本發(fā)明屬于微生物學(xué)檢測(cè)方面的質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及一種乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法。
背景技術(shù)：
乳粉微生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域非常特殊。目前，國(guó)內(nèi)外尚未有機(jī)構(gòu)制備乳粉微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品和大規(guī)模生產(chǎn)的先例，仍屬空白領(lǐng)域。目前雖有一些機(jī)構(gòu)制備微生物類的標(biāo)準(zhǔn)樣品，但標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性幾乎不能滿足要求，運(yùn)輸極為困難；或標(biāo)準(zhǔn)樣品為僅含有目標(biāo)菌的純菌株，與實(shí)際樣品差距較大，不能滿足日常實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制等需要。
菌落總數(shù)就是指在一定條件下(如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、ph、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)每克(每毫升)檢樣所生長(zhǎng)出來的微生物菌落總數(shù)。如果制備的菌落總數(shù)樣品中，菌群易發(fā)生變化(繁殖和死亡等)，就會(huì)導(dǎo)致樣品的保存期短，樣品的均勻性和穩(wěn)定性差。因此，綜合考慮細(xì)菌的生化特性，選取性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的菌群對(duì)保證樣品的均勻性和穩(wěn)定性十分重要。菌落總數(shù)樣品制備的工藝技術(shù)要求比較高，并且樣品的均勻性和穩(wěn)定性與凍干的菌種、凍干的工藝條件、凍干保護(hù)劑的使用、再水化的介質(zhì)等均有密切的關(guān)系。
乳粉中菌落總數(shù)反映了乳粉在生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生情況，體現(xiàn)乳粉被細(xì)菌污染的程度，是做出科學(xué)衛(wèi)生評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，如菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)預(yù)示著存在腸道傳染病或食物中毒的潛在危險(xiǎn)。因此，制備均勻性與穩(wěn)定性俱佳的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，可以避免菌落總數(shù)檢驗(yàn)的隨意性和不確定性，有效地保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可信。這對(duì)提高實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制水平，保障食品安全，甚至于打破國(guó)際貿(mào)易壁壘、提高我國(guó)食品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力都具有特殊重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品中總的活的細(xì)菌數(shù)目在運(yùn)輸、儲(chǔ)存和測(cè)試等過程中菌落數(shù)都可發(fā)生變化的問題，提供一種乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，均勻性、穩(wěn)定性符合標(biāo)準(zhǔn)樣品要求，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，工藝簡(jiǎn)單，成功率高。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征是：目標(biāo)菌群由蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)組成。
所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)，其中海藻糖的體積分?jǐn)?shù)為12％、脫脂奶粉的體積分?jǐn)?shù)為15％。
所述樣品中目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度為104～105cfu/ml。
乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征是：包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護(hù)劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)四個(gè)步驟，其中樣品凍干過程為：菌株復(fù)蘇傳代—增菌—菌懸液配制—凍干和包裝—儲(chǔ)存，具體過程為：
(1)菌株復(fù)蘇傳代
將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復(fù)蘇和生長(zhǎng)，并對(duì)復(fù)蘇的菌株進(jìn)行鑒定；
(2)增菌
目標(biāo)菌群培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護(hù)劑中制成相應(yīng)單一菌種的菌液；
(3)菌懸液配制
將上一過程得到的菌液與凍干保護(hù)劑混合，按目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度104～105cfu/ml配制菌懸液，按1:1體積比混合形成菌懸液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌下分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實(shí)；
(4)凍干和包裝
將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機(jī)中，冷凍干燥50～55h，當(dāng)樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進(jìn)行箱內(nèi)加塞，關(guān)閉機(jī)器，樣品瓶中樣品為真空狀態(tài)；
(5)儲(chǔ)存
將樣品放置在-18℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機(jī)挑選樣品發(fā)放給參試實(shí)驗(yàn)室或進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。
所述凍干保護(hù)劑為含有海藻糖和脫脂奶粉的無菌水，其中體積分?jǐn)?shù)分別為：海藻糖12％、脫脂奶粉15％。
所述樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)按照gb/t15000.3-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》進(jìn)行。
本發(fā)明菌種的選擇采用蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌。眾所周知，菌落總數(shù)就是指在一定條件下(如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、ph、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)每克(每毫升)檢樣所生長(zhǎng)出來的微生物菌落總數(shù)。大腸埃希氏菌比較常見，但非常容易受到環(huán)境因素(特別是溫度)的影響。相比而言，肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌，可以最大程度保證測(cè)試樣品的穩(wěn)定性，即使在運(yùn)輸及儲(chǔ)存中大腸埃希氏菌的含量發(fā)生變化，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上也不會(huì)影響菌落總數(shù)。
