本發(fā)明屬于中藥的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種代代花萼多糖及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多糖是除了蛋白質(zhì)和核酸以外的一類重要的生物高分子化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明多糖具有多種生理活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、延緩衰老、增強免疫功能等。免疫調(diào)節(jié)作用是多糖最重要的生物活性功能，一直是人們研究的熱點。免疫細菌多糖和人工合成的化合物，其不良反應(yīng)和副作用已引起人們廣泛注意。而大多數(shù)高等植物來源的多糖均為無不良反應(yīng)的物質(zhì)，不會對機體產(chǎn)生較大的副作用，因此，從植物中分離的多糖在生物醫(yī)學(xué)上引起極大關(guān)注。目前已對百余種植物多糖進行了活性相關(guān)的研究報道。研究表明植物多糖可通過與免疫細胞表面的多種受體結(jié)合、激活不同的信號通路來調(diào)控動物機體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，包括：刺激巨噬細胞、T/B淋巴細胞、自然殺傷細胞的分泌或增殖；調(diào)節(jié)細胞因子的釋放；促進抗體的分泌；激活補體系統(tǒng)等。

對這些活性物質(zhì)的作用機制也在不斷發(fā)展，其中多糖對非特異性誘導(dǎo)的免疫機制更受到人們的重視。植物多糖是最理想的免疫候選藥物。

代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)是蕓香科柑橘屬植物酸橙的一個變種，代代花是其花蕾的干品，具有良好的藥理作用，常用于治療氣郁不舒、脘腹脹痛、積食不化、惡心嘔吐等。目前國內(nèi)外對代代花的研究主要以其揮發(fā)油類化合物為主，主要采用水蒸氣蒸餾法提煉精油，并廣泛應(yīng)用于化妝品、香精、香料等行業(yè)中。而對代代花多糖的研究報道幾乎沒有。大多數(shù)天然活性多糖是無毒副作用的天然綠色產(chǎn)品。隨著研究的不斷深入，天然多糖越來越成為食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種代代花萼粗多糖和精制多糖的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的代代花萼粗多糖和精制多糖。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述代代花萼粗多糖和精制多糖的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

一種代代花萼粗多糖的制備方法，包含如下步驟：

(1)將代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)花萼粉碎后過篩，得到代代花萼粗粉；蒸餾水加熱回流提取代代花萼粗粉，然后將提取液離心，并將上清液減壓濃縮，得到濃縮的代代花萼粗多糖溶液；

(2)將多糖溶液和經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂混合，脫色處理，過濾出多糖溶液，并用水反復(fù)洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖溶液合并，減壓濃縮，得到濃縮糖液；

(3)在濃縮糖液中加入沉淀劑進行沉淀，然后離心，棄去上清液，收集沉淀物并干燥，得到代代花萼粗多糖(記為CAVAPs)。

步驟(1)中熱水回流提取的次數(shù)為2～4次；步驟(1)中所述加熱回流的溫度為75～100℃；所述熱水回流每次提取的時間為2～4h；步驟(1)中所述熱水回流提取的水料比為15:1～30:1(質(zhì)量比)。

步驟(1)和(2)中所述減壓濃縮的溫度為40～60℃。

步驟(1)中所述的離心的轉(zhuǎn)速為3000～5000r/min；所述離心的時間為8～12min；所述過濾的次數(shù)為2～4次。

步驟(2)所述脫色處理的條件為于40～60℃水浴2～4h；

步驟(2)中所述大孔吸附樹脂選用為D354FD樹脂；

步驟(2)中所述大孔吸附樹脂的預(yù)處理的方法為：將大孔吸附樹脂先用蒸餾水浸泡12～24h，然后先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～5％的鹽酸溶液浸泡0.5～3h，蒸餾水洗至中性，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～5％的氫氧化鈉溶液浸泡0.5～3h，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂。

步驟(3)中所述沉淀劑為無水乙醇或體積分?jǐn)?shù)為90％～100％的乙醇溶液；

步驟(3)中所述沉淀的溫度為0～4℃。

步驟(3)中所述沉淀劑的加入量為濃縮糖液體積的3～5倍；步驟(3)中所述沉淀的時間為8～24h。

步驟(3)中所述離心的轉(zhuǎn)速為3000～5000r/min；所述離心的時間為12～15min；步驟(3)中所述干燥的溫度為40～60℃，干燥至恒重。

一種代代花萼粗多糖(CAVAPs)，通過上述制備方法制備得到。

所述代代花萼精制多糖通過將上述代代花萼粗多糖(CAVAPs)進一步純化得到；所述代代花萼精制多糖為六種代代花萼精制多糖(記為CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)

所述的代代花萼精制多糖(CP-I)為均一組分，其分子量(Mn)為1.3×10⁴Da；具體為13169Da；

所述的代代花萼精制多糖(CP-II)為均一組分，其分子量(Mn)為7.5×10³Da；具體為7538Da；

所述的代代花萼精制多糖(CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)非均一組分。

所述的代代花萼精制多糖(記為CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)通過如下步驟制備得到：

(1)將經(jīng)過預(yù)處理的DEAE-52樹脂于40～60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除氣泡后轉(zhuǎn)入Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后流速5～10s/滴；

