本發(fā)明涉及谷子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及與谷子脖長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測引物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國是谷子的原產(chǎn)地和世界上栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家，產(chǎn)量約占全世界總量的80％。同時，我國也是谷子遺傳資源數(shù)量最多、多樣性最豐富的國家。多項研究表明，作物的穗莖長與植株抗旱性、穗花數(shù)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。因此，谷子脖長等指標(biāo)是影響谷子抗性和產(chǎn)量的重要因子，研究與控制谷子脖長等產(chǎn)量性狀相關(guān)的基因位置及其功能等，對于指導(dǎo)谷子遺傳育種具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是基因組水平上由單個核苷酸堿基的變異引起的dna序列多態(tài)性，其在基因組中數(shù)量多，分布廣泛，遺傳穩(wěn)定性好。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，對不同個體同一基因或基因片段進(jìn)行直接測序和序列比較，可以確定堿基是否存在變異。因此，snp檢測有利于基因分型，適用于快速和規(guī)?；Y查未知或已知snp與某遺傳性狀的關(guān)系。目前關(guān)于谷子數(shù)量性狀相關(guān)的qtl(quantitativetraitlocus)定位和snp標(biāo)記研究主要集中于ssr標(biāo)記的開發(fā)利用等途經(jīng)，而利用群體自交系基因組測序檢測單核苷酸多態(tài)性(snp)分子標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用研究尚未有報道。因此，開展谷子數(shù)量性狀snp分子標(biāo)記的開發(fā)，并建立輔助選育體系，對于提高谷子產(chǎn)量，節(jié)約育種成本具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種與谷子脖長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測引物和應(yīng)用，可以預(yù)測谷子脖長，為實現(xiàn)谷子脖長性狀的早期鑒定和篩選育種提供分子輔助技術(shù)支持。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種與谷子脖長性狀相關(guān)的snp標(biāo)記，該snp標(biāo)記是nl-hai-05-092，其位于谷子第5號染色體42014092bp位置，堿基為c/t。進(jìn)一步地，上述nl-hai-05-092位點所在的序列如seqidno：3所示，上述nl-hai-05-092位點是seqidno：3所示序列自5’端起第275位堿基。進(jìn)一步地，對上述snp標(biāo)記，利用復(fù)合區(qū)間作圖法，采用5％的總體顯著水平，qtl檢測的lod值為9.1589，表型變異解釋率為8.15％。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測如第一方面的snp標(biāo)記的引物對，包括：上游引物28_1f：5’-atgccgcatcacatcctaa-3’(seqidno：1)和下游引物28_1r：5’-ccattgacctgttgcctct-3’(seqidno：2)。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種用于檢測如第一方面的snp標(biāo)記的試劑盒，包括如第二方面的引物對，以及任選的用于pcr擴(kuò)增的試劑成分，這些試劑成分可以包括pcr緩沖液、dntps、dna聚合酶等。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種檢測如第一方面的snp標(biāo)記的方法，采用如第二方面的引物對，對待檢測的谷子基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并通過測序擴(kuò)增產(chǎn)物來分析nl-hai-05-092位點的堿基情況。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供如第二方面的引物對在檢測如第一方面的snp標(biāo)記中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供一種谷子脖長預(yù)測方法，采用如第二方面的引物對，對谷子基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并通過測序擴(kuò)增產(chǎn)物來分析nl-hai-05-092位點的堿基情況，進(jìn)而預(yù)測谷子脖長。