專利名稱：黨參多糖的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材有效成分的提取方法，具體為黨參多糖的提取方法。
技術(shù)背景黨參(Radix Codonopsis)為桔梗科黨參屬植物，干燥根入藥，可補中益氣，健脾益肺。 用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消咳。黨參主要含有(1)糖類，有多糖、雜多糖，其中目前巳確定的有4種雜多糖CPI-IV， 主要由葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖以不同比例組成。此外含 有較多的菊糖和果糖。(2)苷類，丁香苷正己基-e-D-吡喃葡萄糖苷、乙基-a-D-呋喃果糖 苷，黨參苷I 。 (3)微量生物堿和含氮成分。(4)甾醇及三萜成分。(5)揮發(fā)油及其他成分。黨參提取物——黨參多糖具有多個方面較好的生物活性，毒理學實驗證明其為無毒物 質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗應激、抗氧化 等作用。目前，黨參多糖提取技術(shù)主要有水提離心分離法、水提醇沉法等，但現(xiàn)有提取方法由于 技術(shù)參數(shù)選擇不合理，導致提取物中黨參多糖含量低。如專利號為200410012172.7的中國專 利公開了一種采用水提離心分離法制備黨參多糖的方法，提取物中黨參多糖含量只在15%以 上；專利申請?zhí)枮?00510012557.8的中國專利也公開了一種黨參多糖的制備方法，得到的黃 色粉末狀的提取物中，黨參多糖含量在60%以上。同時，現(xiàn)有的提取方法得到的提取物都是 黨參多糖的粗品，由于提取未經(jīng)進一步純化，提取物雜質(zhì)多、外觀性狀不佳、多糖組分不明 確。此外，現(xiàn)有提取方法通常僅以多糖含量為指標對提取工藝進行監(jiān)測，不考察提取率，因 而不能很好地體現(xiàn)工藝的科學性和先進性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有黨參多糖提取方法技術(shù)參數(shù)選擇不合理，提取物黨參多糖含量較 低，提取工藝未考察提取率以及未經(jīng)純化，提取物雜質(zhì)多、外觀性狀不佳、多糖組分不明確 等問題，提供一種黨參多糖的提取方法。該提取方法可得到含量達到70%以上的高純度的黨 參多糖，提取率達20% 30%，同時對黨參多糖粗品進行進一步的純化處理。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的黨參多糖的提取方法，包括如下步驟(1)除塵 洗凈藥材黨參清水沖洗干凈；(2)切碎將黨參切成2 4 cm的段；(3)除雜將切好 的黨參段，80% 95%乙醇回流2~3次，每次1 2小時，揮干乙醇；(4)水提除雜后的藥渣 加入8 20倍藥渣重量的蒸餾水，沸水回流2 3次，每次1 2小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮 至藥液相對密度為0.8 1.2g/ml，放置冷卻；(5)乙醇沉淀將放置冷卻的濃縮液加入乙醇
至醇沉濃度為70%~90%，靜置，離心，得到醇沉物；(6)脫水將醇沉物用無水乙醇、丙 酮、乙醚依次洗滌；(7)干燥將洗滌后的醇沉物真空干燥，得黃白色粉末狀沉淀物即黨 參多糖提取物。本發(fā)明所用的回流提取溶液一乙醇及其濃度(80%~95%)保證了黨參中大部分非多糖類成分溶于提取溶液中，從而利于后續(xù)的減壓濃縮(雜質(zhì)過多會產(chǎn)生大量泡沫)，并保證了較 高含量的黨參多糖。黨參多糖提取液的濃縮程度是影響黨參多糖提取率的一個重要因素，多 糖在低濃度的醇溶液中有少量的溶解，提取液未經(jīng)濃縮而直接添加乙醇進行醇析，勢必使乙醇得以稀釋，乙醇濃度降低，使多糖有少量的溶解，多糖提取率減少；若濃縮過度，則使提 取液過于粘稠，多糖容易與蛋白、雜質(zhì)及溶劑形成凝膠物質(zhì)，從而影響了乙醇與多糖的接觸， 給乙醇沉淀分離帶來不便，降低黨參多糖提取率。本發(fā)明在大量實驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)化確定了 提取液的相對密度在0.8 1.2 g/ml之間，從而能夠在一定程度上提高黨參多糖提取率。