(2)將代代花萼粗多糖配制成多糖溶液，轉(zhuǎn)入層析柱中，依次用蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.15mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脫，流速5～10s/滴，分別收集各流份，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm下的吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并；然后旋蒸濃縮，真空冷凍干燥，經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到六個組分，其中，蒸餾水洗脫得到的精制多糖命名為CP-I，0.05mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-II，0.1mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-III，0.15mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-IV，0.2mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-V，0.3mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-VI。

步驟(1)中所述的DEAE-52樹脂預(yù)處理的方法為：將DEAE-52樹脂用水4～30℃浸泡12～24h；再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡0.5～2h；0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5～2h，過濾，水洗至中性，得到經(jīng)過預(yù)處理的DEAE-52樹脂；

步驟(2)中所述的旋蒸濃縮的溫度為40～60℃；

所述代代花萼粗多糖或精制多糖在制備抗癌、抗氧化、免疫增強藥物中的應(yīng)用。

所述代代花萼粗多糖或精制多糖可作為新型的抗癌、抗氧化、免疫增強藥物。

一種免疫增強藥物，含有上述代代花萼粗多糖或精制多糖；

本發(fā)明的原理：植物來源的多糖具有抗氧化、抗腫瘤和增強免疫功能等多種生物活性。多糖尤其能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的免疫功能體現(xiàn)出各種有益的藥理作用。本發(fā)明通過體外實驗發(fā)現(xiàn)和確證植物粗多糖或精制多糖具有抗氧化、抗腫瘤和免疫增強活性，且使用劑量低，在同樣劑量下的毒副作用也較低。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼粗多糖(CAVAPs)對DPPH自由基具有一定的清除和抑制作用；

(2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼粗多糖(CAVAPs)對人乳腺癌細胞MCF-7和肺癌細胞HCC827具有一定的增殖抑制作用；

(3)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼粗多糖(CAVAPs)和精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)能顯著增強RAW264.7巨噬細胞NO的釋放；

(4)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼粗多糖(CAVAPs)和精制多糖(CP-II)能顯著增強RAW264.7巨噬細胞IL-6及TNF-α的釋放；

(5)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼粗多糖(CAVAPs)和精制多糖(CP-II)能顯著增加RAW264.7巨噬細胞iNOS、IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA的表達；

(6)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼粗多糖(CAVAPs)和精制多糖(CP-II)能顯著增加RAW264.7巨噬細胞p-ERK,p-JNK,p-P38和p-P65的表達；

(7)代代花萼粗多糖和精制多糖的用藥劑量比較低，而且在有效用藥劑量范圍內(nèi)毒性較低。

附圖說明

圖1是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)的離子交換柱層析洗脫曲線圖；

圖2是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)的高效凝膠滲透色譜(GPC)圖；其中A為代代花萼精制多糖CP-I的GPC圖，B為代代花萼精制多糖CP-II的GPC圖，C為代代花萼精制多糖CP-III的GPC圖，D為代代花萼精制多糖CP-IV的GPC圖，E為代代花萼精制多糖CP-V的GPC圖，F(xiàn)為代代花萼精制多糖CP-VI的GPC圖；

圖3是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖CP-I和CP-II的葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析洗脫曲線圖；其中A為代代花萼精制多糖CP-I的凝膠柱層析洗脫曲線圖，B為代代花萼精制多糖CP-II的凝膠柱層析洗脫曲線圖；

圖4是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖CP-I和CP-II的紅外光譜圖；其中A為代代花萼精制多糖CP-I的紅外光譜圖，B為代代花萼精制多糖CP-II的紅外光譜圖；

圖5是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs對DPPH自由基抑制率的曲線圖；

圖6是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制率的曲線圖；

圖7是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs對肺癌細胞HCC827的增殖抑制率的曲線圖；

圖8是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)對RAW264.7巨噬細胞存活率的影響圖，其中A為代代花萼粗多糖CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞存活率的影響圖，B為代代花萼精制多糖CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI對RAW264.7巨噬細胞存活率的影響圖；

圖9是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖；其中A為代代花萼粗多糖CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖，B為代代花萼精制多糖CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖；

圖10是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖；其中A為代代花萼粗多糖CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖，B為代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖；

圖11是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs或?qū)嵤├?制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖；其中A為CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖，B為CP-II對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖；