本發(fā)明的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品具有以下優(yōu)勢(shì)特性：活的微生物、數(shù)量不發(fā)生變化、生化特征不發(fā)生變異，從滿足特殊運(yùn)輸?shù)臈l件著手，通過特殊工藝的研究、穩(wěn)定性和均勻性的研究等形成一套完善的標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)，適合于乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備。
附圖說明
圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施例。
實(shí)施例1
乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，目標(biāo)菌群由蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)組成。
所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)，其中海藻糖的體積分?jǐn)?shù)為12％、脫脂奶粉的體積分?jǐn)?shù)為15％。
所述樣品中目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度為104～105cfu/ml。
實(shí)施例2
如圖1所示，一種實(shí)施例1中乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護(hù)劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)四個(gè)步驟，具體步驟如下：
1、樣品添加菌株的選擇
按蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，所有標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)于政府指定的機(jī)構(gòu)，并附有菌株證書，保證了菌株的溯源性。
2、凍干保護(hù)劑的配制
樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)(體積分?jǐn)?shù)：海藻糖12％，脫脂奶粉15％)配制凍干保護(hù)劑。
3、樣品凍干
(1)菌株復(fù)蘇傳代
將標(biāo)準(zhǔn)菌株加入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復(fù)蘇和生長(zhǎng)，并對(duì)復(fù)蘇的菌株進(jìn)行鑒定；
(2)增菌
單一的活菌株在適宜的條件下生長(zhǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護(hù)劑中制成相應(yīng)單一菌種的菌液；
(3)菌懸液配制
將上一過程得到的菌液與凍干保護(hù)劑混合，按目標(biāo)菌群的目標(biāo)濃度104～105cfu/ml配制菌懸液。為保證得到的最終樣品中含有以上目標(biāo)濃度的菌株，本實(shí)施例中按照目標(biāo)菌105cfu/ml分別配制5個(gè)目標(biāo)菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成目標(biāo)菌群懸液，采用比濁法檢查菌株含量；置于磁力攪拌器上不斷攪拌下取1.0ml分裝到樣品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實(shí)；
(4)凍干和包裝
將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機(jī)中，冷凍干燥機(jī)參數(shù)按如下設(shè)置：
冷凍速度(coolingrate)0.5℃/min
早期冷凍點(diǎn)(incipientfreezingpoint)-1℃15min
冷凍溫度(coolingtemperature)-40℃
共熔點(diǎn)(meltingpointeutectictemperature)-29℃
加熱溫度(heatingtemperature)20℃120min
啟動(dòng)冷凍干燥機(jī)，機(jī)器直接進(jìn)入程序化的冷凍干燥過程，整個(gè)凍干過程50h；
當(dāng)樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進(jìn)行箱內(nèi)加塞；關(guān)閉機(jī)器。剔除塞子不緊的西林瓶，西林瓶中樣品為真空狀態(tài)；
(5)儲(chǔ)存
將樣品放置在-18℃條件下避光保存，并對(duì)保存的樣品進(jìn)行適當(dāng)管理和檢測(cè)，從全部樣品中隨機(jī)挑選樣品發(fā)放給實(shí)驗(yàn)室或進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。
4、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)
對(duì)樣品中目標(biāo)菌的均勻性和穩(wěn)定性檢查是驗(yàn)證樣品制備過程有效性的主要方法。檢查樣品均勻性和穩(wěn)定性按照gb/t15000.3-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》進(jìn)行。所得樣品均勻性和穩(wěn)定性檢測(cè)方法及結(jié)果如下：
分別隨機(jī)選取12個(gè)樣品，采用sn/t1897-2007菌落總數(shù)測(cè)試方法，在重復(fù)條件測(cè)試2×12份樣品的菌落總數(shù)。結(jié)果數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)步驟及結(jié)果如下：
表1方差分析公式
上表中，
表2樣品均勻性檢測(cè)結(jié)果
表3樣品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果
結(jié)論：在95％置信概率下，與其他因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響相比，樣品的不均勻性是可接受的。
采用兩種類型的穩(wěn)定性試驗(yàn)：一種是在貯存溫度(4℃)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，另一種是在高的溫度(模擬樣品的運(yùn)輸條件)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，選用三個(gè)溫度點(diǎn)，分別為20℃、36℃和42℃。定期檢測(cè)樣品，針對(duì)不同溫度點(diǎn)不同的保存時(shí)間測(cè)試3個(gè)樣本，將2×3份樣品結(jié)果的均值(對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后)用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，f值<f臨界值，則說明標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性符合要求，同時(shí)確定在不同溫度條件下符合標(biāo)準(zhǔn)樣品要求的最長(zhǎng)保存時(shí)間。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。
表4樣品短期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
表5樣品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果
實(shí)施例3
本實(shí)施例中所述的乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法的各步驟均與實(shí)施例2中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標(biāo)菌群懸液中各目標(biāo)菌的濃度按照5×103cfu/ml配制；凍干過程52h。
實(shí)施例4
本實(shí)施例中所述的乳粉中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法的各步驟均與實(shí)施例3中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標(biāo)菌群懸液中各目標(biāo)菌的濃度按照4.5×103cfu/ml配制；凍干過程55h。