本發(fā)明涉及dna檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒。
背景技術(shù)：
：腫瘤的發(fā)生涉及多因素、多環(huán)節(jié)，現(xiàn)已證實腫瘤的生物學(xué)特征不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且還與核外的線粒體dna(mtdna)關(guān)系密切。人類mtdna是一條長為16569bp的雙鏈閉環(huán)分子，是細(xì)胞內(nèi)唯一存在的核外遺傳物質(zhì)，包含37個基因，其中13個參與編碼電子傳遞鏈復(fù)合體的亞單位，另外的2個rrna基因和22個trna基因，主要參與線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。d-環(huán)區(qū)(d-loop區(qū))是mtdna的非編碼區(qū)，包含mtdna的復(fù)制起始位點和轉(zhuǎn)錄啟動子，是mtdna分子復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心，因此稱為控制區(qū)。d-loop區(qū)全長共1122bp，含有兩個高變區(qū)，即高變區(qū)i(hvi)和高變區(qū)ii(hvii)，人群個體之間的mtdna在此區(qū)間存在著大量的堿基差異，核酸替代的發(fā)生極大地高于單拷貝的核dna，腫瘤中d-loop的突變率較其他區(qū)要高很多。因此，研究線粒體在各種腫瘤細(xì)胞中的突變，特別是d-loop區(qū)的突變，成為研究線粒體與腫瘤發(fā)生機(jī)制的一種基礎(chǔ)。現(xiàn)階段，對于低豐度及稀有突變的檢測方法，比如熒光定量pcr(real-timequantitativepcr，qpcr)，毛細(xì)管測序(capillaryelectrophoresis)及二代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing，ngs)的方法都較容易受到背景dna的干擾，使得檢測靈敏度和精確度都達(dá)不到精準(zhǔn)定量的要求，難以檢測到稀有拷貝數(shù)的突變，比如熒光定量pcr檢測樣本cq值大于30的情況下，數(shù)據(jù)精確度和重復(fù)性都急劇下降。一般來說，毛細(xì)血管電泳和定量pcr的檢測靈敏度在1～0.1％，ngs的靈敏度在0.1～10％。有關(guān)文獻(xiàn)報道線粒體d-loop區(qū)中94g>a突變與腫瘤的發(fā)生有重要關(guān)系。但是，目前針對mtdnad-loop區(qū)94位點突變檢測靈敏度和特異性較低。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：目前，尚無關(guān)于利用ddpcr和mgb探針檢測線粒體dnad-loop區(qū)94位點突變情況的研究報道。基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合。本發(fā)明的另一目的在于提供上述核酸組合在藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制或制備用于疾病診斷、預(yù)測或療效評估的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供上述核酸組合在檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的試劑盒。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合，其包括：用于在ddpcr反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段的引物對，上述引物對的核苷酸序列如seqidno:1-2所示；野生型檢測探針，上述野生型檢測探針的核苷酸序列如seqidno:3所示；以及，突變型檢測探針，上述突變型檢測探針的核苷酸序列如seqidno:4所示；上述野生型檢測探針和上述突變型檢測探針的3’端均標(biāo)記有mgb基團(tuán)。上述核酸組合在藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制或制備用于疾病診斷、預(yù)測或療效評估的試劑盒中的應(yīng)用。上述核酸組合在檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變中的應(yīng)用。一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的試劑盒，其包括上述核酸組合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的提供的用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合，其包括用于在ddpcr反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段的seqidno:1-2所示的引物對、3’端均標(biāo)記有mgb基團(tuán)的seqidno:3所示的野生型檢測探針和seqidno:4所示的突變型檢測探針，該核酸組合針對線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變位點設(shè)計，并結(jié)合ddpcr技術(shù)和mgb基團(tuán)，可對線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、特異性好的特點；該核酸組合可以用于藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制以及制備用于疾病診斷、預(yù)測或療效評估的試劑盒等領(lǐng)域。