圖12是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，其中A為CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，B為CP-II對RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖13是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，其中A為CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，B為CP-II對RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖14是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞TNF-αmRNA表達的影響圖，其中A為CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞TNF-αmRNA表達的影響圖，B為CP-II對RAW264.7巨噬細胞TNF-αmRNA mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖15是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖；其中A為CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖，B為CP-II對RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖16是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-ERK蛋白表達的影響圖；其中圖A-1為CAVAPs的p-ERK蛋白表達曝光圖，A-2為CAVAPs的p-ERK蛋白相對表達量圖；圖B-1為CP-II的p-ERK蛋白表達曝光圖，B-2為CP-II的p-ERK蛋白相對表達量圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖17是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-JNK蛋白表達的影響圖；其中圖A-1為CAVAPs的p-JNK蛋白表達曝光圖，圖A-2為CAVAPs的p-JNK蛋白相對表達量圖；圖B-1為CP-II的p-JNK蛋白表達曝光圖，圖B-2為CP-II的p-JNK蛋白相對表達量圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖18是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-P38蛋白表達的影響圖；其中圖A-1為CAVAPs的p-P38蛋白表達曝光圖，圖A-2為CAVAPs的p-P38蛋白相對表達量圖；圖B-1為CP-II的p-P38蛋白表達曝光圖，圖B-2為CP-II的p-P38蛋白相對表達量圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖19是實施例1制備的代代花萼粗多糖CAVAPs和實施例4制備的代代花萼精制多糖CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-P65蛋白表達的影響圖；其中圖A-1為CAVAPs的p-P65蛋白表達曝光圖，圖A-2為CAVAPs的p-P65蛋白相對表達量圖；圖B-1為CP-II的p-P65蛋白表達曝光圖，圖B-2為CP-II的p-P65蛋白相對表達量圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例中，人乳腺癌細胞MCF-7、肺癌細胞HCC827和小鼠巨噬細胞RAW 264.7購自中科院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；代代花萼購于廣州清平藥材市場，產(chǎn)地為浙江。

實施例1從代代花萼中制備得到代代花萼粗多糖(CAVAPs)：

(1)代代花萼粉碎后過20目篩，稱取100g，用蒸餾水加熱回流提取，其中，水料比為20:1(質(zhì)量比)，回流提取溫度為75℃，回流提取時間為4h，回流提取次數(shù)3次；然后合并提取液，4000r/min下離心10min，取上層澄清液，濾紙過濾3次，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下減壓濃縮至200mL，得到多糖溶液；

(2)將D354FD樹脂先用蒸餾水浸泡12h，然后依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的鹽酸溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的氫氧化鈉溶液各自浸泡0.5h，200目紗布過濾，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預(yù)處理的D354FD樹脂；

(3)將步驟(1)制備得到的多糖溶液和200mL經(jīng)過預(yù)處理的D354FD樹脂混合，置于50℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴3h進行脫色，間隔攪拌，然后用200目的濾布過濾出多糖溶液，并用水反復(fù)清洗5次洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下減壓濃縮至200mL，得到濃縮糖液；

(4)在步驟(3)制備得到的濃縮糖液中加入濃縮糖液4倍體積的無水乙醇，邊加邊磁力攪拌，于4℃條件下醇沉8h，然后4000rpm下離心分離15min，棄去上清液，取出沉淀物于45℃烘干，得到代代花萼粗多糖(CAVAPs)。

實施例2從代代花萼中制備得到代代花萼粗多糖(CAVAPs)：

(1)代代花萼粉碎后過20目篩，稱取100g，然后蒸餾水加熱回流提取，其中，水料比20:1(質(zhì)量比)，回流提取溫度為85℃，回流提取時間為3h，回流提取次數(shù)2次；然后合并提取液，3000r/min下離心8min，取上層澄清液，濾紙過濾2次，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮至200mL，得到多糖溶液；

(2)將D354FD樹脂先用蒸餾水浸泡24h，然后依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的鹽酸溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的氫氧化鈉溶液各自浸泡2h，200目紗布過濾，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預(yù)處理的D354FD樹脂；

(3)將步驟(1)制備得到的多糖溶液和200mL經(jīng)過預(yù)處理的D354FD樹脂混合，置于40℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴2h進行脫色，間隔攪拌，然后用200目的濾布過濾出多糖溶液，并用水反復(fù)清洗4次洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮至200mL，得到濃縮糖液；

(4)在步驟(3)中制備得到的濃縮糖液中加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，邊加邊磁力攪拌，于0℃條件下醇沉12h，然后3000rpm下離心分離12min，棄去上清液，取出沉淀物于50℃烘干，得到代代花萼粗多糖(CAVAPs)。

實施例3從代代花萼中制備得到代代花萼粗多糖(CAVAPs)：

(1)代代花萼粉碎后過20目篩，稱取100g，用蒸餾水加熱回流提取，其中，水料比為20:1(質(zhì)量比)，回流提取溫度為95℃，回流提取時間為2h，回流提取次數(shù)4次，然后合并提取液，5000/min下離心12min，取上層澄清液，濾紙過濾4次，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮至200mL，得到多糖溶液；

(2)將D354FD樹脂先用蒸餾水浸泡18h，然后依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的鹽酸溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的氫氧化鈉溶液各自浸泡3h，200目紗布過濾，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預(yù)處理的D354FD樹脂；

