本發(fā)明涉及一種促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素的太子參均一多糖及其用途。

背景技術(shù)：

糖尿病是以持續(xù)性高血糖為主要特征的代謝性疾病。隨著人們生活水平的提高、生活方式的改變、工作壓力的增大，糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。糖尿病分為二型，1型糖尿病（type1 diabetes mellitus，T1DM）屬胰島素依賴型，2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2DM）是非胰島素依賴型，T2DM占糖尿病患者總數(shù)的90%以上，以不同程度的胰島素分泌不足和伴胰島素抵抗（IR）為主要致病機(jī)制。中國(guó)健康教育中心公布的“中國(guó)慢性病監(jiān)測(cè)及糖尿病專題調(diào)查”結(jié)果顯示，我國(guó)約有成年糖尿病患者9700萬(wàn)人，已成為世界第一糖尿病大國(guó)，患病率為9.7%，高于世界平均水平6.4%。

糖尿病的藥物治療，基本上是以控制血糖為主要手段，目前降糖藥包括雙胍類、磺脲類、胰島素三大類。近年來(lái)，一些新型口服降糖藥也開始在臨床使用，如α-糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、餐時(shí)血糖調(diào)節(jié)劑等?；瘜W(xué)降糖藥在控制血糖方面療效是非常肯定的，但也呈現(xiàn)出局限性和不良反應(yīng)，如低血糖、乳酸中毒、長(zhǎng)期使用后繼發(fā)性失效等。糖尿病，病程長(zhǎng)且復(fù)雜，基本上不能根治，最終導(dǎo)致腎病等多臟器并發(fā)癥；患者往往需要長(zhǎng)期甚至是終生用藥，其副作用對(duì)人體的損害因累積而難以克服。因此開發(fā)降糖作用溫和、平穩(wěn)、持久、毒副作用較小的藥物具有重要的意義。研究者將目光逐漸轉(zhuǎn)向中醫(yī)藥與天然藥物。

糖尿病屬于中醫(yī)消渴的范疇。消渴之名，首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》；東漢著名醫(yī)家張仲景在《金匱要略》中將消渴分為三種類型，渴而多飲者為上消，消谷善饑者為中消，口渴、小便如膏者為下消；按現(xiàn)行中藥新藥治療糖尿病的臨床研究，糖尿病分為：陰虛熱盛型、濕熱困脾型、氣陰兩虛型、血瘀水停型和血瘀脈絡(luò)型5種證型。中醫(yī)治療糖尿病注重整體調(diào)理、辨證論治，在降血糖的同時(shí)又改善脂質(zhì)代謝及能量代謝紊亂、改善微循環(huán)、保護(hù)胰島細(xì)胞功能等；積累了許多有效的方藥。特別對(duì)控制糖尿病性腎病、糖尿病足、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有明顯優(yōu)勢(shì)。

益氣健脾、氣陰雙補(bǔ)是中醫(yī)治療消渴病重要途徑之一。太子參，系石竹科太子參屬多年生草本宿根性植物異葉假繁縷Pseudostellaria heterophylla （Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根。具有益氣生津、補(bǔ)肺健脾之功效，被廣泛應(yīng)用到各類降糖的處方中。苗彥霞等歸納總結(jié)出了不同時(shí)期對(duì)糖尿病的中醫(yī)藥治療用藥規(guī)律。倪青等運(yùn)用方-證、藥-證關(guān)系理論，運(yùn)用無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)等數(shù)據(jù)挖掘方法，從中藥的功效、種類、單味藥的使用頻數(shù)及不同藥的配伍關(guān)系，探討其T2DM合并代謝綜合征的中醫(yī)證候特征及用藥特點(diǎn)。中醫(yī)使用以益氣養(yǎng)陰藥物為基礎(chǔ)，功效隨病程長(zhǎng)短呈現(xiàn)由養(yǎng)陰清熱，到益氣養(yǎng)陰、清熱，再到益氣活血，溫陽(yáng)、化濕利水的變化趨勢(shì)。太子參是最常用核心藥物。

發(fā)明人所在的團(tuán)隊(duì)，十余年來(lái)長(zhǎng)期致力于福建柘榮產(chǎn)太子參的研究。采用系統(tǒng)溶劑提取法，以T1DM和T2DM動(dòng)物模型為活性導(dǎo)向，對(duì)太子參抗糖尿病活性部位進(jìn)行系統(tǒng)篩選；發(fā)現(xiàn)50～200kDa分子量范圍的多糖，能夠改善T2DM胰島素抵抗，具有顯著降血糖作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素的太子參均一多糖及其用途。

