本發(fā)明通常涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地涉及探針組合物、基因捕獲芯片、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是一種由人體基因發(fā)生變異導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，這些基因變異會(huì)使細(xì)胞失去正常的調(diào)控功能，從而無限增殖，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。靶向藥物可以針對(duì)攜帶特定基因變異的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，療效顯著。但是，對(duì)于不同的患者，其體內(nèi)攜帶的基因變異也是千差萬別的，這種差異導(dǎo)致了每名患者對(duì)于相同的抗腫瘤藥物所表現(xiàn)出來的敏感性與毒副反應(yīng)不盡相同。而研究發(fā)現(xiàn)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與特定的一種(一組)基因的表達(dá)和/或多態(tài)性顯著相關(guān)；每種化療藥物均有其對(duì)應(yīng)的評(píng)估靶標(biāo)，靶標(biāo)在不同患者體內(nèi)的差異是導(dǎo)致化療藥物耐藥以及產(chǎn)生毒副作用的主要原因。精準(zhǔn)用藥類基因檢測(cè)產(chǎn)品越來越多的涌現(xiàn)于市場，且檢測(cè)方法聚焦在外顯子雜交捕獲技術(shù)及第二代高通量測(cè)序技術(shù)。我們發(fā)現(xiàn)目前精準(zhǔn)用藥類基因檢測(cè)產(chǎn)品存在兩個(gè)問題：第一，檢測(cè)方法集中在靶向用藥相關(guān)基因檢測(cè)，而化療用藥基因檢測(cè)很少涉及；第二，針對(duì)單癌種設(shè)計(jì)的靶向用藥基因檢測(cè)產(chǎn)品只著眼于fda/cfda批準(zhǔn)用于該癌種的藥物，給予一級(jí)用藥指導(dǎo)缺乏潛在可用藥物指導(dǎo)性意見，可供臨床醫(yī)生獲得的用藥選擇信息較少。臨床存在大量化療用藥基因檢測(cè)需求，且美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(nationalcomprehensivecancernetwork，nccn)在癌癥治療中也指出在進(jìn)行化療治療前需通過基因檢測(cè)預(yù)測(cè)評(píng)估化療療效。早在2008年nccn乳腺癌治療指南中建議，將21基因復(fù)發(fā)評(píng)分(rs)用于低危乳腺癌患者中選擇需要接受化療的患者。目前的化療用藥基因檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的分子病理檢測(cè)為主，而分子病理檢測(cè)存在單次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)基因的局限性。臨床化療組合方案中通常需同時(shí)進(jìn)行多個(gè)化療藥物的多個(gè)基因及位點(diǎn)檢測(cè)，此時(shí)分子病理檢測(cè)樣本需求量亦會(huì)增加，無法滿足全部用藥相關(guān)基因檢測(cè)，尤其是對(duì)于大量組織樣本采集困難的腫瘤患者(如肺癌患者)。目前靶向用藥基因檢測(cè)產(chǎn)品按照癌種界限設(shè)計(jì)存在臨床可用指導(dǎo)藥物信息缺乏的局限性。根據(jù)fda/cfda已批準(zhǔn)用于單向癌種的藥物及nccn指南推薦檢測(cè)的靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，只能提供給臨床醫(yī)生一級(jí)用藥指導(dǎo)信息，缺乏二級(jí)推薦使用藥物指導(dǎo)信息，無法獲得全面的治療指導(dǎo)方案。如司美替尼獲批用于iii期或iv期分化型甲狀腺癌(dtc)患者，一項(xiàng)前瞻性、隨機(jī)、兩期臨床試驗(yàn)表明，司美替尼聯(lián)合多烯紫杉醇對(duì)晚期kras突變的非小細(xì)胞肺癌患者治療有效。腫瘤患者的臨床常規(guī)用藥檢測(cè)目前仍然停留在“化療檢測(cè)－化療1—化療2－靶向檢測(cè)－靶向治療”層級(jí)遞進(jìn)的“檢測(cè)+治療”模式，持續(xù)時(shí)間長，無法快速得到最佳的治療方案，延誤了最佳治療期，且在不斷的治療方案替換過程中大大增加了治療費(fèi)用。因此，如何使用少量組織樣本經(jīng)過一次檢測(cè)即可得到靶向、化療用藥相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果是我們亟待解決的技術(shù)問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決至少部分上述技術(shù)問題，本發(fā)明人根據(jù)臨床常見的靶向藥物和化療藥物，以這些靶向、化療藥物對(duì)應(yīng)的基因及位點(diǎn)設(shè)計(jì)專用捕獲目標(biāo)基因的探針，并進(jìn)一步開發(fā)目標(biāo)基因的探針組合物。