本申請是申請?zhí)枮?00980117930.2的中國專利申請的分案申請，原申請是申請日為2009年4月16日的國際申請pct/us2009/040789的中國國家階段申請。本申請要求在2008年4月17日提交的美國臨時申請no.61/045,643的較早申請日的權(quán)益，該申請通過引用整體并入本文。本發(fā)明涉及重組蛋白生產(chǎn)的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及生產(chǎn)肽生長因子(包括骨形成蛋白(bmps))的方法。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)超家族的成員具有生理學(xué)上重要的生長調(diào)控和形態(tài)發(fā)生特性(kingsleyetal.,genesdev.8:133-146(1994)；hoodlessetal.,curr.topicsmicrobiol.immunol.228:235-272(1998))。骨形成蛋白(bmps)是生長和分化因子的tgf-β超家族的成員(rosenetal.,principlesofbonebiology2:919-928(2002))。bmps存在的最初證據(jù)中的一些是：當(dāng)將bmps植入肌肉時去礦物質(zhì)的骨能夠誘導(dǎo)新的骨的能力(uristetal.,science150:893-99(1965))。隨后從去礦物質(zhì)骨以生物化學(xué)方式純化了bmps(wangetal.,pnas85:9484-9488(1988))，并通過經(jīng)放射標(biāo)記的寡核苷酸的雜交進行克隆，所述經(jīng)放射標(biāo)記的寡核苷酸是從經(jīng)純化的蛋白的肽片段來設(shè)計的(wozneyetal.,science242:1528-1534(1988))。克隆的bmps已被重組表達并保留了其功能。bmps典型地是通過重組產(chǎn)生的，由于困難、缺乏純度和低產(chǎn)量，也可從天然來源(例如骨)中用生物化學(xué)方法純化。已知bmp-2和相關(guān)的蛋白bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7(也稱為op-1)、bmp-8(也稱為op-2)、bmp-9和bmp-10能介導(dǎo)骨和軟骨組織的生長和修復(fù)。bmp-2通常在臨床上用于治療開放性和不愈合性骨折、脊柱融合(作為infusetm醫(yī)療設(shè)備的一部分)和用于口腔矯正適應(yīng)癥。這種重要治療的可利用性和成本部分由其生產(chǎn)中使用的哺乳動物細胞培養(yǎng)物的效價(titer)決定。但是，以“實驗室規(guī)?！碑a(chǎn)生合適細胞效價的培養(yǎng)條件不能擴大到滿足對這些蛋白的不斷增加的需求來說必要的大制造規(guī)模。因此，人們需要下述方法，所述方法用于通過在生產(chǎn)中提高細胞效價來產(chǎn)生重組蛋白(例如bmp-2)，并且所述方法適用于制造規(guī)模中。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了以制造規(guī)模通過支持高的宿主細胞效價來產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法得到蛋白產(chǎn)量的增加。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)：以制造規(guī)模通過分批重新進料工藝，補充有痕量金屬的成分明確的培養(yǎng)基能支持(support)在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)的cho細胞的較高收獲細胞效價。沒有補充金屬的情況下，相同的培養(yǎng)基能支持小的(實驗室規(guī)模)生物反應(yīng)器中的生長，但“擴大”到制造規(guī)模的生物反應(yīng)器時卻失敗了。當(dāng)培養(yǎng)基中的吡哆醛(pyridoxal)被吡哆素(pyridoxine)代替時，效價一致性(consistency)被進一步改善。從而，在一個方面，本發(fā)明提供了重組蛋白表達的方法，所述方法包括以下步驟：在成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼感興趣的蛋白的核酸的合適的宿主細胞，所述培養(yǎng)基中鐵以至少大約2.25μm的濃度存在，并且若存在吡哆醛，其占培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；以及，回收感興趣的蛋白。在一些實施方式中，鐵以至少大約5μm的濃度存在。所述培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約10nm的銅和濃度為至少大約2μm的鋅。在一些實施方式中，若吡哆醛存在于培養(yǎng)基中，其以小于大約15μm的濃度存在。