一種促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素的太子參均一多糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

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其結(jié)構(gòu)特征為：太子參均一多糖為酸性多糖，分子量4.8×10⁴ Da，比旋光度[α]_D²⁵+174.5o(c 0.485，H₂O)；分子式由C、H、O三種元素組成，C:H:O=1:2.1:1.4；由單糖半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，半乳糖糖醛酸是多糖主要的單糖組成，α-1,4-連接半乳糖醛酸構(gòu)成了多糖的主鏈。部分半乳糖醛酸C₆-OH發(fā)生甲酯化，C₂和C₃上的羥基部分被乙?；?，主鏈上存在少量鼠李糖；1,5-連接的阿拉伯糖構(gòu)成支鏈。

所述的太子參均一多糖的制備方法，具體步驟如下：

（一）太子參抗T2DM多糖有效部位提取：

（1）取太子參干品，粉碎成粗粉，過(guò)40目篩；用8倍量的90%乙醇連續(xù)回流提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，藥渣加適量蒸餾水連續(xù)回流提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾合并濾液，濃縮至適量，備用；

（2）將步驟（1）所得水提取物用Sevage法除去蛋白，藥液：氯仿：正丁醇=25:5:1（v:v），振搖5min，靜置分層，4000r/min離心5min，收集上清液；上清液用終濃度90%乙醇沉淀，靜置24h，離心5min，分離沉淀獲得粗多糖，冷凍干燥備用；

（3）采用40%的乙醇沉降分級(jí)，獲得分子量在50～200 kDa范圍的多糖，為抗T2DM多糖活性部位（PF40）；

（二）分離純化：

取太子參抗T2DM有效部位多糖PF40，溶于H₂O中，使溶液濃度為25~50mg/mL；以DEAE-Cellulose 52型層析柱，上樣后，依次用H₂O、0.1mol/L~1.0mol/L NaCl溶液梯度洗脫，洗脫液中多糖含量用苯酚-硫酸法檢測(cè)跟蹤，以高效凝膠色譜法（HPGPC）測(cè)定定多糖分子量；依上述步驟反復(fù)分離純化，獲得所述均一多糖，冷凍干燥，備用。

本發(fā)明還保護(hù)了太子參均一多糖在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明涉及的是從中藥太子參抗2型糖尿病多糖有效部位中分離得到的1個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的均一多糖的制備及其化學(xué)結(jié)構(gòu)，其能促進(jìn)Ins-1細(xì)胞胰島素分泌，為將來(lái)在開發(fā)抗糖尿病藥物、保健品等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為太子參均一多糖的IR光譜圖；

圖2為太子參均一多糖的¹H核磁共振光譜；

圖3為太子參均一多糖的多糖核磁分析¹³C-NMR光譜；

圖4為太子參均一多糖的H-H COSY譜；

圖5為太子參均一多糖的HSQC譜；

圖6為太子參均一多糖的HMBC譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不僅僅限于這些實(shí)施例。

一、實(shí)施例

一種促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素的太子參均一多糖的制備方法，具體步驟如下：

（一）太子參抗T2DM多糖有效部位提?。?/p>

（1）取太子參干品，粉碎成粗粉，過(guò)40目篩；用8倍量的90%乙醇連續(xù)回流提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，藥渣加適量蒸餾水連續(xù)回流提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾合并濾液，濃縮至適量，備用；

（2）將步驟（1）所得水提取物用Sevage法除去蛋白，藥液：氯仿：正丁醇=25:5:1（v:v），振搖5min，靜置分層，4000r/min離心5min，收集上清液；上清液用終濃度90%乙醇沉淀，靜置24h，離心5min，分離沉淀獲得粗多糖，冷凍干燥備用；

（3）采用40%的乙醇沉降分級(jí)，獲得分子量在50～200 kDa范圍的多糖，為抗T2DM多糖活性部位（PF40）；

（二）分離純化：

取太子參抗T2DM有效部位多糖PF40，溶于H₂O中，使溶液濃度為25~50mg/mL；以DEAE-Cellulose 52型層析柱，上樣后，依次用H₂O、0.1mol/L~1.0mol/L NaCl溶液梯度洗脫，洗脫液中多糖含量用苯酚-硫酸法檢測(cè)跟蹤，以高效凝膠色譜法（HPGPC）測(cè)定定多糖分子量；依上述步驟反復(fù)分離純化，獲得所述均一多糖，冷凍干燥，備用。