至少基于上述部分內(nèi)容完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。本發(fā)明的一方面，提供探針組合物，其包括至少38條探針，且含有特異性結(jié)合至目標(biāo)基因的探針，所述目標(biāo)基因由靶向用藥相關(guān)基因、化療用藥相關(guān)基因、預(yù)后相關(guān)基因和信號(hào)通路相關(guān)潛在用藥基因組成。在某些實(shí)施方案中，所述靶向用藥相關(guān)基因選自akt1、nras、braf、pdgfra、egfr、pik3ca、fgfr1、smo、fgfr2、tsc1、her2、hras、kit、kras和met；和/或所述化療用藥相關(guān)基因選自cda、ercc2、cyp19a1、gstp1、cyp2c19、mdr1、cyp2c8、mthfr、cyp2c9、nqo1、cyp2d6、rrm1、cyp3a4、tyms、dhfr、ugt1a1、dpyd、xrcc1和ercc1；和/或所述預(yù)后相關(guān)基因選自idh1和/或idh2；和/或所述信號(hào)通路相關(guān)潛在用藥基因選自notch1和/或smad4。在某些實(shí)施方案中，所述探針組合物以所述探針的混合物形式提供，或者以每種所述探針獨(dú)立存在的形式提供。在某些實(shí)施方案中，所述探針組合物選自序列如seqidno:1-73所示的核苷酸組成的組。本發(fā)明的另一方面，提供基因捕獲芯片，其包括固相載體和固定在所述固相載體上的探針的點(diǎn)陣，其中所述探針選自本發(fā)明所述的探針組合物。本發(fā)明的再一方面，提供基因捕獲試劑盒，其包括本發(fā)明的探針組合物。本發(fā)明的又一方面，提供基因捕獲方法，其包括：構(gòu)建樣本全基因組dna文庫；與根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的探針組合物雜交；洗脫非目標(biāo)基因的dna片段，獲得所述目標(biāo)基因的dna片段。在某些實(shí)施方案中，所述全基因組dna文庫中dna片段的大小為245-325bp。本發(fā)明的其他方面，提供非診斷性檢測(cè)方法，其包括使用本發(fā)明的探針組合物或本發(fā)明的基因捕獲芯片或本發(fā)明的基因捕獲試劑盒的步驟；或者以本發(fā)明的基因捕獲方法作為步驟。本發(fā)明包含了臨床常見靶向化療藥物對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因及位點(diǎn)，涵蓋了市場上常見的傳統(tǒng)分子病理檢測(cè)項(xiàng)目。利用本發(fā)明特異性結(jié)合至目標(biāo)基因的探針組合物，用少量的樣本，通過高通量測(cè)序平臺(tái)實(shí)現(xiàn)高深度測(cè)序，可以一次性平行檢測(cè)多個(gè)化療藥物基因多態(tài)性及靶向用藥相關(guān)基因變異形式，例如點(diǎn)突變、插入/缺失或dna拷貝數(shù)改變。為臨床醫(yī)生提供真正意義上的“有選擇”，一次檢測(cè)即可獲得更適用的治療方案且更大程度上為患者節(jié)省了治療費(fèi)用。附圖說明圖1是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中的操作流程圖；圖2是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖3是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖4是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖5是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖6是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖7是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖8是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖9是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖10是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖11是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖12是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例中序列的測(cè)序深度分布圖；圖13是本發(fā)明的實(shí)施例中目標(biāo)區(qū)域序列占比均值的柱狀分布圖。