在一些特別的實施方式中，若存在吡哆醛，其以小于大約15μm的濃度存在，并且，占所述培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％。在一些實施方式中，若吡哆醛存在于培養(yǎng)基中，其或者以小于大約15μm的濃度存在，或者占培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％。在一些實施方式中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，例如cho細胞。在某些實施方式中，感興趣的蛋白是tgf-β超家族的成員，例如bmp，例如bmp-2。在某些實施方式中，培養(yǎng)基含有總濃度為至少大約15μm的維生素b6。在一些實施方式中，若吡哆醛存在于培養(yǎng)基中，其占培養(yǎng)基中維生素b6的總摩爾濃度的至多大約55％。在一些更特別的實施方式中，維生素b6具有小于大約1.2的吡哆醛與吡哆素的比率。在一些還更特別的實施方式中，培養(yǎng)基中不含吡哆醛。在一個特別的實施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)bmp-2的方法，其包括以下步驟：在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2蛋白的dna分子的合適的宿主細胞，所述的培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.5μm的鐵和濃度為至少大約15μm的維生素b6，并且其中若存在吡哆醛，吡哆醛占培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；以及，然后回收bmp-2蛋白。在一些實施方式中，培養(yǎng)基還含有總濃度為至少大約20mm的氨基酸。培養(yǎng)基可含有濃度為至少大約0.5mm的l-胱氨酸。在一些特別的實施方式中，培養(yǎng)基還含有濃度至多大約0.3mm的l-谷氨酸。在某些實施方式中，培養(yǎng)基還含有濃度為至少大約10mg/l的聚陰離子化合物(例如右旋糖酐硫酸酯(dextransulfate))。在一些實施方式中，培養(yǎng)基可具有大約260至380mosm之間的初始滲透壓。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法適于培養(yǎng)生長于分批重新進料工藝中的細胞。在一些特別的實施方式中，細胞生長于容量為至少大約3l的經(jīng)攪拌的釜生物反應(yīng)器中。在一些還更特別的實施方式中，培養(yǎng)溫度保持基本恒定。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法使用支持至少大約4.0x106個細胞/ml的收獲細胞密度的培養(yǎng)基。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)bmp-2的工藝或方法，其包括以下步驟：在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2蛋白的dna分子的cho細胞，所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.5μm的鐵、總濃度為至少大約20mm的氨基酸、濃度為至少0.5mm的l-胱氨酸、濃度為至少大約10mg/l的右旋糖酐硫酸酯和濃度為至少大約15μm的維生素b6，并且其中若存在吡哆醛，吡哆醛占培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；以及，然后回收bmp-2蛋白。在一些特別的實施方式中，培養(yǎng)基還包括濃度為至少大約10nm的銅。在一些還更特別的實施方式中，培養(yǎng)基還包括濃度為至少大約0.2μm的鋅。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)bmp-2的方法，所述方法包括以下步驟：在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2蛋白的dna分子的合適的宿主細胞，所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.5μm的鐵和濃度為至少大約15μm的維生素b6，并且其中若存在吡哆醛，吡哆醛占培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；以及，然后回收bmp-2蛋白。在一些實施方式中，本發(fā)明的任何方法還可包括純化或分離感興趣的蛋白(例如bmp-2)的步驟。在一些實施方式中，經(jīng)純化或分離的蛋白可被配制例如作為藥物。在一些特別的實施方式中，純化包括一種或多種柱色譜純化，例如丁基瓊脂糖凝膠(butylsepharose)柱純化。在另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的任何方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。