本發(fā)明屬于真菌多糖應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的天然產(chǎn)物橙蓋鵝膏菌多糖AC-1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多糖(polysaccharides)又稱多聚糖，是生物體普遍存在的一類生物大分子，不僅參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成，而且是多種內(nèi)源性生物活性分子的重要組成成分。近代生物化學(xué)一直把多糖視作生物體內(nèi)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如纖維素和幾丁質(zhì))和提供能量來源(如淀粉和糖元)的物質(zhì)，沒有給予足夠的重視。多糖的發(fā)展較蛋白質(zhì)、核酸晚得多，加上多糖本身的復(fù)雜性和多樣性，對多糖結(jié)構(gòu)測定、表征鑒定都提出了巨大挑戰(zhàn)。目前，多糖的研究水平要大大落后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。

近20年來，關(guān)于多糖生物活性的研究報(bào)道主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面，其作用是多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的。

橙蓋鵝膏菌(學(xué)名：Amanita caesarea)，又名橙蓋傘、黃羅傘及白橙蓋鵝膏菌，有“凱撒磨菇”之稱，是鵝膏屬的食用菌，原產(chǎn)于歐洲南部及北非。它的菌蓋呈突出的橙色，菌褶及菌莖呈黃色，具有鮮橙黃色的菌蓋和菌柄，未完全張開時(shí)包裹在白色的菌托里很萌，有“雞蛋菌”的別稱。

目前，對橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的精細(xì)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性研究及其應(yīng)用尚未見任何報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種新的天然產(chǎn)物橙蓋鵝膏菌多糖AC-1及其應(yīng)用。

其具體技術(shù)方案為：

一種新的天然產(chǎn)物橙蓋鵝膏菌多糖AC-1，由兩個(gè)單糖組成的雜多糖，即α-D-葡萄糖和α-D–木糖以2:1的比例組成，平均分子量約為19329D，具有(1,4)-α-D-葡萄糖及(1,3,6)-α-D-glucose的骨架，6-O上連接一個(gè)→1)-α-D–木糖的側(cè)鏈，橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明所述新的天然產(chǎn)物橙蓋鵝膏菌多糖AC-1在抗氧化藥物制備過程中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的天然產(chǎn)物橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對DPPH^-和ABTS⁺自由基具有抗氧化作用，濃度為1mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對DPPH抑制率為37.09％，濃度為6mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對DPPH抑制率可達(dá)89.74％。IC₅₀值為1.69mg/ml。濃度為1mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對ABTS抑制率為88.51％，濃度為6mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對ABTS抑制率可達(dá)97.63％。IC₅₀值為0.92mg/ml。

附圖說明

圖1橙蓋鵝膏菌純多糖重均分子量；

圖2橙蓋鵝膏菌的紅外譜；

圖3橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的1H NMR圖譜；

圖4橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的13C NMR圖譜；

圖5橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的高效液相圖；

圖6是橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的氣質(zhì)聯(lián)用圖，其中，圖6a(1,4)-α-D-葡萄糖

圖6b(1,3,6)-α-D-葡萄糖，圖6c→1)-α-D–木糖的側(cè)鏈；

圖7橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的結(jié)構(gòu)；

圖8橙蓋鵝膏菌多糖AC-1清除DPPH作用；

圖9橙蓋鵝膏菌多糖AC-1清除ABTS作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

實(shí)施例1橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的分離提取

1.1.經(jīng)過熱水浸提、醇沉后，得到橙蓋鵝膏菌多糖AC-1粗提物。運(yùn)用DEAE-cellulose column和Sephadex G-100column進(jìn)行分離純化，得到橙蓋鵝膏菌多糖AC-1。

1.2.橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的結(jié)構(gòu)鑒定

運(yùn)用水解、甲基化分析、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、掃描電鏡技術(shù)(SEM)、紅外譜技術(shù)(IR)、核磁共振技術(shù)(NMR)，對橙蓋鵝膏菌純品多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

1.2.1分子量的測定

將3mg橙蓋鵝膏菌多糖AC-1樣品溶解于1mlddH₂O中，超聲5min，進(jìn)行HPGPC分析，數(shù)據(jù)用GPC軟件分析后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照測得分子量1.1×10⁴D(標(biāo)準(zhǔn)品T-10，20，50，80，130)。

1.2.2橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的硅烷化衍生與甲基化分析

將標(biāo)準(zhǔn)單糖和上述干燥后水解產(chǎn)物進(jìn)行硅烷化衍生步驟如下：1.0mg的樣品溶解于0.2ml的無水吡啶，然后加0.2ml的六甲基二硅氮烷和0.1mg的三甲基氯硅烷，50℃溫育20min，然后10000rpm離心20min，取上層溶液用于甲基化分析。

1.2.3橙蓋鵝膏菌多糖AC-1GC-MS譜分析

GC條件：色譜柱：Rtx-5sil MS(5％phenylmethylsiloxane 30mm×0.25mm×0.25μm)；

進(jìn)樣器溫度、GC-MS界面溫度、離子源溫度和檢測器溫度分別為250、250、230和250℃，升溫程序：80℃(3min)10℃/min 250℃(30min)；載氣：高純氦氣。