具體實(shí)施方式現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對(duì)于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為具體公開了該范圍的上限和下限值以及它們之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻(xiàn)通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時(shí)，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。本發(fā)明中，名詞術(shù)語既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少一種”不僅僅指包含“一個(gè)”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個(gè)”或“多種”的情況。本發(fā)明中，術(shù)語“探針組合物”(本文有時(shí)簡稱“組合物”)是指多探針的組合形式，包括多探針的混合物，或者多探針中每種探針以單獨(dú)獨(dú)立的形式存在。在某些實(shí)施方案中，混合物包括但不限于多探針的溶液混合物，或多探針的粉末混合物。其中溶液的實(shí)例包括水溶液或有機(jī)物溶液(例如乙醇)或兩者的組合。粉末混合物包括兩種探針的固體混合/混勻物。在某些實(shí)施方案中，探針組合物以單獨(dú)獨(dú)立的形式存在。例如每種探針固定/結(jié)合于例如基材的特定區(qū)域(例如)，所述各特定區(qū)域規(guī)則地匯集于所述基材上從而構(gòu)成陣列。在某些實(shí)施方案中，探針組合物中每種探針以單獨(dú)存在于特定的容器(例如，小瓶)中的形式存在。在某些實(shí)施方案中，在組合物中至少包括針對(duì)每個(gè)目標(biāo)基因的一條探針。組合物包括特異性結(jié)合至靶向治療基因靶點(diǎn)、化療治療基因靶點(diǎn)、預(yù)后基因靶點(diǎn)和信號(hào)通路基因靶點(diǎn)的探針。優(yōu)選地，在組合物中在至少包括針對(duì)每個(gè)目標(biāo)基因的一條探針的基礎(chǔ)上，在組合物中針對(duì)某個(gè)目標(biāo)基因或某些目標(biāo)基因存在多條探針，例如針對(duì)akt1基因，存在一條探針，針對(duì)braf基因，存在19個(gè)與其特異性結(jié)合的探針，針對(duì)cyp2c19基因，存在2條探針。本發(fā)明中，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指探針與針對(duì)其他序列相比，以比能夠檢測(cè)更大的程度(例如背景測(cè)定值的平均+背景測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)誤差×2以上的測(cè)定值)與其目標(biāo)序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，根據(jù)進(jìn)行雜交的環(huán)境不同而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出對(duì)探針為100％互補(bǔ)性的目標(biāo)序列。在某些實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件是指5×ssc，50％甲酰胺和42℃下的核酸雜交條件。在某些實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件是指高嚴(yán)格條件，即對(duì)于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5×ssc、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和50％甲酷按中預(yù)雜交和雜交12至24/小時(shí)。材料最終使用0.2×ssc、0.2％sds，在65℃下洗滌三次，每次15分鐘。本發(fā)明中，術(shù)語“包括”是指探針組合物包括特異性結(jié)合至上述目標(biāo)基因的探針，還指探針組合物由特異性結(jié)合至上述目標(biāo)基因的探針組合。本發(fā)明中，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指在嚴(yán)格條件下探針與目標(biāo)基因而不與其他核苷酸序列雜交或者互補(bǔ)結(jié)合；每個(gè)探針與其相對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因或者目標(biāo)基因的靶向區(qū)域通過核苷酸序列互補(bǔ)的方式結(jié)合。本發(fā)明中，靶向用藥和/或化療用藥是指fda/cfda已批準(zhǔn)用于單向癌種的藥物。