在一些實施方式中，所述產(chǎn)品可用于治療患有骨組織缺陷、損傷、疾病或病癥的患者(例如哺乳動物，例如人類)，或用于制備用于治療患有骨組織缺陷、損傷、疾病或病癥的患者(例如哺乳動物，例如人類)的藥劑，所述治療通過例如促進骨生長、產(chǎn)生、康復(fù)或修復(fù)來實現(xiàn)。在另一方面，本發(fā)明提供了基本如本文所述的細胞培養(yǎng)基。在一些特別的實施方式中，細胞培養(yǎng)基表3和4中描述的那些基本相似。附圖說明圖1是在3l和160l生物反應(yīng)器中、分批重新進料工藝中細胞密度隨時間的圖。圖2是在160l生物反應(yīng)器中、分批重新進料工藝中，針對有和沒有補充鐵和銅的培養(yǎng)基中生長的細胞而言，細胞密度隨時間的圖。圖3是在160l生物反應(yīng)器中、在分批重新進料工藝中，針對補充有鐵和銅的培養(yǎng)基中生長的細胞而言，活細胞密度隨時間的圖。圖4是一系列柱狀圖，其顯示了生長于具有不同培養(yǎng)基和不同金屬濃度的培養(yǎng)瓶中的細胞的生長速度。圖5是一系列柱狀圖，其顯示了生長于具有不同培養(yǎng)基和不同鐵濃度的培養(yǎng)皿中的細胞生長速度。圖6是在2500l生物反應(yīng)器中、在分批重新進料工藝中根據(jù)本發(fā)明的方法生長的細胞生收獲細胞密度隨時間的圖。虛線表示較早工藝的平均收獲密度。圖7是針對圖6中描述的培養(yǎng)物的rhbmp-2收獲效價隨時間的圖。虛線表示較早工藝中的平均rhbmp-2標(biāo)準化收獲效價。具體實施方式示例性實施方式已發(fā)現(xiàn)：可通過在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達bmp-2的細胞，以制造規(guī)模獲得恒定的、高密度的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基補充有鐵、銅和鋅，還含有右旋糖酐硫酸酯，其中，維生素b6以至少15μm的濃度存在于培養(yǎng)基中，并且，維生素b6中吡哆醛與吡哆素的比率小于1.2。培養(yǎng)基適用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基典型地含有支持培養(yǎng)的細胞生長所需的營養(yǎng)物，包括維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、碳源(例如右旋糖(dextrose))，以及任選地，生長因子，包括例如，胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白，或抗生素。在一些實施方式中，培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基例如dulbecco’smodifiedeagle’s培養(yǎng)基(dmem)、ham’sf-12、roswellparkmemorialinstitute(rpmi)培養(yǎng)基或其組合。在某些實施方式中，培養(yǎng)基是化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，即其是無血清的。應(yīng)當(dāng)理解：除非另有指明，本申請中培養(yǎng)基中的組分的濃度是起始濃度，即：在被用于培養(yǎng)細胞之前，新鮮培養(yǎng)基中該組分的濃度。如本領(lǐng)域中所已知的，一些特別的組分的濃度會隨著細胞經(jīng)歷代謝過程或通過自發(fā)化學(xué)反應(yīng)而改變。在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.25、5、5.5、8、10、12、14、15、20、25、30μm或更多的鐵。在一些更特別的實施方式中，鐵以大約5μm的濃度存在。在一些還更特別的實施方式中，鐵以大約5.5μm的濃度存在。在一些實施方式中，鐵以大約5.5至15μm之間的濃度存在。應(yīng)當(dāng)理解：對本申請中描述一些參數(shù)的所有數(shù)值范圍而言，例如“至少”、“少于/小于”或“超過”，本說明書也必然描述了提到的值的限度內(nèi)的任何范圍。培養(yǎng)基可含有其它金屬，包括銅和鋅。銅可以以至少大約5、10、12、15、30、50、75、100、150、200、250nm或更高的濃度存在。在一些特別的實施方式中，銅以至少大約10nm的濃度存在。在一些還更特別的實施方式中，銅以至少大約74μm的濃度存在。培養(yǎng)基還可含有濃度為至少大約0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0μm或更多的鋅。在一些特別的實施方式中，鋅以大約4.2μm的濃度存在。在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含如上文所描述的鐵和銅，例如，鐵以至少大約2.25、5、5.5、8、10、12、14、15、20、25、30μm的濃度存在，銅以至少大約5、10、12、15、30、50、75、100、150、200、250nm的濃度存在。