常規(guī)細(xì)胞的特征。2011年，douglashanahan和roberta.weinberg在《cell》雜志上發(fā)表文章《hallmarksofcancer:thenextgeneration》，全面總結(jié)癌細(xì)胞的十大特征：自給自足生長信號(self-sufficiencyingrowthsignals)、抗生長信號的不敏感(insensitivitytoantigrowthsignals)、抵抗細(xì)胞死亡(resistingcelldeath)、潛力無限的復(fù)制能力(limitlessreplicativepotential)、持續(xù)的血管生成(sustainedangiogenesis)、組織浸潤和轉(zhuǎn)移(tissueinvasionandmetastasis)，避免免疫摧毀(avoidingimmunedestruction)、促進(jìn)腫瘤的炎癥(tumorpromotioninflammation)、細(xì)胞能量異常(deregulatingcellularenergetics)和基因組不穩(wěn)定與突變(genomeinstabilityandmutation)。限制、抑制或者阻斷上述特征，就有可能達(dá)到抑制或治療癌癥的目的。

一種黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖cpp1c，黨參果膠多糖cpp1c由鼠李糖rha、阿拉伯糖ara、半乳糖gal和半乳糖醛酸gala按照摩爾比2.99:1.154:1.94:33.29構(gòu)成；黨參果膠多糖cpp1c的糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala和1→6連接的半乳糖gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

進(jìn)一步地，還包括黨參果膠多糖cpp1a，黨參果膠多糖cpp1a由鼠李糖rha、阿拉伯糖ara、葡萄糖glu、半乳糖gal和半乳糖醛酸gala按照摩爾比1.34:12.30:3.49:10.44:1.18構(gòu)成；黨參果膠多糖cpp1a的糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala、1→6連接的半乳糖gal和1→4連接的葡萄糖glu；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，腫瘤細(xì)胞包括人肝癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞。

肝癌、胃癌和宮頸癌是常見的幾種癌癥，其中，肝癌最為常見且發(fā)展迅速，死亡率極高。黨參果膠多糖通過抑制癌細(xì)胞的生長，控制癌癥的發(fā)展，達(dá)到抑制腫瘤、抑制癌癥的目的。

上述的黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。

上述的黨參果膠多糖在制備阻滯癌細(xì)胞周期的藥物中的應(yīng)用。

細(xì)胞周期(cellcycle)是從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開始，經(jīng)過物質(zhì)的累積過程，直到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止的過程。一個細(xì)胞周期包括g1期、s期、g2期和m期四個時期；其中s期為dna合成期(dnasynthesisphase，s期)，s期既不是分裂間期的開始也不是分裂間期的末尾；因此上次分裂之后到s期之前，存在一個時間間隔，即為g1期；在s期之后，細(xì)胞分裂之前，也存在一個時間間隔，即為g2期；其余時間即為細(xì)胞分裂的m期。

黨參果膠多糖能將癌細(xì)胞阻滯在g2/m期；將癌細(xì)胞阻滯在g2/m期即能達(dá)到抑制癌癥、抑制腫瘤的目的。

上述的黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白包括bax和caspase-3。

在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑中，細(xì)胞色素c的釋放是關(guān)鍵步驟。線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道開放，可以使線粒體內(nèi)的凋亡因子如細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體外膜的通透性改變主要受bcl-2(b-celllymphomagene2)蛋白家族和bax調(diào)控；而bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶；全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，caspase-3是caspase大家族中一個重要的成員。所有動物細(xì)胞都具有類似的凋亡機(jī)制，蛋白酶caspase-3在其中發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞凋亡過程分為激活期(activationphase)和執(zhí)行期(executionphase)兩個階段。前期細(xì)胞應(yīng)答死亡信號，起始caspase-3活化，后期執(zhí)行caspase-3活化，執(zhí)行細(xì)胞死亡程序。

上述的黨參果膠多糖在制備抑制抗癌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)的藥物中應(yīng)用。

一種抗腫瘤藥物，其活性成分為上述的黨參果膠多糖。

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了黨參果膠多糖cpp1c的制備方法和分子組成的測定方法。