靶向用藥的實(shí)例包括，但不限于曲妥珠單抗、西妥昔單抗、帕妥珠單抗、帕尼單抗、吉非替尼、克唑替尼、阿法替尼、卡博替尼、威羅非尼等；化療藥物的實(shí)例包括，但不限于鉑類、蒽環(huán)類、氟尿嘧啶、依托泊苷、長春堿類、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、培美曲塞、來曲唑等。本發(fā)明中，與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的探針，其中所述目標(biāo)基因具體是指與靶向用藥和化療用藥相關(guān)的基因，具體地，是指與靶向用藥和化療用藥相關(guān)的基因靶點(diǎn)，其中，靶向用藥相關(guān)的基因的靶點(diǎn)存在點(diǎn)突變(含缺失和插入變異)、拷貝數(shù)變等類型，化療用藥相關(guān)的基因靶點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性、dna片段長度多態(tài)性和dna重復(fù)序列多態(tài)性。在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)基因如下表所示。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的目標(biāo)基因和相關(guān)的靶點(diǎn)信息如下表所示：表1基因及相關(guān)靶點(diǎn)信息本發(fā)明所述的探針組合物為特異性結(jié)合至至少38個(gè)目標(biāo)基因的探針的組合，其與全基因組dna雜交，捕獲與探針特異性結(jié)合的dna片段，即38個(gè)目標(biāo)基因的dna片段。在使用少量的樣本得到多個(gè)基因片段，對(duì)于多個(gè)基因片段進(jìn)行檢測(cè)，基于目標(biāo)基因區(qū)域捕獲的dna二代測(cè)序法對(duì)靶向化療用藥相關(guān)基因設(shè)計(jì)專用捕獲探針，通過高通量測(cè)序平臺(tái)實(shí)現(xiàn)高深度測(cè)序，可以一次性平行檢測(cè)化療藥物基因多態(tài)性及靶向用藥相關(guān)基因中包括點(diǎn)突變，插入/缺失，dna拷貝數(shù)改變等多種變異形式，從而一次性檢出所有與靶向化療治療相關(guān)的靶點(diǎn)基因變異。因此為臨床醫(yī)生提供真正意義上的“有選擇”，一次檢測(cè)即可獲得更適用的治療方案且更大程度上為患者節(jié)省了治療費(fèi)用。實(shí)施例在沒有特別說明的情況下，本發(fā)明中使用的任何試劑均為市場購買的一般試劑。血液樣本來自協(xié)和醫(yī)院收集的樣本。1.構(gòu)建全基因組dna文庫2.利用探針組合物捕獲全基因組dna文庫中的目標(biāo)基因；2.1混合blockingoligos、cot-1及上述已經(jīng)混合均勻的dna文庫，體系見下表2：表22.2、將上述混合液震蕩混勻并打開ep管蓋，于60℃真空濃縮儀中濃縮蒸發(fā)至干粉狀態(tài)。真空濃縮儀設(shè)置為60℃，15min。15min后查看混合物蒸干狀態(tài)，若尚有未蒸干液體，繼續(xù)進(jìn)行60℃，15min蒸干，避免過分干燥。注：已蒸干成干粉狀態(tài)的ep管可在室溫過夜保存，注意封閉管蓋，以防粉末飛出。2.3捕獲試劑所需試劑準(zhǔn)備a將所需試劑(按下表)從冷凍冰箱中找出室溫解凍。b向上述已經(jīng)蒸干的ep管中依次加入以下表3試劑：表3xgen2×hybridizationbuffer(藍(lán)蓋)8.5ulxgenhybridizationbufferenhancer(棕褐色)1.7ulnuclease-freewater1.8ul共計(jì)13ul室溫孵育10min；c充分震蕩混勻上述ep管中的液體，并轉(zhuǎn)移至0.2mlpcr管中，并在proflexpcr儀中block1上設(shè)置并運(yùn)行以下程序：“95℃，forever”。將pcr管置于block1中計(jì)時(shí)10min。(期間準(zhǔn)備好捕獲探針)d、c中10min過程未進(jìn)行完畢時(shí)，proflexpcr儀block2設(shè)置并運(yùn)行以下表4程序。c中過程計(jì)時(shí)結(jié)束，取下block1上pcr管并立即加入4ul探針組合物。充分混勻并離心，立即置于block2中：計(jì)時(shí)4h。表4程序pcr儀熱蓋狀態(tài)65℃，foreverpcr儀熱蓋75℃閉蓋2.4非特異片段洗脫與磁珠準(zhǔn)備(雜交反應(yīng)結(jié)束前1.5h開始準(zhǔn)備試劑)：a從冰箱(冷凍)取出下表中的洗脫液解凍，并從4℃取出m270磁珠，充分震蕩混勻；b按照表5配置1×洗脫工作液(洗脫液需現(xiàn)用現(xiàn)配，可雜交反應(yīng)結(jié)束前2h前進(jìn)行洗脫液準(zhǔn)備)；注：若xgen10×washbuffer1在解凍后出現(xiàn)絮狀沉淀，可用65℃金屬浴加熱至絮狀沉淀消失。