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明實施例2提供的質(zhì)粒puc57的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明實施例2提供的采用由本發(fā)明實施例1提供的核酸組合檢測野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒以不同比例混合的ddpcr一維結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實施例2例提供的采用由本發(fā)明實施例1提供的核酸組合檢測野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒以不同比例混合的ddpcr的陽性微滴數(shù)結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明實施例3提供的采用由本發(fā)明實施例1提供的核酸組合檢測樣本編號為hcs-0318的癌組織(c)與癌旁組織(p)的ddpcr檢測結(jié)果；圖5為本發(fā)明實施例4提供的采用由本發(fā)明實施例1提供的核酸組合檢測的樣本編號為hcs-0345的癌組織(c)與癌旁組織(p)的ddpcr檢測結(jié)果；圖6為本發(fā)明實施例4提供的采用由本發(fā)明實施例1提供的核酸組合檢測樣本編號為hcs-0444的癌組織(c)與癌旁組織(p)的ddpcr檢測結(jié)果。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對本發(fā)明實施例的一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒進(jìn)行具體說明。一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合，其包括：用于在ddpcr反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段的引物對，上述引物對的核苷酸序列如seqidno:1-2所示；野生型檢測探針，上述野生型檢測探針的核苷酸序列如seqidno:3所示；以及，突變型檢測探針，上述突變型檢測探針的核苷酸序列如seqidno:4所示；上述野生型檢測探針和上述突變型檢測探針的3’端均標(biāo)記有mgb基團(tuán)。其中，seqidno:1-2所示的引物對，其針對線粒體dnad-loop區(qū)94g>a突變位點進(jìn)行設(shè)計，用于在ddpcr反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段，具有較好的特異性，可避免非特異性擴(kuò)增，該引物對所擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含了d-loop區(qū)的94位點。野生型的目標(biāo)片段堿基序列：gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacgggagctctccatgcatttggtattttcgtctggggggtgtgcacgcgatagcattgcgagacgctggagccggagcaccctatgtcgcagtatctgtctttgattcctgcctcatcctattatttatcgcacctacgttc。下劃線處為d-loop區(qū)的94位點(突變型的目標(biāo)片段在下劃線處的堿基為a)。其中，seqidno:1所示的引物為正向引物，seqidno:2所示的引物為反向引物。所擴(kuò)增的片段長度為擴(kuò)增片段長度174bp[homosapiensmtdna(genebankno.ay963573)np1-174]。另外，ddpcr(dropletdigitalpcr，微滴式數(shù)字化pcr)通過核心的微滴化處理，將pcr反應(yīng)液分配至20000個微滴內(nèi)，使得稀有核酸序列與大量的背景dna分開，提高其相對含量，進(jìn)行pcr反應(yīng)后，逐一對每個微滴進(jìn)行熒光信號的檢測，含有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例，對核酸分子的計量實現(xiàn)了絕對定量，提高了檢測的靈敏度和重復(fù)性。稀有突變的檢測容易受到大量背景野生dna干擾，ddpcr技術(shù)能將靶基因分散到獨立的微滴中進(jìn)行檢測，所以靈敏度極高。seqidno:3所示的野生型檢測探針，可針對野生型的94突變位點(g)特異性檢測；seqidno:4所示的突變型檢測探針，可針對突變型94突變位點(a)特異性檢測；上述野生型檢測探針和突變型檢測探針均是mgb探針，二者的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，二者的3’端均標(biāo)記有mgb基團(tuán)。mgb探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(non-fluorescentquencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。