本發(fā) 明確定的乙醇醇沉濃度為70%~90%，不僅能夠保證黨參多糖成分充分的沉淀出來，而且在 此醇沉濃度范圍內(nèi)多糖沉淀時包裹的雜質(zhì)較少，從而黨參多糖含量較高。對采用本發(fā)明提取方法獲得的黨參多糖CPS采用硫酸一苯酚法測定總糖含量，3， 5 — 二 硝基水楊酸法測定單糖含量，總糖含量減去單糖含量即為黨參多糖含量。以葡萄糖為對照品， 黨參多糖含量測定結(jié)果^2j_黨參多糖批號 多糖含量(％)060222 79.37 060626 79.76061003_80.54_結(jié)果表明黨參多糖提取物中多糖含量以葡萄糖計達70 %以上。對采用本發(fā)明提取方法獲得的黨參多糖采用高效凝膠滲透色譜法進行分子量測定高效 凝膠滲透色譜系統(tǒng)泵waters 515 HPLC pump;工作站Millennium32;檢測器waters 2410 RID;柱子TSKGMPWXL;檢測器溫度35°C;柱溫35°C;流速0.3ml/min;流動相 超純水；結(jié)果黨參多糖CPS分子量在2500 300萬Dal之間成多重峰分布。本發(fā)明可采用如下方法對上述得到的黨參多糖提取物進行進一步的純化將制備得到的 黨參多糖用水充分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱，流速lml/min，先經(jīng)蒸餾水洗脫， 苯酚i酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液；再用NaCl 溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15 mol/L、 0.2 mol/L、 0.25 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/L、 1.0mol/L的濃度梯度洗脫，苯酚4酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合 并多糖反應呈陽性的洗脫液。蒸餾水洗脫部分經(jīng)濃縮、真空干燥得到黨參多糖亞級分；不同 濃度的各NaCl溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃縮、透析、真空干燥得到黨參多糖各亞級分。運用高
效凝膠滲透色譜法對黨參多糖各亞級分的分子量進行測定，測定結(jié)果為黨參多糖各亞級分 在2500 300萬Dal之間分布。還可采用如下方法對上述得到的黨參多糖提取物進行進一步的純化提取得到的黨參 多糖，用水充分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱層析分離純化，流速lml/min，先經(jīng) 蒸餾水洗脫，苯酚i酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫 液；再用NaHCO3溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25 mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的濃度梯度洗脫及0.05 mol/LNaOH溶液洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液；蒸餾水洗脫部分 經(jīng)濃縮、真空干燥得黨參多糖亞級分；不同濃度NaHC03溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃縮、透析、 真空干燥得到黨參多糖各亞級分。運用高效凝膠滲透色譜法對黨參多糖各亞級分的分子量進 行測定，測定結(jié)果為黨參多糖各亞級分在2500 300萬Dal之間分布。將得到的黨參多糖各亞級分用水溶解后分別用排阻范圍為1000 200,000Dal的分子篩柱 層析分離，得到一系列分子量不同的但各系列分別為均一分子量的高純度的黨參多糖各亞級 分。運用高效凝膠滲透色譜法對黨參多糖各亞級分的分子量進行測定，測定結(jié)果為黨參多 糖各亞級分在2500 300萬Dal之間分布。本發(fā)明所述的黨參多糖的提取方法屬于水提醇沉法。在大量實驗的基礎(chǔ)上，本發(fā)明確定 了優(yōu)化的黨參多糖提取工藝技術(shù)參數(shù)(包括除雜所用的溶劑及濃度、提取液的相對密度、醇 沉濃度等)，提高了黨參多糖的含量(達到70%以上)，提取率達到20%~30%;該提取方 法步驟簡便，成本低廉、工藝穩(wěn)定且提取得到的黨參多糖雜質(zhì)少、外觀性狀佳。本發(fā)明所述 的提取方法增加了后續(xù)純化處理，進一步純化后不僅可以很好地將黨參多糖按酸性多糖和中 性多糖分離開來，而且可以將黨參多糖按分子量大小進行分段，從而得到不同的黨參多糖亞 級分，同時，通過對黨參多糖各亞級分的分子量測定，進一步明確了黨參多糖的構(gòu)成組分。 采用本發(fā)明所述提取方法得到的黨參多糖可在制備抗腫瘤藥、活血抗栓藥、降血壓藥、降血 脂藥、降血糖藥、抗衰老藥、增強骨髓造血機能藥或免疫調(diào)節(jié)藥物中得到應用。