黨參果膠多糖cpp1c的制備方法，包括以下步驟：

1.1黨參多糖cpp1的制備提?。狐h參藥材粉碎后，經(jīng)95％乙醇脫脂處理后，于90℃以上溫度的熱水中進(jìn)行提取，提取液濃縮后，提取液用終濃度為10-40％乙醇沉淀，過濾，沉淀為粗黨參多糖cpp1，并除蛋白和色素。

1.2稱取除蛋白脫色素后的cpp1樣品100mg，溶于100ml經(jīng)0.45μm濾膜過濾的水，離心(3000rpm，3min)，取上清液。de-52纖維素柱在用0.45μm濾膜過濾的水進(jìn)行平衡后(大約12h)，將上述制得溶液上樣，流速為25ml/h。

1.3上樣結(jié)束后，用0.45μm濾膜過濾的水洗脫，洗脫速度設(shè)置為25ml/h，并用配套的試管接洗脫液。采用苯酚硫酸法對每管中的洗脫液的吸光度進(jìn)行測定，做管號(橫坐標(biāo))與吸光度值(縱坐標(biāo))的洗脫曲線，至幾乎沒有糖出現(xiàn)時，停止洗脫；將洗脫液合并，濃縮并透析后，冷凍干燥得水洗脫部分。

1.4水洗收集結(jié)束后，用0.1mol/l、0.2mol/l和0.4mol/l的nacl溶液以1.2的方法進(jìn)行洗脫及之后的操作，收集0.4mol/l的nacl溶液洗脫液，所得產(chǎn)物命名為黨參果膠多糖cpp1c。

黨參果膠多糖cpp1c單糖組成測定：

單糖的測定：

2.1準(zhǔn)確稱取cpp1c10mg，準(zhǔn)確移入新鮮配制的2mol/l三氟乙酸2ml，密封好，置于120℃完全酸水解3h。3h后，取出，減壓旋干。

2.2反復(fù)加入甲醇(1-2ml)，繼續(xù)旋干，以達(dá)到將三氟乙酸完全除去的目的。向上述殘?jiān)欣^續(xù)加入鹽酸羥胺10mg，吡啶0.5ml，同時加入肌醇六乙酰酯4mg(作為內(nèi)標(biāo))，充分混合后，置于90℃條件下繼續(xù)反應(yīng)半小時。

2.3放至室溫后，加入乙酸酐0.5ml，充分混合，同樣置于90℃條件下繼續(xù)反應(yīng)半小時，減壓旋干。將殘?jiān)苡谶m量氯仿溶液中，用0.45μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾后，采用gc法對樣品進(jìn)行分析。各單糖的混合對照品(包含有rha、ara、xyl、man、glu、gal)按照上述處理樣品的方法進(jìn)行上述相同操作。

2.4上述操作結(jié)束后，用氣相色譜gc就行測定；gc的條件為，色譜柱：ov-101(50m×0.25mmi.d.)，進(jìn)樣量1μl，程序升溫，以15℃/min從175℃升到190℃，保留5min，再以5℃/min升到250℃，保留1.5min。

糖醛酸測定：

3.1準(zhǔn)確稱取cpp1c10mg，準(zhǔn)確移入新鮮配制的2mol/l三氟乙酸2ml，密封好，置于120℃完全酸水解3h。3h后，取出，減壓旋干。

3.2反復(fù)加入甲醇(1-2ml)，繼續(xù)旋干，以達(dá)到將三氟乙酸完全除去的目的。移入78μl新鮮配制的na2co3溶液(0.5mol/l)，于30℃條件下繼續(xù)反應(yīng)45min，加入500μl新鮮配制的nabh4溶液(w/v，4％)，常溫下繼續(xù)反應(yīng)1.5h后。

3.3為除去未反應(yīng)的nabh4，向3.2溶液中慢慢加入新鮮配制的25％乙酸，一直到不再有氣泡產(chǎn)生為止。將上述反應(yīng)液過已處理的732型陽離子交換樹脂，并用6ml水進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，并于45℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后，反復(fù)加入適量甲醇，繼續(xù)旋干，以達(dá)到將硼酸鹽完全除去的目的。