(3)將步驟(1)中制備得到的多糖溶液和200mL經(jīng)過預(yù)處理的D354FD樹脂混合，置于60℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴4h進行脫色，間隔攪拌，之后用200目的濾布過濾出多糖溶液，并用水反復(fù)清洗5次洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮至200mL，得到濃縮糖液；

(4)在步驟(3)制備得到的濃縮糖液中加入5倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，邊加邊磁力攪拌，于4℃條件下醇沉24h，然后5000rpm下離心分離14min，棄去上清液，取出沉淀物于60℃烘干，得到代代花萼粗多糖(CAVAPs)。

實施例4代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)的制備：

(1)DEAE-52預(yù)處理：取70g的DEAE-52，用蒸餾水4℃浸泡24h，然后小心將上層水倒出，除去雜質(zhì)，再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡0.5h，將上層酸液小心倒出，抽濾至干后用蒸餾水洗脫至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5h，小心倒出上層堿液，抽濾至干后用蒸餾水洗至中性，備用；

(2)將經(jīng)過預(yù)處理的DEAE-52于48℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除氣泡后玻璃棒引流轉(zhuǎn)入2.6×30cm規(guī)格的Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后7s/滴；

(3)稱取100mg實施例1中制備得到的代代花萼粗多糖(CAVAPs)，配制成多糖溶液，玻璃棒引流至層析柱中，依次用蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.15mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脫，自動收集各流份，每根管收集大約5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm處的吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并；然后洗脫液40℃旋蒸濃縮，真空冷凍干燥；CAVAPs經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到六個組分，其中，蒸餾水洗脫得到的精制多糖命名為CP-I，0.05mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-II，0.1mol/L NaCl洗脫得到的代代花萼精制多糖命名為CP-III，0.15mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-IV，0.2mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-V，0.3mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-VI，其中，圖1為本實施例的離子交換柱層析洗脫曲線圖。

實施例5代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)的制備：

(1)DEAE-52預(yù)處理：取70g的DEAE-52，用蒸餾水20℃浸泡12h，然后小心將上層水倒出，除去雜質(zhì)，再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡1h，將上層酸液小心倒出，抽濾至干后用蒸餾水洗脫至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡1h，小心倒出上層堿液，抽濾至干后用蒸餾水洗至中性，備用；

(2)將經(jīng)過預(yù)處理的DEAE-52于48℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除氣泡后玻璃棒引流轉(zhuǎn)入2.6×30cm規(guī)格的Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后7s/滴；

(3)稱取100mg實施例1中制備得到的代代花萼粗多糖(CAVAPs)，配制成多糖溶液，玻璃棒引流至層析柱中，依次用蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.15mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脫，自動收集各流份，每根管收集大約5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm處的吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并；然后洗脫液50℃旋蒸濃縮，真空冷凍干燥；CAVAPs經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到六個組分，其中，蒸餾水洗脫得到的精制多糖命名為CP-I，0.05mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-II，0.1mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-III，0.15mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-IV，0.2mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-V，0.3mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-VI，其中，本實施例的離子交換柱層析洗脫結(jié)果同實施例4。

實施例6代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)的制備：

(1)DEAE-52預(yù)處理：取70g的DEAE-52，用蒸餾水25℃浸泡20h，然后小心將上層水倒出，除去雜質(zhì)，再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡0.8h，將上層酸液小心倒出，抽濾至干后用蒸餾水洗脫至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.8h，小心倒出上層堿液，抽濾至干后用蒸餾水洗至中性，備用；

(2)將經(jīng)過預(yù)處理的DEAE-52于48℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除氣泡后玻璃棒引流轉(zhuǎn)入2.6×30cm規(guī)格的Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后7s/滴；

(3)稱取100mg實施例1中制備得到的代代花萼粗多糖(CAVAPs)，配制成多糖溶液，玻璃棒引流至層析柱中，依次用蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.15mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl溶液洗脫，自動收集各流份，每根管收集大約5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm處的吸光度，繪制洗脫曲線同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并；然后洗脫液60℃旋蒸濃縮，真空冷凍干燥；CAVAPs經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到六個組分，其中，蒸餾水洗脫得到的精制多糖命名為CP-I，0.05mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-II，0.1mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-III，0.15mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-IV，0.2mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-V，0.3mol/L NaCl洗脫得到的精制多糖命名為CP-VI。其中，本實施例的離子交換柱層析洗脫結(jié)果同實施例4。

實施例7代代花萼精制多糖CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI的GPC分析

采用高效液相色譜儀分別對實施例4～6制備得到的CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI的分子量及其純度進行測定。色譜條件：TSK G-5000PXL column(7.8×300mm)和TSK G-3000PXL column(7.8×300mm)串聯(lián)，流動相為0.02mol/L的KH₂PO₄緩沖溶液，流速為0.6mL/min，2414示差檢測器，柱溫35℃。圖2是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖(CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI)的高效凝膠滲透色譜(GPC)圖。