具體實施方式
實施例l黨參多糖的提取方法，包括如下步驟(1)除塵洗凈藥材黨參100g清水沖洗干凈；(2)切碎將黨參切成2 4cm的段；(3)除雜將切好的黨參段，80%乙醇回流2次， 每次1小時，揮干乙醇；(4)水提除雜后的藥渣加入8倍藥渣重量的蒸餾水，沸水回流2 次，每次1小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮至藥液相對密度為0.8 g/ml，放置冷卻；(5)乙醇沉淀將放置冷卻的濃縮液加入乙醇至醇沉濃度為70%，靜置，離心，得醇沉物；(6) 脫水將醇沉物用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌；(7)干燥將洗滌后的醇沉物真空干
燥，得黃白色粉末狀沉淀物即黨參多糖提取物35.5g。以苯酚一硫酸法測定提取物總糖含量， 3， 5 —二硝基水楊酸法測定提取物單糖含量，總糖含量減去單糖含量即為黨參多糖含量。黨 參多糖含量以葡萄糖計為76%。提取率按下式計算為27%。黨參多糖提取率⑧=^^^^X100%原藥材重量將提取得到的黨參多糖用水充分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱，流速lml/min， 先經(jīng)蒸餾水洗脫，苯酚~^[酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的 洗脫液；再用NaCl溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的濃度梯度洗脫，苯酚i酸法跟蹤檢測，直到 無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液。蒸餾水洗脫部分經(jīng)濃縮、.真空干燥得黨 參多糖亞級分；不同濃度的各NaCl溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃縮、透析、真空干燥得到黨參多 糖各亞級分。所述的弱陰離子交換柱是DEAE-弱陰離子交換柱。并優(yōu)選DEAE-Sepharose F.F. 柱或DEAE纖維素柱或DEAE-Sephdex A。將得到的黨參多糖亞級分用水溶解后分別用排阻范圍為1000 200,000Dal的分子篩柱層 析分離，得到一系列分子量不同的但各系列分別為均一分子量的高純度的黨參多糖各亞級 分。運用高效凝膠滲透色譜法對黨參多糖各亞級分的分子量進行測定，測定結(jié)果為黨參多 糖各亞級分在2500 300萬Dal之間分布。均含有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯 糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等單糖殘基。其中分子篩柱是SephdexG或Sephacryl凝膠柱或 Sephrose 6B凝膠柱。實施例2黨參多糖的提取方法，包括如下步驟(1)除塵洗凈藥材黨參100g清水沖洗干凈； (2)切碎將黨參切成2 4cm的段；(3)除雜將切好的黨參段，95%乙醇回流3次， 每次2小時，揮干乙醇；(4)水提除雜后的藥渣加入20倍藥渣重量的蒸餾水，沸水回流 2次，每次2小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮至藥液相對密度為1.2g/ml，放置冷卻；(5) 乙醇沉淀將放置冷卻的濃縮液加入乙醇至醇沉濃度為90%，靜置，離心，得醇沉物；(6) 脫水將醇沉物用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌；(7)干燥將洗滌后的醇沉物真空干 燥，得黃白色粉末狀沉淀物即黨參多糖提取物33g。以苯酚一硫酸法測定提取物總糖含量， 3， 5 — 二硝基水楊酸法測定提取物單糖含量，總糖含量減去單糖含量即為黨參多糖含量。黨 參多糖含量以葡萄糖計為80%。提取率按下式計算為26%。黨參多糖提取率(。/。) -沉淀物重xfff糖含量",。原藥材重量將提取得到的黨參多糖用水充分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱層析分離純化，流速1 ml/min，弱陰離子交換柱先經(jīng)蒸餾水洗脫，苯酚~^酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫
液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液；再用NaHCO3溶液依次以0.01mol/L、 0.05 mol/L、 0.1mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的濃度梯度 洗脫及0.05mol/LNaOH溶液洗脫，苯酚~^酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多 糖反應呈陽性的洗脫液；蒸餾水洗脫部分經(jīng)濃縮、真空干燥得黨參多糖亞級分；不同濃度 NaHC03溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃縮、透析、真空干燥得到黨參多糖各亞級分。所述的弱陰離 子交換柱是DEAE-弱陰離子交換柱。并優(yōu)選DEAE-S印harose F.F.柱或DEAE纖維素柱或 DEAE—Sephdex A。將得到的黨參多糖亞級分用水溶解后分別用排阻范圍為1000 200,000Dal的分子篩柱層 析分離，得到一系列分子量不同的但各系列分別為均一分子量的高純度的黨參多糖各亞級 分。運用高效凝膠滲透色譜法對黨參多糖各亞級分的分子量進行測定，測定結(jié)果為黨參多 糖各亞級分在2500 300萬Dal之間分布。均含有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-半乳糖、 D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露糖等單糖殘基。其中分子篩層析柱是SephdexG或Sephacryl凝 膠柱或Sephrose 6B凝膠柱。實施例3黨參多糖的提取方法，包括如下步驟(1)除塵洗凈藥材黨參300g清水沖洗干凈；(2)切碎將黨參切成2 4cm的段；(3)除雜將切好的黨參段，90% (或85%乙醇) 乙醇回流3次，每次1.5小時，揮干乙醇；(4)水提除雜后的藥渣加入15倍(或10倍或 13倍或18倍)藥渣重量的蒸餾水，沸水回流提取3次，每次1.5小時，過濾，合并濾液， 減壓濃縮至藥液相對密度為1.0g/ml，放置冷卻；(5)乙醇沉淀將放置冷卻的濃縮液加入 乙醇至醇沉濃度為80% (或75%或85%)，靜置，離心，得醇沉物；(6)脫水將醇沉物 用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌；(7)干燥將洗滌后的醇沉物真空干燥，得黃白色粉 末狀沉淀物即黨參多糖提取物111 g。以苯酚一硫酸法測定提取物總糖含量，3， 5 — 二硝基 水楊酸法測定提取物單糖含量，總糖含量減去單糖含量即為黨參多糖含量。黨參多糖含量以 葡萄糖計為77.8%。提取率按下式計算為28.8%。黨參多糖提取率(％):沉淀物H，f糖含量X，/。原藥材重量將提取得到的黨參多糖用水充分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱，流速lml/min， 先經(jīng)蒸餾水洗脫，苯酚"^酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的 洗脫液；再用NaCl溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的濃度梯度洗脫，苯酚~^1酸法跟蹤檢測，直到 無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液。蒸餾水洗脫部分經(jīng)濃縮、真空干燥得黨 參多糖亞級分；不同濃度的各NaCl溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃縮、透析、真空干燥得到黨參多 糖各亞級分。所述的弱陰離子交換柱是DEAE-弱陰離子交換柱。并優(yōu)選DEAE-Sepharose F.F.