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供如第一方面的snp標(biāo)記在谷子脖長預(yù)測、或谷子脖長性狀的早期鑒定、或谷子分子輔助育種中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提供如第二方面的引物對在谷子脖長預(yù)測、或谷子脖長性狀的早期鑒定、或谷子分子輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的與谷子脖長性狀相關(guān)的snp標(biāo)記可以用于谷子脖長性狀的分子標(biāo)記輔助育種，通過該snp標(biāo)記可以預(yù)測谷子脖長，為實現(xiàn)谷子脖長性狀的早期鑒定和篩選育種提供分子輔助技術(shù)支持，對于加快谷子品種的遺傳選育和改良進(jìn)程具有重要的理論和實踐指導(dǎo)意義。本發(fā)明的特異性引物可以對谷子脖長進(jìn)行良好分型，檢測snp表達(dá)的差異。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例中谷子父母本基因組dna電泳膠圖，其中m泳道表示dl2000marker；1泳道表示張谷三號父本基因組dna；2泳道表示a2基因組dna。圖2為本發(fā)明實施例中谷子父母本基因組pcr產(chǎn)物電泳膠圖，其中a28-1表示以a2dna為模板、28-1為引物的pcr產(chǎn)物，328-1表示以張谷三號父本dna為模板、28-1為引物的pcr產(chǎn)物，m表示dnamarker的片段大小，從下至上依次為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。圖3為本發(fā)明實施例中母本和父本snp標(biāo)記nl-hai-05-092所在的序列的比對結(jié)果圖，snp標(biāo)記nl-hai-05-092位于第5號染色體，第42014092bp位置，母本堿基為c，父本堿基為t。具體實施方式下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明實施例提供與谷子脖長性狀相關(guān)分子標(biāo)記、引物及其應(yīng)用。本發(fā)明實施例的谷子脖長緊密連鎖分子標(biāo)記nl-hai-05-092，位于谷子第5號染色體42014092bp位置(參考基因組——yugu基因組上的堿基編號)。值得說明的是，本發(fā)明中bin是指bin作圖(binmap)中，利用作圖群體中全部的重組位點信息，獲得構(gòu)成重組事件的最小單位(recombinationbin)。利用得到的bin作為標(biāo)記用于后續(xù)的連鎖圖譜構(gòu)建和qtl定位。在本發(fā)明實施例中，遺傳圖譜(geneticmap或linkagemap)是指以遺傳標(biāo)記間重組率為基礎(chǔ)構(gòu)建的標(biāo)記之間相對位置的線性排列圖?；诟咄恐販y序技術(shù)通過對作圖群體親本和子代群體進(jìn)行測序，將一定數(shù)量的連續(xù)snp作為判斷子代重組位點的依據(jù)，得到每個子代的全基因組物理重組圖譜。利用作圖群體中全部的重組位點信息，獲得構(gòu)成重組事件的最小單位(recombinationbin)和bin圖(binmap)，并利用得到的bin作為標(biāo)記用于后續(xù)的連鎖圖譜構(gòu)建和qtl定位。本發(fā)明實施例提供谷子父本“張谷三號”和母本“a2”材料(用谷子不育系1066a與谷子光溫敏不育系821雜交后，經(jīng)多代選育而成)、二者雜交的f1代材料及自交13代的f2群體441份材料。將各份材料在海南三亞種植，并記錄和整理脖長等性狀數(shù)據(jù)。將各份材料進(jìn)行簡并基因組重測序后，比對參考基因組拼接完成，獲得snp標(biāo)記。通過分析脖長性狀數(shù)據(jù)，獲得與之相關(guān)的snp標(biāo)記，并通過克隆測序驗證該snp標(biāo)記。以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果，應(yīng)當(dāng)理解，實施例僅是示例性的，用于說明本發(fā)明的可行性以及得到的結(jié)果，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實施例1：高通量測序和snp標(biāo)記信息分析本實施例利用谷子父本“張谷三號”和母本“a2”材料、二者雜交獲得的f1代材料及f1代自交13代后得到的f2群體441份材料，即重組自交系(recombinantinbredlines，rils)。將各份材料在海南三亞種植，并記錄和整理脖長等性狀數(shù)據(jù)。將各份材料進(jìn)行簡并基因組重測序后，比對參考基因組拼接完成，獲得snp標(biāo)記。通過分析脖長性狀數(shù)據(jù)，獲得與之相關(guān)的snp標(biāo)記，并通過克隆測序驗證該snp標(biāo)記。