在某些實施方式中，培養(yǎng)基含有如上文所述的鐵、銅和鋅。因此，在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度在大約2.5μm至15μm之間的鐵、濃度在大約10nm至150nm之間的銅和濃度在大約2.1μm至8.4μm之間的鋅。在一些更特別的實施中，培養(yǎng)基包含濃度為至少大約5μm的鐵、濃度為至少大約10nm的銅和濃度為至少大約2μm的鋅。用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基在例如分批重新進料培養(yǎng)期間支持持續(xù)的高收獲細胞密度。在一些實施方式中，用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基支持為至少大約1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.1x106、4.2x106、4.3x106、4.5x106、4.8x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106、7.0x106、7.5x106、8.0x106、8.5x106、9.0x106、9.5x106個細胞/ml或更高的收獲密度。在一些更特別的實施方式中，培養(yǎng)基支持為大約4.0x106個細胞/ml到7.0x106個細胞/ml的收獲密度。在某些實施方式中，為獲得這些收獲密度，以小于大約0.037x106、0.075x106、0.15x106、0.3x106、0.6x106、1.2x106或2.4x106個細胞/ml或更高的密度接種細胞。在一些特別的實施方式中，以小于大約0.6x106個細胞/ml的密度接種細胞。在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含維生素b6，已知其以適于在細胞培養(yǎng)物中使用的若干種形式存在，包括吡哆素、吡哆醛、吡哆胺、吡哆素5’-磷酸酯、吡哆醛5’-磷酸酯、吡哆胺5’-磷酸酯及其組合。在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含選自吡哆素、吡哆胺、吡哆素5’-磷酸酯、吡哆胺5’-磷酸酯及其組合的至少一種維生素b6。在一些實施方式中，維生素b6以至少大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μm或更高的總濃度存在于培養(yǎng)基中。在一些特別的實施方式中，維生素b6以至少大約10μm的濃度存在。在一些還更特別實施方式中，維生素b6以大約30μm的濃度存在。在某些實施方式中，若存在吡哆醛，吡哆醛占培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的不超過大約55、50、40、30、20、10、5、1、0.1％。在一些實施方式中，若培養(yǎng)基中存在吡哆醛，吡哆醛以小于大約20、15、10、8、6、5、4、3、2、1μm的濃度存在。在一些實施方式中，培養(yǎng)基具有0至1.2之間的吡哆醛與吡哆素的比率。在一些更特別的實施方式中，培養(yǎng)基中吡哆醛與吡哆素的比率為小于1.2，例如小于大約1.1、1.0、0.9、0.7、0.5、0.4、0.3或0.1。在一些還更特別的實施方式中，培養(yǎng)基基本上不含吡哆醛。用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基典型地提供氨基酸，以支持培養(yǎng)的細胞生長以及感興趣的蛋白的產(chǎn)生。在一些實施方式中，氨基酸可以以確定的比例存在于培養(yǎng)基中，例如，如在表3或4中描述的。已知在本領(lǐng)域中，蛋白制備物的水解產(chǎn)物(例如蛋白胨、細菌蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解產(chǎn)物或大豆蛋白胨(soytonesoy)水解產(chǎn)物)可用作為氨基酸來源。在一些實施方式中，含有確定比例的氨基酸的培養(yǎng)基可被補充未明確成分的蛋白水解產(chǎn)物?；蛘?，在一些實施方式中，未明確成分的水解產(chǎn)物作為氨基酸的主要來源供應(yīng)。在一些特別的實施方式中，水解產(chǎn)物是氨基酸的主要來源時，可根據(jù)需要，用一種或多種特別的氨基酸來補充培養(yǎng)基。在一些實施方式中，培養(yǎng)基具有至少大約15、20、25、30、35、40mm或更高的總氨基酸濃度。在一些特別的實施方式中，培養(yǎng)基中總氨基酸含量為至少大約20mm。在一些還更特別的實施方式中，總氨基酸濃度為大約30mm。可對氨基酸的比例和各氨基酸的濃度加以調(diào)整，以適應(yīng)宿主細胞的代謝需要(這取決于例如細胞的生長速度、細胞的代謝情況、產(chǎn)生的重組蛋白中氨基酸的比例)，或用于改進產(chǎn)生的重組蛋白的品質(zhì)。