3.4將3.3殘?jiān)芊夂?，置?5℃反應(yīng)2h后，用1ml吡啶將殘?jiān)芙?，并加正丙?ml后，混勻并密封，于55℃繼續(xù)反應(yīng)0.5h。放冷后，55℃水浴條件下，氮?dú)獯蹈?。向上述殘?jiān)邢嗬^滴入吡啶及乙酸酐各500μl，密封后，95℃繼續(xù)反應(yīng)1h。放冷，0.45μm有機(jī)濾膜過濾除雜后，采用gc法分析樣品。各單糖的混合對照品(包含有rha、ara、xyl、man、glu、gal、glua、gala)按照上述處理樣品的方法進(jìn)行相同操作。

上述操作結(jié)束后，通過氣相色譜gc進(jìn)行測定，氣相色譜色譜柱：ov-101(50m×0.25mmi.d.)；進(jìn)樣量：2μl；程序升溫：160℃保留4min，以5℃/min升到190℃保留4min，再以3℃/min升到210℃保留15min，以10℃/min升到260℃保留5min。

核磁測定：稱取20mg干燥的黨參果膠多糖cpp1c，反復(fù)用d2o(0.5ml)溶解并冷凍干燥三次后，進(jìn)行¹hnmr及¹³cnmr分析。

通過上述方法測得黨參果膠多糖cpp1c由鼠李糖rha、阿拉伯糖ara、半乳糖gal和半乳糖醛酸gala按照摩爾比2.99:1.154:1.94:33.29構(gòu)成；黨參果膠多糖cpp1c的糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala和1→6連接的半乳糖gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

實(shí)施例2

本實(shí)施例對黨參果膠多糖cpp1c的純度和相對分子質(zhì)量進(jìn)行了測定。

純度測定：稱取制備的黨參果膠多糖cpp1c樣品2mg溶于0.5ml超純水中，超純水中，0.45μm濾膜過后，采用hpgpc分析其純度。儀器為waters600；檢測器為2414型rid檢測器及2998型pda檢測器；色譜柱為ultrahydrogel1000及ultrahydrogel500色譜柱串聯(lián)；流動色譜柱串聯(lián)；流動相為超純水；流速0.8ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為30μl。

相對分子量的測定：

1.1以系列不同標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖右旋糖酐(668000、410000、273000、148000148000、48600、23800、1160011600、5200)為對照品，用0.9％nacl+0.2％nan3溶液溶解后(濃度均為2mg/ml)，采用hpgpc測其保留時間，并做保留時與標(biāo)準(zhǔn)品相對分子量之的回歸曲線。

1.2將樣品cpp1c用流動相溶解后(濃度均為2mg/ml)，按相同的方法測其保留時間，并根據(jù)回歸曲線，計(jì)算其相對分子量。流動相為0.9％nacl+0.2％nan3溶液；流速為1.0ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為30μl。

經(jīng)hpgpc測定，cpp1c為單一峰(如圖1所示)，其純度為99.02％，表明cpp1c為均一性多糖。

根據(jù)右旋糖酐系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖右旋糖酐對照品(668000、410000、273000、148000、48600、23800、1160011600、5200)的保留時間t，建立保留時間與相對分子質(zhì)量的對數(shù)lgmw間的回歸方程，為lgmw＝s-3.19e^-t+2.40e^(-3t²)(r＝0.9979)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示；將樣品黨參果膠多糖cpp1c的保留時間(如圖3所示)代入上述函數(shù)；計(jì)算得到黨參果膠多糖cpp1c的相對分子量為：1.259×10⁵da。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種黨參果膠多糖；包括實(shí)施例1提供的黨參果膠多糖cpp1c外，還包括黨參果膠多糖cpp1a。

黨參果膠多糖cpp1a的制備方法參考實(shí)施例1提供的制備方法，區(qū)別在于1.4水洗收集結(jié)束后，用0.1mol/l、0.2mol/l和0.4mol/l的nacl溶液以1.2的方法進(jìn)行洗脫及之后的操作，收集0.1mol/l的nacl溶液洗脫液，所得產(chǎn)物命名為黨參果膠多糖cpp1a。