本實施例利用radseq方法，提取每個樣本個體(其中441個rils、2個親本、1個f1個體)的基因組dna并進(jìn)行dna質(zhì)量檢測，對合格的dna進(jìn)行酶切，電泳回收dna片段，并加上接頭進(jìn)行簇(cluster)制備，最后上機(jī)測序。本實施例的具體步驟如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成勻漿轉(zhuǎn)入15ml的離心管中，然后往研缽中加入1ml1.5×ctab沖洗，再轉(zhuǎn)入離心管中，混勻后于65℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×ctab配方(1l)如下表1：表1成分用量ctab15g1mol/ltris.cl(ph為8.0)75ml0.5mol/ledta30mlnacl61.4g加去離子水定容至1l，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)樯罹G色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混合靜止5min；于-20℃放置30min沉淀dna。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1ml75％乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管干燥dna，加入50μlte溶解dna。(5)檢測dna的濃度，并用水調(diào)整為20ng/μl。(6)采用psti酶進(jìn)行酶切，打斷基因組dna，反應(yīng)體系如下表2：表2(7)進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下表3：表3(8)每個樣品各取1μl反應(yīng)產(chǎn)物，加入一個新的離心管中，總體積12μl。每12個樣品一組。(9)用3％回收膠電泳1h，eb染色后切取300-700bp大小片段。用qiaquickkit進(jìn)行膠純化回收，回收產(chǎn)物溶于30μleb溶液。(10)進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)體系如下表4：表4試劑用量無菌水1μl10×緩沖液(含mg2+)2.5μldntps(25mm)0.25μl高保真酶(5u/μl)0.25μl正向引物(10μmol/l)0.5μl反向引物(10μmol/l)0.5μl模板dna20μl總體積25μlpcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行10個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。(11)磁珠純化，完成建庫。具體純化方法為：首先，pcr后加入1.2倍體積磁珠，靜置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500μl70％乙醇洗滌兩次。干熱儀上蒸干后，加入15μleb溶液溶解5min。最后，磁力架上吸附，轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管中。(12)檢測達(dá)到上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)后上機(jī)測序。結(jié)果：對444個樣本(其中441個rils、2個親本、1個f1個體)進(jìn)行酶切建庫測序，得到75.99gb原始數(shù)據(jù)，平均每個個體171.54mb。將測序序列比對到參考基因組(即yugu基因組，可以從下列網(wǎng)址獲取yugu基因組的序列：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝setaria+italica+(foxtail+millet))上，平均比對率86.326％，平均覆蓋率8.226％，平均測序深度3.655x。通過測序和信息分析，獲得親本間有多態(tài)性的33771個snp標(biāo)記。根據(jù)窗口滑動的方法，選取若干個snp為一個窗口，每次滑動一個snp確定每個窗口的基因型以及每個個體的交換位點，生成bin基因型。根據(jù)bin基因型數(shù)據(jù)，用mstmap軟件構(gòu)建遺傳圖譜，2022個bin定位到9條染色體上，再將遺傳圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到mapchart軟件，整合一張基因組遺傳連鎖圖譜。利用所構(gòu)建的谷子高密度遺傳圖譜，采用復(fù)合區(qū)間作圖分析(cim)，對谷子脖長性狀表型進(jìn)行qtl分析。qtl檢測采用5％的總體顯著水平，根據(jù)500次排列檢驗結(jié)果，確定脖長性狀表型數(shù)據(jù)qtl分析的臨界lod值，分析得到與脖長相關(guān)的預(yù)測bin標(biāo)記和snp位點信息。結(jié)果顯示，與谷子脖長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記nl-hai-05-092位于遺傳連鎖圖譜第5號染色體的184.27厘摩(cm)，第228個bin至第229個bin(chr5_bin228-chr5_bin229)，利用復(fù)合區(qū)間作圖法，采用5％的總體顯著水平，qtl檢測的lod值為9.1589，表型變異解釋率為8.15％，加性效應(yīng)值(additiveeffect，a)為-1.6687。