例如，在cho細胞中產(chǎn)生的、作為與半胱氨?；幕蛴坞x巰基二聚體的可解締二聚體rhbmp-2的部分受培養(yǎng)基中的l-胱氨酸和l-谷氨酸的濃度影響，例如公開于美國專利no.5,830,761中的。從而，在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為至少大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.05、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mm或更高的l-胱氨酸。例如，在一些特別的實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為大約0.2-4.0mm的l-胱氨酸。在一些更特別的實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為大約0.5-4.0mm的l-胱氨酸。在一些還更特別的實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為大約0.7-3.0mm的l-胱氨酸。在一些實施方式中，l-谷氨酸以至少大約0.023、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mm或更高的濃度存在于培養(yǎng)基中。在一些特別的實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為至少大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.05、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mm或更高的l-胱氨酸和濃度為至多大約0.023、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mm的l-谷氨酸。在一些更特別的實施方式中，l-胱氨酸以至少大約0.5mm的濃度存在于培養(yǎng)基中，并且，l-谷氨酸以至多大約0.3mm的濃度存在于培養(yǎng)基中。在一些還更特別的實施方式中，l-胱氨酸以大約0.7-3.0mm的濃度存在于培養(yǎng)基中，以及l(fā)-谷氨酸以至多大約0.2mm的濃度存在于培養(yǎng)基中的。培養(yǎng)基還可包含聚陰離子劑。理論上但不依賴于理論，聚陰離子劑與細胞的細胞表面上的基元(moieties)競爭結(jié)合分泌的重組蛋白上的肝素分子樣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，成熟的(經(jīng)蛋白水解切割的)hbmp-2單體或二聚體的n端。當(dāng)分泌的蛋白結(jié)合至細胞表面時，溶液中蛋白的產(chǎn)率會下降。通過與細胞表面上的這些元件競爭，聚陰離子劑增加了培養(yǎng)基中游離蛋白(非細胞聯(lián)結(jié)的)的含量。聚陰離子劑的例子包括肝素、肝素硫酸鹽、戊聚糖硫酸鹽、右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、透明質(zhì)酸、軟骨素、軟骨素硫酸酯、皮膚素硫酸酯(dermatansulfate)、角質(zhì)素硫酸酯、己糖醇-己糖胺聚糖硫酸酯(hexuronal-hexosaminoglycansulfate)、肌醇六硫酸酯(inositolhexasulfate)和蔗糖八硫酸酯。在某些實施方式中，聚陰離子劑能夠以微摩爾級或納摩爾級的親和力與成熟hbmp-2單體的n端結(jié)合。在一些實施方式中，聚陰離子劑是磺化的天然聚合物，例如葡胺聚糖(gag)或其衍生物，其中聚合物中至少大約1％、5％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、50％或更多是磺化的。在一些實施方式中，聚陰離子劑以至少大約1、5、10、20、50、75、100、200、400、600、800、1,000mg/l或更高的濃度存在。在一些特別的實施方式中，聚陰離子劑是右旋糖酐硫酸酯。在一些更特別的實施方式中，右旋糖酐硫酸酯具有大約5,000至500,000g/摩爾之間的分子量。在一些還更特別的實施方式中，右旋糖酐具有大約7,000g/摩爾的分子量，在一些實施方式中，右旋糖酐以至少大約10mg/l的濃度存在。在一些更特別的實施方式中，右旋糖酐以大約400mg/l的濃度存在。在美國專利nos.5,318,898和5,516,654中有對在培養(yǎng)基中使用右旋糖酐硫酸酯以生產(chǎn)rhbmp-2的進一步描述。可操縱培養(yǎng)基，以保持培養(yǎng)基的某些參數(shù)，例如ph、溶解o2或滲透壓。在一些實施方式中，培養(yǎng)基被保持為特定的滲透壓范圍。在其它一些實施方式中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至特定的起始滲透壓。在一些特別的實施方式中，培養(yǎng)基的起始滲透壓在大約260-380mosm之間。