柱或DEAE纖維素柱或DEAE-Sephdex A。將得到的黨參多糖亞級分用水溶解后分別用排阻范圍為1000 200，000Dal的分子篩柱層 析分離，得到一系列分子量不同的但各系列分別為均一分子量的高純度的黨參多糖各亞級 分。運用高效凝膠滲透色譜法對黨參多糖各亞級分的分子量進行測定，測定結(jié)果為黨參多 糖各亞級分在2500 300萬Dal之間分布。均含有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯 糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等單糖殘基。其中分子篩柱是SephdexG或Sephaciyl凝膠柱或 Sephrose 6B凝膠柱。
權(quán)利要求
1、一種黨參多糖的提取方法，其特征為包括如下步驟(1)除塵洗凈藥材黨參清水沖洗干凈；(2)切碎將黨參切成2～4cm的段；(3)除雜將切好的黨參段，80％～95％乙醇回流2～3次，每次1～2小時，揮干乙醇；(4)水提除雜后的藥渣加入8～20倍藥渣重量的蒸餾水，沸水回流2～3次，每次1～2小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮至藥液相對密度為0.8～1.2g/ml，放置冷卻；(5)乙醇沉淀將放置冷卻的濃縮液加入乙醇至醇沉濃度為70％～90％，靜置，離心，得到醇沉物；(6)脫水將醇沉物用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌；(7)干燥將洗滌后的醇沉物真空干燥，得黃白色粉末狀沉淀物即黨參多糖提取物。
2、 如權(quán)利要求l所述的黨參多糖的提取方法，其特征為將制備得到的黨參多糖用水充 分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱，流速lml/min，弱陰離子交換柱先經(jīng)蒸餾水洗脫， 苯酚i酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液；再用NaCl 溶液依次以O(shè).Ol mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15 mol/L、 0.2 mol/L、 0.25 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/L、 1.0mol/L的濃度梯度洗脫，苯酚~^酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合 并多糖反應呈陽性的洗脫液；蒸餾水洗脫部分經(jīng)濃縮、真空干燥得黨參多糖亞級分；不同濃 度的各NaCl溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃縮、透析、真空干燥得黨參多糖各亞級分。
3、 如權(quán)利要求1所述的黨參多糖的提取方法，其特征為將提取得到的黨參多糖用水充 分溶解，離心，上清液上弱陰離子交換柱柱層析分離純化，流速lml/min，弱陰離子交換柱 先經(jīng)蒸餾水洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的 洗脫液；再用NaHC03溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15 mol/L、 0.2mol/L、 0.25mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的濃度梯度洗脫及0.05 mol/LNaOH溶液洗脫， 苯酚-硫酸法跟蹤檢測，直到無陽性洗脫液為止，合并多糖反應呈陽性的洗脫液；蒸餾水洗 脫部分經(jīng)濃縮、真空干燥得黨參多糖亞級分；不同濃度的各NaHC03溶液洗脫部分經(jīng)減壓濃 縮、透析、真空干燥得黨參多糖各亞級分。
4、 如權(quán)利要求2或3所述的黨參多糖的提取方法，其特征為將得到的黨參多糖各亞 級分用水溶解后分別用排阻范圍為1000~200，000Dal的分子篩柱層析分離，得到一系列分子 量不同的但各系列分別為均一分子量的高純度的黨參多糖各亞級分。
5、 權(quán)利要求2或3所述的黨參多糖的提取方法，其特征為弱陰離子交換柱是DEAE-弱陰離子交換柱。
6、 如權(quán)利要求5所述的黨參多糖的提取方法，其特征為DEAE-弱陰離子交換柱優(yōu)選 DEAE—sepharose F.F.柱或DEAE纖維素柱或DEAE—Sephdex A。
7、 如權(quán)利要求4所述的黨參多糖的提取方法，其特征為分子篩柱是Sephadex G或 Sephacryl凝膠柱或Sepharose 6B凝膠柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥材有效成分的提取方法，具體為黨參多糖的提取方法。解決現(xiàn)有黨參多糖提取方法技術(shù)參數(shù)選擇不合理，提取物黨參多糖含量較低，以及未經(jīng)純化，提取物雜質(zhì)多、外觀性狀不佳、多糖組分不明確等問題。包括如下步驟除塵洗凈，切碎，除雜將切好的黨參段，80％～95％乙醇回流，水提并減壓濃縮至藥液相對密度為0.8～1.2g/ml，放置冷卻，乙醇沉淀將放置冷卻的濃縮液加入乙醇至醇沉濃度為70％～90％，靜置，離心，得到醇沉物，脫水，干燥。提高了黨參多糖的含量，達到70％以上，提取率為20％～30％；該提取方法步驟簡便，成本低廉、工藝穩(wěn)定且提取得到的黨參多糖雜質(zhì)少、外觀性狀佳。增加了后續(xù)純化處理，進一步明確了黨參多糖的構(gòu)成組分。
文檔編號A61K125/00GK101129439SQ200710062520
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月1日
發(fā)明者張志勇, 李瑞燕, 漆小梅, 鄭慶紅, 高建平 申請人:山西醫(yī)科大學