上述實(shí)施例制得的太子參均一多糖的結(jié)構(gòu)式：

二、所述太子參均一多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

HPGPC測(cè)得分子量為4.8×10⁴ Da，比旋光度[α]_D²⁵+174.5o(c 0.485，H₂O)；PMP柱前衍生化法測(cè)定單糖組成，均一多糖由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖組成；元素分析多糖不含N和S元素，主要由C、H、O三種元素組成，C:H:O=1:2.1:1.4。

紅外光譜（IR）顯示了典型的多糖類吸收特征峰，在3426.69、2930.25、1418.51、1021.35cm^-1的強(qiáng)吸收峰，分別來(lái)自于羥基-OH、C-H、環(huán)外C-O及糖環(huán)內(nèi)C-O的伸縮震動(dòng)；1745.20cm^-1 出現(xiàn)羧基吸收峰，源于糖醛酸的羧基，結(jié)合單糖組成分析，推斷所述均一多糖為酸性多糖，見圖1。

根據(jù)¹H核磁共振光譜（如圖2所示）和多糖核磁分析¹³C-NMR光譜（如圖3所示），δ176.50ppm和172.18ppm 兩組信號(hào)來(lái)源于α-半乳糖醛酸的6位碳（C₆），當(dāng)部分半乳糖醛酸C₆-OH發(fā)生甲酯化時(shí)，C₆ 的化學(xué)位移值向低場(chǎng)遷移；根據(jù)核磁規(guī)律 δ 54 pmm 附近有一組信號(hào)，δ 176.50ppm 信號(hào)應(yīng)歸屬于C₆發(fā)生甲酯的半乳糖醛酸，172.18ppm信號(hào)歸屬于未發(fā)生甲酯的半乳糖醛酸，而δ54.11ppm信號(hào)歸于CH₃O；半乳糖醛酸C₂和C₃上的羥基容易被乙?；?，所以δ21.38ppm信號(hào)歸屬于CH₃CO。

根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度及糖醛酸多糖NMR解析規(guī)律，δ100.29ppm異頭碳信號(hào)信來(lái)源于α-1,4連接半乳糖醛酸的C₁；δ108.11ppm 和62.38ppm信號(hào)分別歸屬于阿拉伯糖的C₁和C₅，而δ18.04ppm微弱的信號(hào)是來(lái)源于鼠李糖的C₆。根據(jù) H-H COSY譜（如圖4所示）和HSQC譜（如圖5所示）及α-1,4連接半乳糖醛酸相關(guān)文獻(xiàn)，α-1,4連接半乳糖醛酸其他C和H信號(hào)歸屬如表1。HSQC中δ100.29ppm異頭碳信號(hào)與δ5.10ppm異頭H有相關(guān)信號(hào)，說(shuō)明δ5.10ppm為α-1,4連接半乳糖醛酸的異頭H₁的信號(hào)。HMBC（如圖6所示）有清晰的半乳糖醛酸C4和H1相關(guān)信號(hào)。因此，半乳糖糖醛酸是多糖主要的單糖組成，1,4-連接半乳糖醛酸構(gòu)成了多糖的主鏈。

表1 均一多糖主鏈¹³C和¹H譜化學(xué)位移

三、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)（太子參均一多糖對(duì)Ins-1細(xì)胞分泌胰島素的影響）

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及操作流程

大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，另含100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-谷氨酰胺和50μM β-巰基乙醇。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO₂孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，四天傳一代。

培養(yǎng)液更換：新接種的INS-1 24h后貼壁，貼壁前細(xì)胞透亮，體積較小、折光性強(qiáng)，貼壁后細(xì)胞的觸角伸出呈現(xiàn)不規(guī)則的多角形。培養(yǎng)液使用前需37℃水浴中加熱，一般隔天換液一次。