結(jié)果分析：

(1)實施例4制備得到的CP-I(圖2A)和CP-II(圖2B)的GPC圖均為單一對稱峰，表明CP-I和CP-II都為均一多糖，其分子量(Mn)分別為13169Da和7538Da。實施例4制備得到的CP-III(圖2C)、CP-IV(圖2D)、CP-V(圖2E)和CP-VI(圖2F)的GPC圖均不是單一對稱峰，表明CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI非均一組分。實施例5和6結(jié)果同實施例4。

實施例8代代花萼精制多糖CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CP-V和CP-VI的Sephadex G-100柱層析分析

Sephadex G-100前處理：取一定量的Sephadex G-100于500m L的燒杯中，加入蒸餾水15～20m L/g,于90℃恒溫水浴鍋中持續(xù)加熱5h，間歇小心攪拌，待其冷卻至室溫后待用。

取經(jīng)上述方法處理的Sephadex G-100一定體積，玻璃棒攪拌均勻后玻璃棒引流至2.6×30cm的Z型層析柱中，用恒流泵泵入蒸餾水使層析柱中的裝柱均勻，調(diào)節(jié)流速至平衡后流速為15s/滴。稱取CP-I和CP-II各10mg，配置成2mg/m L的多糖溶液，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析，12min/管，用蒸餾水洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，繪制洗脫曲線并按照峰收集。圖3是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖CP-I和CP-II的葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析洗脫曲線圖；其中A為代代花萼精制多糖CP-I的凝膠柱層析洗脫曲線圖，B為代代花萼精制多糖CP-II的凝膠柱層析洗脫曲線圖。

結(jié)果分析：

實施例4制備得到的CP-I(圖3A)和CP-II(圖3B)葡聚糖凝膠Sephadex G-100凝膠柱層析，苯酚-硫酸法跟蹤檢測得到的洗脫曲線均為單一對稱峰，與高效凝膠滲透色譜一致，進一步證實CP-I和CP-II為均一多糖。實施例5和6結(jié)果同實施例4。

實施例9紅外光譜掃描

分別取實施例4～6中制備得到的代代花萼精制多糖(CP-I和CP-II)2mg，與KBr混合研細成均勻薄層狀，在4000～400cm^-1波數(shù)范圍內(nèi)進行紅外掃描。圖4是實施例4制備得到的代代花萼精制多糖CP-I和CP-II的紅外光譜圖；其中A為代代花萼精制多糖CP-I的紅外光譜圖，B為代代花萼精制多糖CP-II的紅外光譜圖。

結(jié)果分析：

多糖紅外光譜分析結(jié)果：

CP-I(圖4A)和CP-II(圖4B)依次在波數(shù)3432cm-1和3448cm-1處的強吸收峰是糖類分子間或分子內(nèi)的O-H伸縮振動峰，形寬而鈍，可知羥基在分子間發(fā)生締合，不是游離的羥基。CP-I和CP-II在波數(shù)2896cm-1和2912cm-1處處的吸收峰是次甲基或甲基的C-H振動吸收峰，在1450～1250cm-1吸收峰可能是糖類分子C-H變角振動引起的。由以上三組糖類的特征峰可初步判斷CP-I和CP-II為多糖。CP-I和CP-II均在1643cm-1處有較強的吸收峰，表明CP-I和CP-II中均含有-COO基團。同時兩種多糖在1300-1000cm-1處的吸收峰表示CP-I和CP-II中的糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型(呋喃型糖環(huán)在此區(qū)間上只有兩個強吸收峰)，因CP-I和CP-II是吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)。CP-I和CP-II分別在893cm-1和851cm-1處的吸收峰，表明二者主要以β-D葡萄吡喃糖為主。實施例5和實施例6的檢測結(jié)果同實施例4。

實施例8代代花萼粗多糖(CAVAPs)對DPPH自由基的抑制作用

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:準(zhǔn)確稱取19.7mg DPPH先用少量無水乙醇溶解，再以無水乙醇定容至250ml，配成200μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置棕色瓶中于冰箱內(nèi)保存。分別取1.5ml濃度為0，10，20，50，100，150，200μmol/L DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，和0.5ml無水乙醇混勻后，靜置30min，然后在最大吸收波長517nm處測定吸光值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇合適的DPPH·濃度作為測定樣品中的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液實驗濃度。

配置不同濃度的樣品(實施例1制備得到的代代花萼粗多糖(CAVAPs))和標(biāo)準(zhǔn)品(抗壞血酸VC)溶液，分別取0.5ml樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入1.5ml選擇好的合適濃度的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，以無水乙醇代替樣品作為空白對照，以無水乙醇代替DPPH溶液作為本底對照，將混合溶液搖勻后靜置30min，用比色皿在517nm波長處測定吸光值。樣品對DPPH自由基的清除率按如下公式計算：