黨參果膠多糖cpp1a單糖組成測定及分子組成參考實(shí)施例提供的方法，測得黨參果膠多糖cpp1a由鼠李糖rha、阿拉伯糖ara、葡萄糖glu、半乳糖gal和半乳糖醛酸gala按照摩爾比1.34:12.30:3.49:10.44:1.18構(gòu)成；黨參果膠多糖cpp1a的糖鏈為1→4連接的鼠李糖rha、1→5連接的阿拉伯糖ara、1→4連接的半乳糖醛酸gala、1→6連接的半乳糖gal和1→4連接的葡萄糖glu；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了對黨參果膠多糖cpp1c的純度和相對分子質(zhì)量進(jìn)行了測定。

參考實(shí)施例2提供的方法。

經(jīng)hpgpc測定，cpp1a為單一峰，其純度為96.55％，表明cpp1a為均一性多糖。

黨參果膠多糖cpp1a的相對分子量為：1.01×10⁵da。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。本實(shí)施例中，優(yōu)選用人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela作為對象，研究黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。當(dāng)然選用的癌細(xì)胞還可以是其他種類的癌細(xì)胞。

通過mtt法檢測黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a對不同癌細(xì)胞的抑制作用，本實(shí)施例選取三種典型的癌細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela進(jìn)行體外生長抑制率實(shí)驗(yàn)，篩選出對黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a敏感的癌細(xì)胞細(xì)胞株。

mtt法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

具體方法如下：

1.1接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela的懸液，以每孔5×10³個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100ul。

1.2培養(yǎng)細(xì)胞：同樣的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2-4天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間)。

1.3加藥物：細(xì)胞貼壁后，加入100μl用培養(yǎng)基配制的各梯度濃度的黨參果膠多糖cpp1c溶液和黨參果膠多糖cpp1a溶液，濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml。同時，設(shè)置調(diào)零孔和對照孔；調(diào)零孔加200μl培養(yǎng)基，對照孔加100μl細(xì)胞懸液和100μl培養(yǎng)基。每種實(shí)驗(yàn)孔均設(shè)置4個平行孔。

1.4呈色：培養(yǎng)36-48h后，每孔加mtt溶液(5mg/ml用pbs配制，ph＝7.4)20μl，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μldmso，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。

1.5比色：選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

抑制率(％)＝[1-(a實(shí)驗(yàn)孔-a空白孔)/(a對照孔-a空白孔)]×100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，黨參果膠多糖cpp1c在48h后，對人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela分別在劑量為50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml的抑制率分別為20％,10％和17％；23％,20％和18％；34％,20％和27％；48％,31％和48％：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5所示，黨參果膠多糖cpp1a在48h后，對人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela分別在劑量為50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml的抑制率分別為10％,9％和10％；16％,19％和17％；24％,22％和19％；33％,30％和31％。

黨參果膠多糖cpp1c和cpp1a對人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela的抑制率均呈現(xiàn)劑量依賴性。同時，黨參果膠多糖cpp1c對人肝癌細(xì)胞hepg2、人胃癌細(xì)胞mkn-45和人宮頸癌細(xì)胞hela的抑制率明顯高于黨參果膠多糖cpp1a。從結(jié)果可以看出，人肝癌細(xì)胞hepg2對黨參果膠多糖cpp1c更敏感；所以黨參果膠多糖cpp1c對人肝癌細(xì)胞hepg2的抑制效果最明顯。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供了黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。

本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用對黨參果膠多糖cpp1c更敏感的人肝癌細(xì)胞hepg2試驗(yàn)。

取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞hepg2，接種于六孔板，每孔1ml(約含1×10⁶個細(xì)胞)。細(xì)胞貼壁后，給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a(孔中給藥的終濃度均為400μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄掉培養(yǎng)基，清洗后用甲醇固定，瑞士染液染色，晾干后，顯微鏡下觀察并拍照。給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a的為給藥組，同時設(shè)空白組，空白組添加與給藥量等量的培養(yǎng)基。