表5濃縮洗脫buffer濃縮buffer(ul)無核酸酶的水(ul)xgen2×beadwashbuffer250250xgen10×washbuffer130270xgen10×washbuffer220180xgen10×washbuffer320180xgen10×stringentwashbuffer40360c對(duì)于已經(jīng)配置好的1×washbuffer1和stringentwashbuffer工作液，需按下表創(chuàng)建不同溫度的工作液(即stringentwashbuffer工作液要65攝氏度金屬浴預(yù)熱0.5h，washbuffer1工作液分為65℃預(yù)熱0.5h的工作液和常溫工作液)。表6為1次捕獲用量，請(qǐng)根據(jù)捕獲次數(shù)適量配備。表6d再次充分震蕩m270磁珠，并向1.5mlep管中加入100ulm270磁珠。并將ep管置于磁力架上。e2-5min后，待磁珠吸附到磁力架上，棄上清。并加入200ul1×beadwashbuffer，從磁力加上取下ep管，震蕩混勻10s，再次將ep管置于磁力架上。f重復(fù)e一次(用200ul1×beadwashbuffer再次洗滌dynabeadsm270鏈霉親和素磁珠)。g2-5min后，待磁珠吸附到磁力架上，棄上清。加入100ul1×beadwashbuffer，渦旋混勻，并轉(zhuǎn)移至0.2mlpcr管中。h雜交完畢前5min將0.2mlpcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，棄上清。2.5m270磁珠吸附雜交目的片段：a雜交完成前1min，將h中準(zhǔn)備好的m270磁珠置于block2中65℃孵育。b雜交完畢，從block2中取出雜交反應(yīng)液并迅速轉(zhuǎn)移至已預(yù)熱的m270磁珠中，震蕩混勻。c將b中的pcr管再次置于proflexpcr儀block2中，計(jì)時(shí)45min。d65℃孵育過程中，每8min震蕩混勻一次，確保m270磁珠處于重懸狀態(tài)。2.6洗滌m270磁珠，洗脫非雜交片段(使用1×洗滌buffer)：a65℃洗滌(快速操作，保證溫度接近于65℃)：將3.3中孵育完畢的pcr管中液體立即轉(zhuǎn)移至金屬浴預(yù)熱的1×washbuffer1中，渦旋混勻，簡單離心，置于磁力架上，待溶液澄清后，棄上清。b65℃洗滌(快速操作，保證溫度接近于65℃)：向其中加入200ul預(yù)熱的stringentwashbuffer工作液，渦旋混勻，簡單離心并65℃孵育5min，置于磁力架上，待溶液澄清后，棄上清。c重復(fù)b一次。d室溫洗滌：向c中的beads中加入200ul室溫的1×washbuffer1，渦旋混勻，簡單離心，置于磁力架上，待溶液澄清后，棄上清。e室溫洗滌：向上述beads中加入200ul1×washbuffer2，渦旋混勻，簡單離心，置于磁力架上，待溶液澄清后，棄上清。f室溫洗滌：向上述beads中加入200ul1×washbuffer3，渦旋混勻，簡單離心，置于磁力架上，待溶液澄清后，棄上清。g重懸beads：從磁力架上取下含beads的ep管，加入21.5ul無核酸酶的水。渦旋震蕩混勻，加入到以下pcr反應(yīng)液中(帶磁珠進(jìn)行pcr反應(yīng)).3.捕獲后pcr3.1捕獲后pcr反應(yīng)液配置，如表7表72×kapahifihotstartreadymix25ul10umilluminap5primer(illuminaprimera)1.25ul10umilluminap7primer(illuminaprimerb)1.25ul上述g中帶磁珠的產(chǎn)物21.5ul共計(jì)50ul3.2震蕩混勻后，進(jìn)行如下程序pcr(proflexpcr儀)，具體程序如表8所示。表83.3捕獲后pcr產(chǎn)物純化：a向新的ep管中加入已在室溫平衡0.5h的45ulxpbeads。b將pcr產(chǎn)物從pcr儀中取出混合均勻后加入到含45ulxpbeads的ep管中(0.9×)，震蕩混合均勻，室溫孵育5min。c孵育完將混合產(chǎn)物置于磁力架上，待上清與磁珠完全分離開，棄上清。d向管內(nèi)加入200ul新鮮配置的80％的乙醇洗滌磁珠1min，棄上清(乙醇)。e重復(fù)步驟d一次。e室溫或37℃干燥磁珠。f待磁珠干燥后加入23ul水，震蕩混勻vortex，室溫靜置5min。g置于磁力架上，待磁珠與上清完全分離，吸取上清22ul于一新的ep管中，標(biāo)明樣本名稱、文庫類型、建庫日期、index/barcode等信息。4.驗(yàn)證對(duì)本發(fā)明所述的探針組合物和芯片所對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行序列深度和目標(biāo)區(qū)域序列占比檢驗(yàn)，分別對(duì)本發(fā)明所述的探針組合物或芯片與樣本1至樣本11中的目標(biāo)基因特異性結(jié)合，然后對(duì)目標(biāo)基因?qū)?yīng)序列進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行測(cè)序深度分布檢測(cè)，結(jié)果如圖2至圖12所示，樣本1的序列深度約為1000x，樣本2的序列深度約為200x，樣本3的序列深度約為600x，樣本4的序列深度約為400-700x，樣本5的序列深度約為500x，樣本6的序列深度約為400x，樣本7的序列深度約為300x，樣本8的序列深度約為600x，樣本9的序列深度約為400x，樣本10的序列深度約為800x，樣本11的序列深度約為500x，說明本發(fā)明所述的探針組合物和芯片所對(duì)應(yīng)的序列覆蓋均一。