DPPH清除率(％)＝[1－(A樣品－A本底對照)/A空白對照]×100％。

測試結(jié)果如圖5所示，圖5是實施例1制備的代代花萼粗多糖(CAVAPs)對DPPH自由基抑制率的曲線圖。結(jié)果顯示由實施例1制備得到的代代花萼粗多糖(CAVAPs)對DPPH自由基具有微弱的清除和抑制作用，但并不顯著(圖5)。

實施例9代代花萼粗多糖(CAVAPs)對人乳腺癌細胞MCF-7和肺癌細胞HCC827的增殖抑制作用

將人乳腺癌細胞MCF-7和肺癌細胞HCC827細胞以1×10⁵個/ml濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板(100μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔板中的細胞完全貼壁后，加入不同濃度(62.5，,125，250，500和1000μg/m L)的樣品溶液100μl。同時設(shè)細胞對照組，即加入與樣品液等量體積的完全培養(yǎng)液；陽性對照組，加與樣品同濃度同體積的五-氟尿嘧啶作為陽性對照。每個濃度設(shè)6個平行。在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后取出，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。用注射器小心吸棄96孔板中培養(yǎng)液，用不含鈣、鎂離子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL(需關(guān)燈操作，MTT見光易分解)和DMEM完全培養(yǎng)液180μL，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸棄孔內(nèi)的細胞培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為490nm下測定其吸光度值。

癌細胞的增值抑制率＝(空白對照組吸光度值-樣品組吸光度值)/空白對照組的吸光值。

測試結(jié)果如圖6和7所示；圖6是實施例1制備的代代花萼粗多糖(CAVAPs)對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制率的曲線圖；圖7是實施例1制備的代代花萼粗多糖(CAVAPs)對肺癌細胞HCC827的增殖抑制率的曲線圖。

由實施例1制備得到的代代花萼粗多糖(CAVAPs)對MCF-7(圖6)和HCC827(圖7)細胞具有一定程度的抑制作用，且對于MCF-7的增殖抑制作用更強。

實施例10代代花萼精多糖CAVAPs和CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI對RAW264.7細胞存活率的影響

將小鼠單核巨噬細胞RAW264.7以1×10⁶個/ml濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板(100μL/孔)，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔板中的細胞完全貼壁后，加入100μL不同濃度的CAVAPs(62.5，125，250，400和500μg/m L)和CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI(25，50，100，150，200和250μg/m L)，每個濃度設(shè)6個平行，同時設(shè)細胞空白對照組。在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后取出，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。用注射器小心吸棄孔內(nèi)上層培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍，再用MTT法進行細胞存活率檢測，即每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL和DMEM完全培養(yǎng)液180μL，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后小心吸棄孔內(nèi)的上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為490nm下測定其吸光度值，根據(jù)下面公式計算細胞的存活率:

相對增殖度(PGR)＝實驗組平均吸光度值/空白對照組吸光度值×100％。

測試結(jié)果如圖8所示；圖8是實施例1制備的CAVAPs和實施例4制備的CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI對RAW264.7巨噬細胞存活率的影響圖。

由實施例1制備得到的CAVAPs在62.5～500μg/mL對RAW264.7巨噬細胞沒有明顯的毒性作用(圖8A)，可用于下一步實驗研究；由實施例4制備的CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V和CP-VI在25～250μg/mL對RAW264.7巨噬細胞沒有明顯的毒性作用(圖8B)，可用于下一步實驗研究。

實施例11Griess法檢測CAVAPs和CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI對RAW264.7細胞釋放NO的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，吹打細胞成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)后，1000r/min，離心5min去上清，培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞濃度，按20萬個/孔的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，多糖樣品組(實施例1制備得到的CAVAPs(終濃度為16.13、31.25、62.5、125、250和500μg/mL)組，多糖樣品組(實施例4制備得到的CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI(終濃度為16.13、31.25、62.5、125、200和250μg/mL)組，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別取各孔細胞上清100μL，相應(yīng)加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess試劑A和50μL Griess試劑B，然后置于37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)10min，立即置板于多標(biāo)記微孔板檢測儀上，在550nm波長下檢測各孔吸光度值。

測試結(jié)果如圖9所示；圖9A是實施例1制備的CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖，圖9B是實施例4制備的CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖。CAVAPs和CP-I、CP-II、CP-III、CP-IV、CIP-V、CP-VI都能夠顯著促進RAW264.7巨噬細胞NO的釋放，尤其CP-II效果最好。綜合考慮，后續(xù)試驗選定CAVAPs和CP-II進一步研究。

實施例12Elisa法檢測CAVAPs和CP-II對RAW264.7細胞釋放IL-6及TNF-α的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，吹打細胞成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)后，1000r/min，離心5min去上清，培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞濃度，按20萬個/孔的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，CAVAPs組(實施例1制備得到的CAVAPs，終濃度為31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，CP-II組(實施例4制備得到的CP-II，終濃度為31.25、62.5、125、200、250μg/mL)，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別取各孔細胞上清按照小鼠IL-6ELISA試劑盒和小鼠TNF-αELISA試劑盒操作方法檢測細胞因子的釋放情況。