同時探針上還連接有mgb修飾基團(tuán)，mgb修飾基團(tuán)可以穩(wěn)定探針與模板的雜交，提高探針的退火溫度，縮短了探針長度，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，有利于提高探針的特異性。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述野生型檢測探針的5’端標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)，上述突變型檢測探針的的5’端標(biāo)記有第二熒光基團(tuán)，上述第一熒光基團(tuán)和上述第二熒光基團(tuán)均選自eam、hex和tex中的一種。應(yīng)當(dāng)容易理解到，第一熒光基因和第二熒光基團(tuán)的類型可以不同，也可以相同。若第一熒光基因和第二熒光基團(tuán)的類型不同，則該核酸組合可全部加入至一個反應(yīng)體系中反應(yīng)，檢測儀器在不同熒光通道下檢測熒光信號。若第一熒光基因和第二熒光基團(tuán)的類型相同，則該核酸組合可針對野生型d-loop區(qū)94位點(g)和突變型d-loop區(qū)94位點(a)分開檢測，配置兩個反應(yīng)體系。檢測儀器在同種熒光通道下檢測熒光信號。另一方面本發(fā)明提供了上述核酸組合在藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制或制備用于疾病診斷、預(yù)測或療效評估的試劑盒中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，上述疾病與線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變相關(guān)。另一方面，本發(fā)明提供了上述核酸組合在檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，上述應(yīng)用包括：配制pcr預(yù)混液，將上述pcr預(yù)混液形成微滴，并進(jìn)行ddpcr反應(yīng)；其中，上述pcr預(yù)混液含有上述核酸組合中的上述引物對、上述野生型檢測探針以及上述突變型檢測探針。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，在上述pcr預(yù)混液中，上述引物對的濃度為0.8-1μm，上述野生型檢測探針的濃度為0.4-0.6μm，上述突變型檢測探針的濃度為0.4-0.6μm。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述pcr預(yù)混液為：20μl反應(yīng)體系，含濃度為20μm的引物各0.9μl，濃度為5μm的探針各2μl，2×probeddpcrsupermix10μl，補(bǔ)滅菌水至總體積20μl。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應(yīng)的退火溫度為62-64℃。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性10分鐘；94℃變性30秒鐘，63℃退火1分鐘，共40個循環(huán)；10℃保存。待測樣本檢測結(jié)果的判定方法為：(1)陽性：標(biāo)本陽性微滴數(shù)≥2個；(2)陰性：標(biāo)本陽性微滴數(shù)<2個。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的試劑盒，其包括上述核酸組合。進(jìn)一步地，上述試劑盒還包括：pcr反應(yīng)緩沖液、dntps、taq酶、mg2+、ddh2o中的一種或多種。綜上，本發(fā)明的提供的用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合，利用ddpcr技術(shù)和mgb探針的原理，可針對線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變位點進(jìn)行檢測，尤其是針對稀有突變進(jìn)行檢測，其具有靈敏度高、特異性好的特點；該核酸組合可以用于藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制以及制備用于疾病診斷、預(yù)測或療效評估的試劑盒等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景；此外，本發(fā)明提供的試劑盒，可簡單、方便地對線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變位點進(jìn)行檢測，同樣具有特異性好、靈敏度高等特點。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實施例1本實施例提供了用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合，其包括：用于在ddpcr反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段的引物對、野生型檢測探針(94w-probe)以及突變型檢測探針(94m-probe)；引物對包括正向引物(forwardprimer)和反向引物(reverseprimer)。其中，野生型檢測探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)hex，3’端標(biāo)記有mgb基團(tuán)；突變型檢測探針5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam，3’端標(biāo)記有mgb基團(tuán)。