在一些更特別的實施方式中，起始滲透壓在大約280至360mosm之間。在某些實施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.5μm的鐵、濃度為至少大約10nm的銅、總濃度為至少大約20mm的氨基酸、濃度為至少大約10mg/l的右旋糖酐硫酸酯和濃度為至少大約15μm的維生素b6，其中維生素b6具有小于大約1.2的吡哆醛與吡哆素的比率。在一些更特別的實施方式中，培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約0.2μm的鋅，在一些非常特別的實施方式中，用于本發(fā)明的培養(yǎng)基被描述在表3和表4中，即培養(yǎng)基a1、a2、b1或b2。在一些還更特別的實施方式中，培養(yǎng)基是b2。在某些實施方式中，培養(yǎng)基與b2基本相似。“基本相似”表示：培養(yǎng)基中不存在與表4中培養(yǎng)基b2相比濃度差異超過大約0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0倍(即增加或減少)的組分。在一些實施方式中，使用未明確組分的培養(yǎng)基是可接受的，并且培養(yǎng)基可補充有可多至大約0.1、0.5、1、5、10％或更多的胎牛血清(fbs)。但是，即使血清廣泛用于哺乳動物細胞培養(yǎng)物，但存在與其使用相關(guān)的若干問題，如在freshneycultureofanimalcells,johnwiley&sons,newyork,91-99(1994)中討論的。例如，血清包含許多未鑒定的組分，因此化學(xué)上是不明確的。事實上，血清的組成隨批次而變化，難于使其標(biāo)準化。此外，血清可含有生長抑制因子，這導(dǎo)致生長不理想。最后，血清可含有病毒或其它病原體，使得生產(chǎn)和批準許可都更為困難。從而，在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用無血清的培養(yǎng)基。蛋白本發(fā)明提供的方法可用于生產(chǎn)多種蛋白。在某些實施方式中，蛋白是生長因子。在一些特別的實施方式中，生長因子是tgf-β超家族的成員。在一些更特別的實施方式中，tgf-β家族成員是骨形成蛋白(bmp)。bmps是高度同源的蛋白質(zhì)族，可基于進一步更高的同源性水平將其其分入亞組。一些重要的亞組包括：bmp-2和bmp-4；bmp-5、bmp-6和bmp-7；以及bmp-12、bmp-13和mp-52。具體而言，bmps共享蛋白的羧基端區(qū)域中半胱氨酸殘基的鑒定模式，這是bmp活性所必需的。在某些實施方式中，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是選自bmp-2、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8、bmp-9、bmp-10、bmp-11、bmp-12、bmp-13、bmp-14、bmp-15、bmp-16、bmp-17、bmp-18和mp-52(包括其組合和其異源二聚體)的bmp。典型地，bmp指二硫化物連接的二聚分子。在某些實施方式中，bmp可以是單體。在一些實施方式中，提到bmp包括在氨基酸水平上與已知的bmp的成熟(缺少前結(jié)構(gòu)域(prodomain))區(qū)域的序列具有至少大約70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更高同一性并且保留有生物活性(例如骨、軟骨或韌帶/腱樣組織形成活性)的序列。在一些實施方式中，bmp可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個較之已知bmp序列而言的氨基酸取代。bmps在本領(lǐng)域中是已知的，其已從多種物種(包括哺乳動物(例如人類、貓、雞、黑猩猩、牛、狗、山羊、馬、短尾猿、小鼠、豬、兔、大鼠和綿羊))中鑒定出來。對bmps的描述，包括例如，蛋白和核酸序列以及生產(chǎn)方法，可在下述公開文獻中找到：bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6和bmp-7(公開于例如美國專利nos.5,013,649、5,116,738、5,106,748、5,187,076和5,141,905中)，bmp-8(公開于pctwo91/18098中)，bmp-9(公開于pctwo93/00432中)，bmp-10(公開于pctwo94/26893中)，bmp-11(公開于pctwo94/26892中)，bmp-12和bmp-13(公開于pctwo95/16035中)，bmp-15(公開于美國專利no.5,635,372中)，bmp-16(公開于美國專利no.6,331,612中)，mp-52(公開于pctwo93/16099中)以及bmp-17和bmp-18(公開于美國專利no.6,027,917中)。