1.2.4橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的紅外譜分析

當(dāng)橙蓋鵝膏菌多糖AC-1樣品2mg左右，KBr壓片，紅外分光光度計(jì)4000cm^-1-400cm^-1。

1.2.5橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的核磁共振分析

取橙蓋鵝膏菌多糖AC-1樣品10mg左右溶于0.5mL重水(D₂O)中，在核磁共振儀上常溫測定，400MHz測¹HNMR譜，400MHz測¹³CNMR譜。

1.3結(jié)果

1.3.1橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的基本性質(zhì)結(jié)果

橙蓋鵝膏菌純多糖重均分子量為19329D(見圖1)。

1.3.2橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的FTIR譜分析

如圖2所示，橙蓋鵝膏菌多糖AC-1在紅外譜中顯示3437.96cm^-1的寬吸收峰指定為O-H和N-H伸縮振動峰，存在著分子內(nèi)和分子間的氫鍵。2922.85cm^-1指定為-CH2，-CH3的伸縮振動峰。1630.46cm^-1和1400.68cm^-1指定為C＝O,C＝C振動峰。1120.19cm^-1在1200-1000cm^-1范圍內(nèi)指定為-COOH中的C-O-H伸縮振動和吡喃環(huán)中醚鍵C-O-C伸縮振動。569.28cm^-1指示橙蓋鵝膏菌多糖AC-1有α型吡喃環(huán)。

1.3.3橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的NMR譜分析

異頭氫信號δ5.06,δ4.99指示在橙蓋鵝膏菌多糖AC-1中α型異頭氫存在(見圖3)，且兩者均與紅外譜顯示相一致。在碳譜中¹³C NMR(400MHz)95–105ppm區(qū)域的共振信號峰歸屬于α-D-葡萄糖和α-D–木糖的碳質(zhì)子信號(見圖4，表1)。

表1橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的¹³C NMR圖中的化學(xué)位移

1.3.4橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的高效液相分析結(jié)果

橙蓋鵝膏菌多糖AC-1由α-D-葡萄糖和α-D-木糖兩種糖構(gòu)成，比例為2:1(圖5)

1.3.5橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的GC-MS譜分析結(jié)果

從橙蓋鵝膏菌中獲得一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的由兩個(gè)單糖組成的雜多糖，即α-D-葡萄糖和α-D–木糖以2:1的比例組成，平均分子量約為19329D，具有(1,4)-α-D-葡萄糖(圖6a)及(1,3,6)-α-D-glucose的骨架(圖6b)，6-O上連接一個(gè)→1)-α-D–木糖的側(cè)鏈(圖6c)(表2)，綜上可初步推斷橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的結(jié)構(gòu)(見圖7)。

表2橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的甲基化GC-MS數(shù)據(jù)

實(shí)施例2.橙蓋鵝膏菌多糖AC-1的抗氧化活性研究

在體外運(yùn)用兩種化學(xué)方法測定橙蓋鵝膏菌純多糖的抗氧化活性，包括DPPH-自由基的清除、ABTS⁺陽離子自由基清除。

2.1試劑

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH-)；30％H₂O₂；維生素C(Vc)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)；ABTS

2.2儀器

721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；

2.3方法

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照Braca方法，樣品提取液配置成合適濃度(1，2，3，4，5，6mg/mL)。取1mL待測溶液，加入2.0mL 0.2mM DPPH-溶液(用無水乙醇配制)，搖勻后放置30min。乙醇調(diào)零，517nm處測定A樣品的吸光值。同時(shí)測定1.0mL樣品溶液與2.0mL乙醇混合液，在517nm處的吸光度作為A對照。以Vc和BHT作為陽性對照。DPPH清除能力＝(1－A樣品/A對照)×100％。

2.3.2 ABTS⁺陽離子自由基清除能力測定

7mmol/LABTS水溶液和2.45mmol/L過硫酸鉀避光還原12-16h，ABTS溶液用PBS(pH7.4)稀釋至630nm測定值為0.50±0.05。取10μL樣品90μLABTS溶液混合反應(yīng)，置于暗處3min。用樣品PBS溶液作為樣品顏色空白參比，PBS溶液為空白對照，在酶標(biāo)儀上于734nm處檢測。依據(jù)下列公式計(jì)算清除率：ABTS清除率(％)＝[A空白－(A樣品－A對照)]/A空白×100％

2.4結(jié)果

2.4.1.橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對DPPH-自由基清除活性

純化的橙蓋鵝膏菌多糖AC-1樣品多DPPH自由基有很好的清除活性，濃度為1mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對DPPH抑制率為37.09％，濃度為6mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對DPPH抑制率可達(dá)89.74％。IC₅₀值為1.69mg/ml，劑量越大，效果越好。

2.4.2.橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對ABTS+陽離子自由基清除的活性使用分光光度計(jì)在734nm處的測定橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對ABTS+陽離子自由基清除的活性。結(jié)果表明，濃度為1mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對ABTS抑制率為88.51％，濃度為6mg/ml橙蓋鵝膏菌多糖AC-1對ABTS抑制率可達(dá)97.63％。IC₅₀值為0.92mg/ml，劑量越大，效果越好。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。