測試結(jié)果如圖10～11所示；圖10A是實施例1制備的CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖；圖10B是實施例4制備的CP-II對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖；圖11A是實施例1制備的CAVAPs對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖；圖11B是實施例4制備的CP-II對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖；

CAVAPs和CP-II都能夠顯著促進RAW264.7巨噬細胞IL-6及TNF-α的釋放(圖10～11)。

實施例13CAVAPs和CP-II對RAW264.7細胞iNOS、IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA表達的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對生長數(shù)期的細胞，按100萬/孔細胞數(shù)接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，CAVAPs組(實施例1制備得到的CAV APs，終濃度為31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，CP-II組(實施例4制備得到的CP-II，終濃度為31.25、62.5、125、200、250μg/mL)，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。作用24h后，吸棄細胞上清，PBS洗2次。每孔加入Trizol 1mL，靜置5min，吸管吹打至液體無粘稠物，吸取細胞裂解液轉(zhuǎn)入EP管，每管加入0.2mL氯仿，蓋上EP管蓋，手持用力上下震蕩10s，室溫靜置5min，4℃以12,000r/min離心15min，離心后轉(zhuǎn)移上層水相至另一EP管中，加入0.5mL異丙醇，室溫靜置10min，4℃離心機以12,000r/min離心10min，小心吸棄去上清，用冷75％乙醇1mL清洗2次，分別4℃條件下以7,500r/min離心5min，小心吸棄上清，空氣吹干，約15min，加入0～50μL RNase-free純水，60℃加熱10min溶解沉淀。測定mRNA的純度和濃度。并用RevertAid First Strand cnthesis Kit(Thermo公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，20μL反應(yīng)體系，對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。采用D yNAmo Flash SYRB Green qPCR Kit(Thermo公司)試劑盒，ABI實時熒光定量PCR儀(Rrism 7500，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA,USA)對mRN A進行擴增，擴增后用ABI PRISM 7500SDS軟件中Relative Quantification(d dCt)Study法進行自動分析以獲得目的基因的相對表達量。相關(guān)基因mRNA引物序列為GAPDH(forward,5′-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′,reverse,5′-TGGGATAGGGCCTCTCTTGC-3′).IL-1β(forward,5′-TGAAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGACC-3′,reverse,5′–TGTCCATTGAGGTGGAGAGCTTTCAGC-3′),IL-6(forward,5′-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3′,reverse,5′–GTGTCCCAACATTCATATTGTCAGT-3′),iNOS(forward,5′-CGGCAA ACATGACTTCAGGC-3′,reverse,5′-GCACATCAAAGCGGCCATAG-3′)和TNF-α(forward,5′-GGGGATTATGGCTCAGGGTC-3′,reverse,5′-CGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3′)。

測試結(jié)果如圖12～15所示。圖12是實施例1制備的CAVAPs(圖12A)和實施例4制備的CP-II(圖12B)對RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，圖13是實施例1制備的CAVAPs(圖13A)和實施例4制備的CP-II(圖13B)對RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，圖14是實施例1制備的CAVAPs(圖14A)和實施例4制備的CP-II(圖14B)對RAW264.7巨噬細胞TNF-αmRNA表達的影響圖，圖15是實施例1制備的CAVAPs(圖15A)和實施例4制備的CP-II(圖15B)對RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01。

與control組相比，CAVAPs和CP-II可以顯著促進iNOS(圖12)、IL-6(圖13)、TNF-α(圖14)和IL-1β(圖15)的分泌(P＜0.05)，并呈現(xiàn)梯度依賴性。