應(yīng)當(dāng)理解：提到這些蛋白質(zhì)也意味著包括變體、等位基因變體、bmps的片段和突變體bmps，包括但不限于缺失突變體、插入突變體和取代突變體。具體而言，應(yīng)當(dāng)理解：提到任何具體的bmp包括n端截短片段，其中，已從成熟蛋白的n端移除了至少1、3、5、7、9、10、11、12、13、15、18、20、22、25、30、35或更多個殘基。在本發(fā)明的一些特別的實施方式中，bmp是bmp-2。在一些實施方式中，bmp-2是人類bmp-2(hbmp-2)。在一些還更特別的實施方式中，hbmp-2是成熟的hbmp-2(即ncbi檢錄號np_001191中的q283-r396)，其具有骨和/或軟骨形成活性。在一些特別的實施方式中，hbmp-2在氨基酸水平上與成熟的hbmp-2(ncbi檢錄號np_001191中的q283-r396)至少大約88、89、90、92、94、95、96、98、99、99.9％相同。從而，在一些實施方式中，成熟的hbmp-2可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸取代。在一些實施方式中，產(chǎn)生的bmp-2是二聚的。在一些實施方式中，產(chǎn)生的bmp-2是單體性的。在某些實施方式中，bmp-2具有較之二聚體蛋白的至少一個亞基的n端的至少1、3、5、7、9、10、11、12、13或更多個殘基的n端截短。針對bmp-2活性的檢驗是本領(lǐng)域中已知的，其被公開于例如美國專利no.5,013,649中。已在很多物種中鑒定了bmp-2。見例如表1，其列出了針對來自若干物種的bmp-2的nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)entrezgeneid。這些geneids可用于回溯公眾可獲得的被注釋的mrna或蛋白序列，例如，在ncbi全球網(wǎng)址入口，其可在下述統(tǒng)一資源定位符(url)中找到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene。作為闡述，人類bmp-2的geneid可用于回溯下述參考序列：nm_001200.2(mrna)和np_001191.1(蛋白)。小鼠的情況類似，可回溯的bmp-2參考序列包括nm_007553.2(mrna)和np_031579.2(蛋白)。在本申請中提到的所有與geneid相關(guān)的信息，包括，例如染色體座、染色體序列、功能注釋、等位基因變體和參考mrna和蛋白序列，都通過引用整體并入本文。所有參考序列也通過引用整體并入本文，這包括片段的注釋特征，例如mrnas的外顯子邊界或蛋白的結(jié)構(gòu)特征，例如界定蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域。表1物種geneid物種geneid人類650牛615037小鼠12156豬494462雞378779黑猩猩458090大鼠29373狗477162蛙548717短尾猿718330綿羊443173兔100009349分離和用途已知在本領(lǐng)域中，骨形成蛋白例如bmp-2可用作為基于蛋白的治療劑。因此，本發(fā)明的方法還可包括對從培養(yǎng)基中回收的蛋白進行純化或分離的步驟?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來純化bmp-2。在一些特別的實施方式中，純化包括一種或多種柱色譜純化，例如，丁基瓊脂糖凝膠樹脂純化。在一些更特別的實施方式中，丁基瓊脂糖凝膠柱包括將丁胺偶聯(lián)至經(jīng)cnbr活化的瓊脂糖上的樹脂，例如瓊脂糖凝膠4b。在一些實施方式中，純化還可包括在肝素樣樹脂(例如cellufinetm硫酸酯樹脂)上進行的柱純化步驟。例如，可將含有bmp-2的來自培養(yǎng)細胞的條件培養(yǎng)基應(yīng)用至含有肝素樣樹脂的柱，從該柱獲得含有bmp-2的洗脫液，然后將洗脫液應(yīng)用至第二柱(例如丁基瓊脂糖凝膠柱)。還可進行額外的純化，例如國際公開文件no.wo99/31120中所述的，特別其中3-7頁所述的，該文件通過引用并入本文。一旦經(jīng)純化，本發(fā)明的方法的產(chǎn)品還可被進一步配制，例如作為藥物。關(guān)于用于bmps的藥物載體的一般性綜述參見例如，seehermanandwozneycytokinegrowthfactorrev.16(3):329-45(2005)或美國專利no.5,385,887。本發(fā)明的方法的產(chǎn)品可用于治療骨組織缺陷、損傷、疾病或病癥或用于制備用于治療骨組織缺陷、損傷、疾病或病癥的藥劑，這可通過例如促進骨生長、產(chǎn)生、康復(fù)或修復(fù)來實現(xiàn)。細胞多種細胞可用于通過本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)重組蛋白。可經(jīng)重組dna轉(zhuǎn)化以表達感興趣的蛋白(例如bmp)的任何細胞可用于本發(fā)明的方法。