引物對、野生型檢測探針以及突變型檢測探針的核苷酸序列見表1。表1本實施例提供的核酸組合檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的檢測方法，參考如下步驟：1.1配制pcr預(yù)混液，20μl的pcr預(yù)混液中各試劑成分見表2。表2試劑體積2×supermixforprobe(不含dutp)10μlforwardprimer(20μm)0.9μlreverseprimer(20μm)0.9μl94w-probe(5μm)2μl94m-probe(5μm)2μldna模板4μlh2o0.2μltotal20μl在表2中：當(dāng)dna模板為重組質(zhì)粒時，濃度稀釋到105copies/μl；模板為組織dna時，反應(yīng)體系終濃度不超過66ng。1.2微滴生產(chǎn)將20μl樣品反應(yīng)體系加入到微滴生成卡中間的8個孔內(nèi)，避免引入氣泡；在微滴生成卡下排8個孔內(nèi)各加入70μl探針生成油；蓋上膠墊，然后平穩(wěn)的放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，一般2分鐘完成；將上排生成的微滴轉(zhuǎn)移到數(shù)字pcr96孔板中；熱封膜標(biāo)記有紅線的一面朝上置于96孔板上，放入熱封儀中進(jìn)行封膜，運行程序：180℃，5s，最后普通pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增。1.3ddpcr反應(yīng)程序ddpcr反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性10分鐘；94℃變性30秒鐘，63℃退火1分鐘，共40個循環(huán)；10℃保存。其中，63℃為最佳退火溫度。1.4微滴讀取將已完成pcr反應(yīng)的96孔板置于bio-radqx200dropletreader進(jìn)行微滴讀取，在hex通道下檢測野生型熒光信號，fam通道下檢測突變型熒光信號，利用quanatsoft1.6軟件進(jìn)行分析。1.5檢測結(jié)果的判定方法為：(1)陽性：標(biāo)本陽性微滴數(shù)≥2個；(2)陰性：標(biāo)本陽性微滴數(shù)<2個。實施例2靈敏度檢測2.1合成重組質(zhì)粒(由通用生物公司合成)，該重組質(zhì)粒puc57有在質(zhì)粒puc57(如圖1所示)的基礎(chǔ)上在ecori酶切位點插入序列(含線粒體dnad-loop區(qū)94位點在內(nèi)的281bp基因序列(seqidno:5，homosapiensmtdna(genebankno.ay963573)np1-281))得到，重組質(zhì)粒分為突變質(zhì)粒(94位點為a型)和野生質(zhì)粒(94位點為g型)。處理干粉質(zhì)粒，根據(jù)以下公式調(diào)整質(zhì)粒拷貝數(shù)，并稀釋成105copies/μl：mwdna(daltons)＝(puc57-vector+insert)×660(daltons/bp)＝(2704bp+281bp)×660(daltons/bp)＝1.97×106(daltons)；cndna(copies/μl)＝cdna(ng/μl)×6.02×1014/mwdna＝cdna(ng/μl)×6.02×1014/1.97×106＝cdna(ng/μl)×3.06×108；(cndna:質(zhì)?？截悢?shù)；cdna:質(zhì)粒dna濃度；mwdna:質(zhì)粒分子量)。2.2將野生型質(zhì)粒與突變型質(zhì)粒以不同比例混合(w/m＝0:100；50:50；80:20；90:10；99:1；999:1；100:0)作為模板，按實施例提供的檢測方法檢測其靈敏度。結(jié)果如圖2和圖3所示。圖2顯示了野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒以不同比例混合的ddpcr一維結(jié)果圖，圖中：藍(lán)色代表陽性微滴，灰色代表陰性微滴；mt，50％m，20％m，10％m，1％m，0.1％m，w代表野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒以不同比例混合的模板，依次對應(yīng)的比例分別是：w/m＝0:100；50:50；80:20；90:10；99:1；999:1；100:0；ntc為無質(zhì)粒模板對照；ch1代表fam基團(tuán)的熒光信號，ch2代表hex基團(tuán)的熒光信號。圖3顯示了野生質(zhì)粒與突變質(zhì)粒以不同比例混合后檢測出的陽性微滴數(shù)的柱狀圖。圖2和圖3的結(jié)果顯示本發(fā)明實施例1提供的核酸組合在ddpcr技術(shù)平臺上檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的靈敏度能達(dá)到0.1％，可見其具有靈敏度高，特異性好的特點。實施例3采用實施例1的提供的核酸組合在檢測樣本編號為hcs-0318的腫瘤組織(c)和癌旁組織(p)(實施例3-實施例5中的肝癌腫瘤組織和癌旁組織樣本均來源于經(jīng)病理確診的肝癌病人，該樣本由本實驗室課題合作方第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部線粒體與腫瘤實驗室所提供)的mtdna的dnad-loop區(qū)94位點的突變情況。方法如下：3.1腫瘤組織dna提取組織dna提?。