同時(shí)，對(duì)測(cè)序結(jié)果的目標(biāo)區(qū)域序列占比檢測(cè)，結(jié)果如圖12所示，從樣品1至樣品11中的目標(biāo)區(qū)域序列占比均為至40％，證明本發(fā)明所述的探針組合物和芯片序列對(duì)目標(biāo)基因序列的捕獲效率高。在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對(duì)本發(fā)明說明書的具體實(shí)施方式做多種改進(jìn)和變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。由本發(fā)明的說明書得到的其他實(shí)施方式對(duì)技術(shù)人員而言是顯而易見得的。本申請(qǐng)說明書和實(shí)施例僅是示例性的。sequencelisting<110>元碼基因科技（北京）有限公司<120>探針組合物、基因捕獲芯片、試劑盒及其應(yīng)用<130>1700351cn<160>73<170>patentinversion3.3<210>1<211>120<212>dna<213>人工合成<400>1cgcttgctcccaatcacaggagaaggaggaggtggaggaggagggctgcttgaggaagta60taagaatgaagttgtgaagctgagattcccctccattgggaccggagaaaccaggggagc120<210>2<211>120<212>dna<213>人工合成<400>2cccacagtacccctgccctctgagactgatggctacgttgcccccctgacctgcagcccc60cagcctggtatggagtccagtctaagcagagagactgatgggcaggggaggtgggacctt120<210>3<211>120<212>dna<213>人工合成<400>3ggcacgccgcggcgccggggcctccgcagggcgatggagcccggtctgcaaggaaagtga60ggcgccgccgctgcgttctggaggaggggggcacaaggtctggagaccccgggtggcgga120<210>4<211>119<212>dna<213>人工合成<400>4cacaaggtctggagaccccgggtggcggacgggagccctccccccgccccgcctccgggg60caccagctccggctccattgttcccgcccgggctggaggcgccgagcaccgagcgccgc119<210>5<211>120<212>dna<213>人工合成<400>5ggaggcgatagtggatagtagaagagagcacacattgcctcactgaagtggctgcacgta60tctgagtcctgtagctactgttttatctctgtttcttaaaagtatgcttttaaaaagatt120<210>6<211>120<212>dna<213>人工合成<400>6aataaaacgtctctcttcccttctttcaggaatacttggacctcagccaacctctcgaac60agtattcacctagttaccctgacacaagaagttcttgttcttcaggagatgattctgttt120<210>7<211>120<212>dna<213>人工合成<400>7agggacctgccagcgacatgtctttccccacaatcatactgctgacatacagtcggaggt60tcactgcatattctccccacagatagaagagcccagccagtgtcctgactgtgtggtgag120<210>8<211>120<212>dna<213>人工合成<400>8caatccaaatattgccgtttcataaatgtaataagtaatactaattcacagagtattgta60aatggtggatgacaaaagaaaatctgctctgtggaaagaaagaactgtctctaccagggt120<210>9<211>120<212>dna<213>人工合成<400>9tgtgaccattccggtttggttctcccgagaggtaaagaacgaagacttcaaagacacttt60cttcactggtcagctcctccccccacatcttcagcagctcctccttgggggacttgctct120<210>10<211>120<212>dna<213>人工合成<400>10ccttcacaaagcggaagaatgtgtcagcctcaaagaaaagctgcgtgatgatgaaatcgg60ctcccgcagacaccttctccttcaagtgcttcaggtcagcctcaaagctccctgcttcgg120<210>11<211>120<212>dna<213>人工合成<400>11cctgcaccctgaagcctgagtgtgtccagcagctgctggtttgctcccaggaggccaaga60agtcagcctactgcccctacagtcactttcctgtgggggctgccctgctcacccaggagg120<210>12<211>120<212>dna<213>人工合成<400>12ggtagccagaatcattacaggtcatgtagcatttaccacagttgatacacatttcttcat60caatcatagccacaacttgctctacgttgctcaattcaccaaatgttccaaggtactgca120<210>13<211>120<212>dna<213>人工合成<400>13taaataaacattcaccaacttatgccaattctcttgttttagatgttaaatcacacttac60gttgtctggaaagtcagcctttagttcagtgacactttgacaccaatatgcagccgtttt120<210>14<211>120<212>dna<213>人工合成<400>14cacagaggaagccttcgcctgtcctcatgtattggtctctcatggcactgtactcttctt60gtccagctgtatccagtatgtccaacaaacaggtttcaccatctataaccacttgttttc120<210>15<211>120<212>dna<213>人工合成<400>15atattcatctacaaagtggttctggattagctggattgtcagtgcgcttttcccaacacc60acctgctccaaccaccaccagtttgtactcagtcatttcacaccagcaagaacctgttgg120<210>16<211>120<212>dna<213>人工合成<400>16caatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctgg60atccaggtaaggccaagttttttgcttcctgagaaaccacttacagtctttttttctggg120<210>17<211>120<212>dna<213>人工合成<400>17ggcgtttctccctcatgacgctgcggaattttgggatggggaagaggagcattgaggacc60gtgttcaagaggaagcccgctgccttgtggaggagttgagaaaaaccaagggtgggtgac120<210>18<211>120<212>dna<213>人工合成<400>18ggcgtttctccctcatgacgctgcggaattttgggatggggaagaggagcattgaggacc60gtgttcaagaggaagcccgctgccttgtggaggagttgagaaaaaccaagggtgggtgac120<210>19<211>120<212>dna<213>人工合成<400>19tgcaagacaggagccacatgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagataca60ttgaccttctccccaccagcctgccccatgcagtgacctgtgacattaaattcagaaact120<210>20<211>120<212>dna<213>人工合成<400>20tttttctcaactcctccacaaggcagtgagcttcctcttgaacacggtcctcaatgctcc60tcttccccatcccaaaattccgcaaggttgtgagggagaaacgccggatctccttccatc120<210>21<211>120<212>dna<213>人工合成<400>21cacacaggaagccctccccggtgcgcatgtactggtcccgcatggcgctgtactcctcct60ggccggcggtatccaggatgtccaacaggcacgtctccccatcaatgaccacctgcttcc120<210>22<211>120<212>dna<213>人工合成<400>22gtattcgtccacaaaatggttctggatcagctggatggtcagcgcactcttgcccacacc60gccggcgcccaccaccaccagcttatattccgtcatcgctcctcaggggcctgcggcccg120<210>23<211>119<212>dna<213>人工合成<400>23ctaataattgtctttactttccttgtagggtttgaagactgggatgtattatttaaggac60aagaccagcggctaatccaatccagttcactctaaataaggagaagctaaaagataaag119<210>24<211>120<212>dna<213>人工合成<400>24aggaggcagccctggtggacatggtgaatgacggcgtggaggacctccgctgcaaataca60tctccctcatctacaccaactatgtgagcatctgcaccagggttgggcactgggggctga120<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