細(xì)胞傳代：細(xì)胞貼別后生長(zhǎng)很快，3-4天后細(xì)胞融合度可達(dá)80%以上，此時(shí)需要將細(xì)胞傳代。舍棄原有的培養(yǎng)液，37℃ PBS沖洗2次；加入0.25% Tripsin-EDTA消化液1mL，置于37℃靜止消化l-2min；加RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)吹打，形成單細(xì)胞懸液，按1:2-1:3傳代，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合程度近80-90%的細(xì)胞。顯微鏡下觀察，形態(tài)飽滿、細(xì)胞輪廓清楚，高倍鏡下見明顯細(xì)胞核形態(tài)。加0.25% Tripsin-EDTA消化，吹打好的單細(xì)胞懸液于1000 rpm離心3-5min。細(xì)胞凍存于1.8ml的凍存管內(nèi)。加10% DMSO和90% FBS配制的凍存液，擰緊管蓋，在凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。冰箱冷藏室（4℃ 30min）→低溫冰箱（-20℃ 1h）→低溫冰箱（-80℃ 過(guò)夜）→液氮。

細(xì)胞復(fù)蘇：取出一支凍存的INS-1細(xì)胞，在37℃水浴中不斷搖動(dòng)細(xì)胞凍存管，凍存液需要在1min內(nèi)完全融化。溶化后，管口用75%酒精棉球擦拭消毒，凍存液吸入離心管中，加10mL培養(yǎng)液吹打混勻，800rpm離心5min離心去掉DMSO。重懸細(xì)胞后，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶加培養(yǎng)液5 mL，吹打混勻，置于37℃ 5%CO₂培養(yǎng)箱中。

2.試劑的配制

準(zhǔn)確稱取12mg太子參均一多糖溶于10mL培養(yǎng)液中，濃度為1200mg/L，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度100、200、400、500、600 mg/L。

格列齊特溶液的配制：稱取格列齊特32.34mg加入二甲基亞礬（DMSO）10mL溶解，即為1×10^-2mol/L的格列齊特；取其100μL溶于9.9mL的RPMI 1640培養(yǎng)液中，即得1×10^-4mol/L格列齊特溶液；取其10mL溶于9mL的RPMI 1640培養(yǎng)基中，即得1×10^-5 mol/L格列齊特溶液。配好的溶液4℃冰箱避光儲(chǔ)存。

無(wú)糖KRBH buffer配制：逐一稱取各組分，依次溶解于800 ml無(wú)菌水中，磁力攪拌助溶，調(diào)整液體PH值為7.35，補(bǔ)足總體積至1L，過(guò)濾除菌，4℃冰箱分裝保存。

3. 不同時(shí)間、不同濃度太子參均一多糖對(duì)Ins-1細(xì)胞胰島素分泌的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁵個(gè)/mL，接種于24孔板。24 h后細(xì)胞貼壁，按如下分組給藥干預(yù)。

1）空白組：給予RPMI-1640培養(yǎng)液。

2）PF40太子參多糖作用組：用RPMI-1640培養(yǎng)液配制，濃度為0、100、200、300、400、500、600 mg/L。

3）陽(yáng)性藥物格列齊特組：濃度為10^-5 mol/L。

多糖與細(xì)胞共同孵育后，在12h、24h、48h、72h吸棄上清，以37℃預(yù)熱的PBS洗3遍。加入預(yù)熱的含3.3 mM 葡萄糖的KRBH緩沖液平衡1 h，棄上清。加入含16.7 mM 葡萄糖的KRBH緩沖液37℃培養(yǎng)2 h，取上清4℃ 1000rpm離心5 min，上清-80℃保存，用于放射性免疫分析法檢測(cè)胰島素，見表2。

4. 結(jié)果

表2 不同時(shí)間、不同濃度太子參均一多糖對(duì)Ins-1 細(xì)胞分泌胰島素的影響

5. 結(jié) 論

INS-1細(xì)胞源于最初輻射誘導(dǎo)的腫瘤，后來(lái)通過(guò)在2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-ME）培養(yǎng)液中生成腫瘤物質(zhì)。這些細(xì)胞表現(xiàn)出胰島β細(xì)胞的許多重要特性，包括相對(duì)較高的胰島素含量和對(duì)生理濃度葡萄糖刺激的反應(yīng)能力，因此被廣泛用于研究胰島素分泌機(jī)制。

與對(duì)照組比較，經(jīng)不同濃度太子參均一多糖處理12、24及48 h后均可顯著提高Ins-1細(xì)胞的胰島素分泌量，且具有劑量及時(shí)間依賴性。400mg/L太子參多糖，干預(yù)48 h后對(duì)Ins-1細(xì)胞的刺激作用最強(qiáng)，分泌的胰島素最多。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胰島素釋放量降低，至72 h，Ins-1細(xì)胞胰島素釋放出現(xiàn)失代償，但是促進(jìn)Ins-1細(xì)胞分泌胰島素的作用并不顯著。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。