實施例14CAVAPs和CP-II對RAW264.7細胞p-ERK、p-JNK、P-p38和p-P65蛋白表達的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對生長數(shù)期的RAW264.7細胞，按100萬/孔細胞數(shù)接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，CAVAPs組(實施例1制備得到的CAVAPs，終濃度為125、250、500μg/mL)，CP-II組(實施例4制備得到的CP-II，終濃度為125、200、250μg/mL)，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。24h后，吸棄細胞上清，并且用預(yù)冷的PBS清洗兩次，收集細胞至1.5mL離心管中，加入60μL的PIPA裂解液(含磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)和蛋白酶抑制劑(cOmplete ULTRA Tablets，Mini，EDTA-free，EASYpack，Roche))，用1mL的注射器吸取裂解液反復(fù)吹打細胞至充分混勻，于冰上裂解40min，并每隔10min于渦旋振蕩器上振蕩15-20s。于4℃，12000rpm離心20min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管，然后采用BCA法檢測蛋白濃度(按照BCA Protein Assay Kit說明書進行)：先將濃度為2mg/mL的BSA溶液予超純?nèi)ルx子水稀釋為系列質(zhì)量濃度(0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再根據(jù)需要配置一定量的工作液(BCA Solution:4％(體積分?jǐn)?shù))Cupric Sulfate＝200:4)。取一塊無底物的96孔板，每孔分別加入已稀釋好的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液25μL，以及需要檢測的蛋白溶液25μL(已稀釋10倍)，每組均設(shè)置復(fù)孔。同時加入200μL/孔工作液，輕輕震蕩混勻，置于37℃孵育30min后，取出，于酶標(biāo)儀570nm處檢測OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液所測OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測蛋白溶液濃度。根據(jù)BCA法測得的蛋白濃度，計算出40μg總蛋白所需蛋白體積，同時加5μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，再補充相應(yīng)體積的超純?nèi)ルx子水至總體積為25μL，混勻，充分離心，使液體聚集在底部，100℃金屬浴加熱變性10min，離心，置于冰上備用。選擇10％(體積分?jǐn)?shù))分離膠和5％(體積分?jǐn)?shù))濃縮膠，將已變性好的蛋白樣品依次加入各泳道，樣品兩側(cè)的泳道分別加入5μL Marker。電泳槽中加入足夠量的TGS緩沖液，電泳條件為：100V，約150min，直至溴酚藍指示劑跑至距膠下緣約0.5cm時，停止電泳。然后在冰浴中以100V的電壓轉(zhuǎn)膜100min。用含5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST封閉，緩慢搖蕩1h。一抗抗體分別為：GAPDH(14c10)Rabbit mAb、pERK p-JNK、p-P38和NF-Κb p-P65(均購自CST公司)，二抗抗體為山羊抗兔(HRP標(biāo)記)，購自聚研生物科技有限公司。按照說明書推薦的稀釋比例(1:1000)，配制一抗，室溫下輕搖孵育4h或4℃靜置過夜。一抗孵育結(jié)束后，更換二抗，HRP標(biāo)記的二抗按相應(yīng)比例稀釋(1:2000)，室溫輕搖1h。二抗結(jié)束后，加入發(fā)光液(購自BioFuture公司)并利用凝膠成像儀蛋白條帶顯影。

圖16是實施例1制備的CAVAPs和實施例4制備的CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-ERK蛋白表達的影響圖，圖16A-1為實施例1制備的CAVAPs的p-ERK蛋白表達曝光圖，16A-2為實施例1制備的CAVAPs的p-ERK蛋白相對表達量，圖16B-1為實施例4制備的CP-II的p-ERK蛋白表達曝光圖，16B-2為實施例4制備的CP-II的p-ERK蛋白相對表達量；圖17是實施例1制備的CAVAPs和實施例4制備的CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-JNK蛋白表達的影響圖，圖17A-1為實施例1制備的CAVAPs的p-JNK蛋白表達曝光圖，17A-2為實施例1制備的CAVAPs的p-JNK蛋白相對表達量，圖17B-1為實施例4制備的CP-II的p-JNK蛋白表達曝光圖，17B-2為實施例4制備的CP-II的p-JNK蛋白相對表達量；圖18是實施例1制備的CAVAPs和實施例4制備的CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-P38蛋白表達的影響圖，圖18A-1為實施例1制備的CAVAPs的p-P38蛋白表達曝光圖，18A-2為實施例1制備的CAVAPs的p-P38蛋白相對表達量，圖18B-1為實施例4制備的CP-II的p-P38蛋白表達曝光圖，18B-2為實施例4制備的CP-II的p-P38蛋白相對表達量；圖19是實施例1制備的CAVAPs和實施例4制備的CP-II對RAW264.7巨噬細胞p-P65蛋白表達的影響圖，圖19A-1為p-P65蛋白表達曝光圖，19A-2為p-P65蛋白相對表達量，圖19B-1為實施例4制備的CP-II的p-P65蛋白表達曝光圖，19B-2為實施例4制備的CP-II的p-P65蛋白相對表達量。其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01。

正常組RAW264.7巨噬細胞內(nèi)磷酸化的ERK、JNK、P38和P65蛋白表達較低，當(dāng)不同濃度的CAVAPs(終濃度為125、250、500μg/mL)、CP-II(終濃度為125、200、250μg/mL)和LPS(終濃度為1μg/mL)作用細胞24h后，細胞內(nèi)磷酸化的ERK(圖16)、JNK(圖17)、P38(圖18)和P65(圖19)蛋白表達顯著上調(diào)(P＜0.01)，從而激活MAPK和NF-κB信號通路。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學(xué)

<120> 一種代代花萼多糖及其制備方法與應(yīng)用

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的forward

<400> 1

tttgtcaagc tcatttcctg gtatg 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的reverse

<400> 2

tgggataggg cctctcttgc 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的forward

<400> 3

tgaagggctg cttccaaacc tttgacc 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的reverse

<400> 4

tgtccattga ggtggagagc tttcagc 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的forward

<400> 5

tactcggcaa acctagtgcg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的reverse

<400> 6

gtgtcccaac attcatattg tcagt 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的forward

<400> 7

cggcaaacat gacttcaggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的reverse

<400> 8

gcacatcaaa gcggccatag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α的forward

<400> 9

ggggattatg gctcagggtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α的reverse

<400> 10

cgaggctcca gtgaattcgg 20