喝∫旱獌龃娴陌┙M織及其癌旁組織標(biāo)本約0.5g，無菌剪刀剪碎，然后按照組織dna提取試劑盒(北京天根公司)說明書進(jìn)行提取。3.2檢測(方法同實施例1)，結(jié)果如圖4所示。采用ngs方法檢測的結(jié)果見表3。表3樣本ngsddpcrhcs-0318癌組織未檢出未檢出hcs-0318癌旁組織未檢出0.751％hcs-0345癌組織未檢出0.102％hcs-0345癌旁組織2.120％1.650％hcs-0444癌組織未檢出未檢出hcs-0444癌旁組織未檢出0.036％從微滴的一維圖可見(圖4)，陽性微滴和陰性微滴可較好的被分開，且癌組織總微滴數(shù)為14015，癌旁組織總微滴數(shù)為13110，已達(dá)到作為ddpcr分析的數(shù)量。癌旁組織陽性微滴數(shù)為47個，突變拷貝數(shù)為4.2copies/μl，突變頻率為0.751％；癌組織無陽性微滴，認(rèn)為并未檢測到突變。實施例4采用實施例1的提供的核酸組合在檢測樣本編號為hcs-0345的腫瘤組織(c)和癌旁組織(p)的mtdna的dnad-loop區(qū)94位點的突變情況。方法同實施例3。結(jié)果如圖5所示。從微滴的一維圖可見(圖5)，陽性微滴和陰性微滴可較好的被分開，且癌組織總微滴數(shù)為13945，癌旁組織微滴數(shù)為11519，已達(dá)到作為ddpcr分析的數(shù)量。癌旁組織陽性微滴數(shù)為25個，突變拷貝數(shù)為2.6copies/μl，突變頻率為1.650％；癌組織陽性微滴數(shù)為2個，突變拷貝數(shù)為0.17copies/μl，突變頻率為0.102％。實施例5采用實施例1的提供的核酸組合在檢測樣本編號為hcs-0444的腫瘤組織(c)和癌旁組織(p)的mtdna的dnad-loop區(qū)94位點的突變情況。方法同實施例3。結(jié)果如圖6所示。從微滴的一維圖可見(圖6)，陽性微滴和陰性微滴可較好的被分開，且癌組織總微滴數(shù)為13327，癌旁組織微滴數(shù)為13690，達(dá)到分析標(biāo)準(zhǔn)。癌旁組織陽性微滴數(shù)為3個，突變拷貝數(shù)為0.26copies/μl，突變頻率為0.036％；癌組織陽性微滴數(shù)為0，認(rèn)為并未檢測到突變。通過實施例3-5的檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明實施例1提供的核酸組合可以檢測出稀有拷貝數(shù)(突變頻率低至0.036％)的突變。實施例6本實施例提供了一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的試劑盒，其包括實施例1提供的核酸組合。需要說明的是，在其他的實施例中，該試劑盒還可包括：pcr反應(yīng)緩沖液、dntps、taq酶、mg2+、ddh2o中的一種或多種。本發(fā)明提供的試劑盒，可簡單、方便地對線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變位點進(jìn)行檢測，具有特異性好、靈敏度高等特點。綜上，本發(fā)明實施例提供的用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合利用ddpcr技術(shù)和mgb探針的原理，可針對線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變位點進(jìn)行檢測，其具有靈敏度高(達(dá)0.1％)、特異性好的特點，其可應(yīng)用于藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制以及制備用于疾病診斷、預(yù)測或療效評估的試劑盒等領(lǐng)域。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>河南大學(xué)<120>一種用于檢測線粒體dna的d-環(huán)區(qū)94g>a突變的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>34<212>dna<213>人工序列<400>1gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacg34<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gaacgtaggtgcgataaataataggatgaggc32<210>3<211>15<212>dna<213>人工序列<400>3ccagcgtctcgcaat15<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<400>4ccagcgtttcgcaat15<210>5<211>281<212>dna<213>人工序列<400>5gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacgggagctctccatgcatttggtatttt60cgtctggggggtgtgcacgcgatagcattgcgagacgctggagccggagcaccctatgtc120gcagtatctgtctttgattcctgcctcatcctattatttatcgcacctacgttcaatatt180acaggcgaacatatttactaaagtgtgttaattaattaatgcttgtaggacataataata240acaattgaatgtctgcacagccgctttccacacagacatca281當(dāng)前第1頁12