結(jié)果如圖6所示，給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a(終濃度均為400μg/ml)48h后，空白組細(xì)胞具有正常的橢圓形態(tài)，但是給藥組均出現(xiàn)凋亡特征，如細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮等現(xiàn)象，說明黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，尤其是黨參果膠多糖cpp1c的效果明顯。

實(shí)施例7

本實(shí)施例提供黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。

本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用對黨參果膠多糖cpp1c更敏感的人肝癌細(xì)胞hepg2試驗(yàn)。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一個最重要的特征，而劃痕實(shí)驗(yàn)是較為傳統(tǒng)的觀測藥物對細(xì)胞遷移作用的手段。

取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞hepg2，接種于六孔板，設(shè)置空白組，每孔1ml(約含1×10⁶個細(xì)胞)。細(xì)胞貼壁后，用槍頭在培養(yǎng)孔壁劃一道豎直的線，并顯微鏡下觀察和拍照。給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a(終濃度均為400μg/ml)(給藥組)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察并拍照。將細(xì)胞遷移前后的距離進(jìn)行比較。

結(jié)果如圖7所示，給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a(終濃度均為400μg/ml)48h后；給藥組的hepg2細(xì)胞遷移的距離較空白組明顯地縮小，從而表明黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a明顯的抑制癌細(xì)胞遷移，且明顯的黨參果膠多糖cpp1c給藥組的遷移率低于黨參果膠多糖cpp1a給藥組。說明黨參果膠多糖cpp1c抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的能力強(qiáng)于黨參果膠多糖cpp1a。

實(shí)施例8

本實(shí)施例提供黨參果膠多糖在制備阻滯癌細(xì)胞周期的藥物中的應(yīng)用。

本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用對黨參果膠多糖cpp1c更敏感的人肝癌細(xì)胞hepg2試驗(yàn)。

取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞hepg2，接種于六孔板，設(shè)置空白對照組，每孔1ml(約含1×10⁶個細(xì)胞)。細(xì)胞貼壁后，給藥組為給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a(終濃度均為400μg/ml)；空白組加入等量的培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞。加入預(yù)冷的70％的乙醇，將細(xì)胞固定2h。離心后，向細(xì)胞沉淀中加入500μl的pbs溶液，對細(xì)胞進(jìn)行清洗2次，加入pi(50μg/ml)及rnasea(100μg/ml)的pbs溶液于4℃避光保存0.5h，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

結(jié)果如圖8所示，黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a作用48h后，hepg2細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡峰，且其比例依次為：2.480％，9.796％。同時，黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a作用后的細(xì)胞在g2/m的dna含量分別為7.135％，10.841％，而空白組為0％，即：與空白組相比，給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a約48h后的hepg2細(xì)胞處于s期的比例下降，g2/m期的比例升高。以上結(jié)果表明，黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a可將hepg2細(xì)胞阻滯于g2/m期而使細(xì)胞凋亡，且黨參果膠多糖cpp1c較黨參果膠多糖cpp1a表現(xiàn)出更強(qiáng)的阻滯癌細(xì)胞周期的效果。

實(shí)施例9

本實(shí)施例提供黨參果膠多糖在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

通常情況下，癌細(xì)胞會對抗細(xì)胞凋亡；會抑制細(xì)胞中bax和caspase-3的表達(dá)，bax和caspase-3是細(xì)胞中兩種重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白分子。黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a能促進(jìn)bax表達(dá)上調(diào)，且能促進(jìn)caspase-3的前體procaspase-3轉(zhuǎn)化為caspase-3，使caspase-3的表達(dá)量增加。

本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用對黨參果膠多糖cpp1c更敏感的人肝癌細(xì)胞hepg2試驗(yàn)。

本實(shí)施例通過westernblotting檢測bax的表達(dá)量和通過檢測procaspase-3的表達(dá)量來間接檢測caspase-3的表達(dá)量。