實施例2：snp標(biāo)記驗證根據(jù)預(yù)測的bin標(biāo)記和snp位點，比對參考基因組，得到相關(guān)區(qū)域基因序列，選取snp位點前后300bp左右，設(shè)計開發(fā)snp標(biāo)記引物，以父本和母本材料dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。選擇引物擴(kuò)增正常、pcr產(chǎn)物符合預(yù)測大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，回收產(chǎn)物并進(jìn)行測序，選擇父本和母本材料擴(kuò)增基因序列有snp位點差異的標(biāo)記引物。預(yù)測的bin標(biāo)記中包含多個snp位點，根據(jù)pcr結(jié)果對這些位點進(jìn)行篩選。首先，根據(jù)pcr產(chǎn)物回收后的測序結(jié)果，選擇父本和母本材料擴(kuò)增基因序列有snp位點差異的標(biāo)記。具體步驟如下：(1)按照實施例1中步驟(1)至(4)，用ctab法分別提取父母本基因組dna。(2)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組dna，谷子父母本基因組dna電泳膠圖如圖1所示。(3)將得到的父母本基因組dna存于-20℃?zhèn)溆谩?4)分別以提取的父本和母本的基因組dna為模板，利用28_1f：5’-atgccgcatcacatcctaa-3’(seqidno：1)和28_1r：5’-ccattgacctgttgcctct-3’(seqidno：2)擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系如下表5：表5試劑用量無菌水20.2μl10×緩沖液(含mg2+)2.5μldntps(25mm)0.15μltaq酶(5u/μl)0.15μl正向引物(10μmol/l)0.5μl反向引物(10μmol/l)0.5μl模板1.0μl總體積25μlpcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后于4℃保存。各pcr擴(kuò)增產(chǎn)物取部分進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。通過對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物測序可知，引物28_1f和28_1r擴(kuò)增得到的母本擴(kuò)增產(chǎn)物的測序序列如序列表中seqidno：3所示，nl-hai-05-092位點是seqidno：3所示序列自5’端起第275位堿基。母本擴(kuò)增產(chǎn)物和父本擴(kuò)增產(chǎn)物的測序序列比對結(jié)果如圖3所示，其中標(biāo)灰的堿基表示nl-hai-05-092位點的堿基。然后，根據(jù)樣品脖長數(shù)據(jù)篩選：父本脖長為36cm，母本脖長為16cm，441份樣品中，最小值8cm，最大值40cm，脖長長度最短的50個樣品中，與母本snp相同的樣品數(shù)多于80％，脖長長度最長的50個樣品中，與父本snp相同的樣品數(shù)多于80％。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>與谷子脖長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測引物和應(yīng)用<130>16i23503<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>用于檢測nl-hai-05-092的上游引物<400>1atgccgcatcacatcctaa19<210>2<211>19<212>dna<213>用于檢測nl-hai-05-092的下游引物<400>2ccattgacctgttgcctct19<210>3<211>294<212>dna<213>nl-hai-05-092位點所在的序列<220><221>snp位點<222>(275)..(275)<223>n是c或t<400>3cctaacgtatggaaggcgtgttaaaaaaaaaatcctgatctttcatcctctctatttgca60aactatgaaaagtatccattttgaaattaaattttgtgattgacatgtaacctggttggc120actccatatttttttgtgaaaccataaattatcattgtcactcaaccgatttgttgatta180ctaaaataagcggttactccctactaaccctaaggtggtggcccatcacccaagagtcac240ttattataggaaactttgattgaaccgtgacttgnaaaggcaacaggtcaatgg294當(dāng)前第1頁12