具體方法如下：

1.1細(xì)胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞hepg2，接種于六孔板，每孔1ml(約含1×10⁶個細(xì)胞)。細(xì)胞貼壁后，給藥黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a(終濃度均為400μg/ml)，同時設(shè)置對照組，對照組為未給藥組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞。

1.2細(xì)胞裂解：用pbs對細(xì)胞進(jìn)行清洗后，加入適量體積的裂解液ripa置于冰上裂解0.5h。

1.3蛋白定量：裂解后的樣品離心，取上清液。測上清液中所含蛋白量，將其調(diào)整為相同的蛋白濃。

westernblotting實(shí)驗(yàn)步驟：

2.1配制10％的sds-page凝膠；

2.2上樣15μl并電泳，上樣完成后，先60v電壓電泳，再以120電壓電泳；

2.3轉(zhuǎn)膜，pvdf轉(zhuǎn)移目的蛋白，0.35a穩(wěn)流電泳2小時；

2.45％脫脂奶粉(tbst配制)封閉pvdf膜1小時；

2.5加bax和procaspase-3的一抗抗體(1:5000稀釋)，4℃孵育12h，水平搖床低速搖動；然后用tbst洗膜，每次15分鐘，洗三次；

2.6將對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體(1:5000)，水平搖床低轉(zhuǎn)速搖晃孵育2小時；用tbst洗膜，每次15分鐘，洗三次；

2.7加入ecl發(fā)光液，并凝膠成像儀分析。

結(jié)果如圖9和圖10所示，左圖為蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖；右圖為目的蛋白表達(dá)量比值圖。經(jīng)過黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a作用48小時候后，隨著用藥劑量的增加，bax的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢。caspase-3是凋亡的重要蛋白酶，一旦活化，則會造成細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的凋亡。procaspase-3是其酶原形式，被激活后轉(zhuǎn)化為有活性的caspase-3，從而引發(fā)程序性細(xì)胞死。本實(shí)驗(yàn)測定procaspase-3的表達(dá)，結(jié)果表明，與空白對照組相比，黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a組中procaspase-3的表達(dá)量隨劑量的增加而減少，即黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a可促進(jìn)procaspase-3轉(zhuǎn)化為caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡，且黨參果膠多糖cpp1c促進(jìn)作用較黨參果膠多糖cpp1a更強(qiáng)。

實(shí)施例10

本實(shí)施例提供黨參果膠多糖在制備抑制癌細(xì)胞抗凋亡蛋白表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

細(xì)胞中，bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白，能抵抗細(xì)胞凋亡；黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a能抑制癌細(xì)胞抗凋亡蛋白表達(dá)。

本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用對黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a更敏感的人肝癌細(xì)胞hepg2試驗(yàn)。

本實(shí)施例通過westernblotting檢測bcl-2的表達(dá)量。

具體實(shí)驗(yàn)方法參考實(shí)施例9。

結(jié)果如圖9和圖10所示，左圖為蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖；右圖為目的蛋白表達(dá)量比值圖。經(jīng)過黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a作用48小時候后，隨著用藥劑量的增加，bcl-2的表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢，黨參果膠多糖cpp1c促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果較黨參果膠多糖cpp1a更好一些。

實(shí)施例11

本實(shí)施例提供一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤的藥物包括實(shí)施例1提供的黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖cpp1c。該抗腫瘤的藥物具有阻滯癌細(xì)胞周期、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白的表的作用。

實(shí)施例12

本實(shí)施例提供一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤的藥物包括實(shí)施例3提供的黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a。該抗腫瘤的藥物具有阻滯癌細(xì)胞周期、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡蛋白的表的作用。

綜上所述，黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a，尤其是黨參果膠多糖cpp1c能通過改變癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，抑制癌細(xì)胞遷移，阻滯癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，促進(jìn)bax和caspase-3的表達(dá)，抑制bal-2的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤和癌細(xì)胞的目的；而且黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a安全無毒副作用；當(dāng)然，當(dāng)黨參果膠多糖cpp1c和黨參果膠多糖cpp1a混合組成混合物作用相應(yīng)癌細(xì)胞的時候也具有相同的效果，具有協(xié)同作用的效果，增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。