細胞可以來自多種物種，包括線蟲類、蠕蟲類、昆蟲類、兩棲類或哺乳動物(例如人類、靈長類動物、綿羊、牛、豬、馬、貓科動物、犬科動物或嚙齒動物來源)。在一些特別的實施方式中，細胞來自人類或嚙齒動物。在一些更特別的實施方式中，細胞來自倉鼠。適于在本發(fā)明的方法中的細胞系是本領(lǐng)域中公知的，并且是可廣泛獲得的?？蓮谋２貦C構(gòu)獲得多種合適的細胞系，例如americatypeculturecollection(atcc),manassas,va。本發(fā)明的合適的細胞系包括cos細胞、cho細胞、bhk細胞、balb/c3t3細胞、frhl-2細胞、sp2/0細胞、nso細胞、tm4細胞、cv1細胞、mdck細胞、brl細胞、vero-76細胞、hela細胞、mdck細胞、hepg2細胞或293細胞。在一些特別的實施方式中，細胞是cos細胞、cho細胞、bhk細胞、balb/c3t3細胞或293細胞。在一些更特別的實施方式中，細胞是cho細胞。cho細胞可經(jīng)修飾，以增加細胞效價和/或蛋白產(chǎn)率。在一些實施方式中，cho細胞可具有降低的二氫葉酸還原酶基因(dhfr；小鼠geneid13361)表達或二氫葉酸還原酶基因不表達，例如cho細胞可以是針對dhf的減效的(降低的功能)、無效的(無功能的)或顯性失活的(空的，并且抑制酶的功能形式)等位基因來說雜合或純合的，并且感興趣的蛋白可被共轉(zhuǎn)染進包含功能性dhfr基因的構(gòu)建體中。生物反應(yīng)器及條件可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來培養(yǎng)用于本發(fā)明方法中的細胞，例如描述于warnockandal-rubeibiotech.appl.biochem.45:1-12(2006)中的。典型地，細胞在生物反應(yīng)器中生長。生物反應(yīng)器可以是任何尺寸的。在一些實施方式中，所述的生物反應(yīng)器至少大約1l、3l、20l、40l、80l、100l、160l、1,900l、2,500l、12,000l、20,000l、40,000l或更大。生物反應(yīng)器可支持細胞以懸浮形式生長(即非錨定依賴性生長)或錨定至底物上生長。錨定依賴性生長可包括例如使用微載體，以例如提供大的表面積與體積的比率。在本發(fā)明的一些特別的實施方式中，細胞可以以懸浮形式生長，即沒有錨定表面。錨定依賴性生長的形式是本領(lǐng)域中公知的，其包括在例如經(jīng)攪拌的釜生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器中生長。在一些特別的實施方式中，生物反應(yīng)器是經(jīng)攪拌的釜生物反應(yīng)器。進而，可通過本領(lǐng)域已知的多種方，來培養(yǎng)特定的生物反應(yīng)器中生長的細胞，包括分批重新進料(下文中有進一步描述，還見drapeauetal.,cytotechnology15(1-3):103-9(1994))、流加式(見例如美國專利nos.5,672,502；6,924,124或7,332,303)或灌注(利用細胞保留裝置，由此當(dāng)新鮮培養(yǎng)基加入時廢料可從生物反應(yīng)器中被移除，見例如美國專利nos.4,814,278或6,607,910)培養(yǎng)方法。在一些特別的實施方式中，通過分批重新進料工藝培養(yǎng)細胞。在一些更特別的實施方式中，在基本恒定的溫度下培養(yǎng)細胞。在一些實施方式中，合適的培養(yǎng)溫度可選擇自大約31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42℃。在一些實施方式中，基本恒定的溫度可以是窄的溫度范圍，例如35-39℃或36-38℃。在一些更特別的實施方式中，在大約37℃的恒定溫度下培養(yǎng)細胞。生物反應(yīng)器可保持培養(yǎng)基的多種生理參數(shù)，例如，氧合(oxygenation)(溶解的o2)、ph、滲透壓、溫度、光照和特殊營養(yǎng)物(例如葡萄糖或氨基酸)的濃度。在某些實施方式中，生物反應(yīng)器監(jiān)控并保持溫度、ph和溶解的o2含量。在一些實施方式中，葡萄糖分批進料。例如，通過分批重新進料在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞。在一些特別的實施方式中，總培養(yǎng)物(即細胞和培養(yǎng)基)的一部分被定期移除(例如收獲)并用新鮮培養(yǎng)基替換。在一些實施方式中，總培養(yǎng)基的至少大約10、25、50、75、80、85、90、95、99％或更多被定期移除并用新鮮培養(yǎng)基替換。在一些更特別的實施方式中，總培養(yǎng)基的至少大約75％被移除并被替換。在一些特別的實施方式中，大約每6、12、18、24、30、36、42或48小時或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或每更多天移除細胞培養(yǎng)基的一部分。在一些更特別的實施方式中，每3天移除并替換培養(yǎng)基的一部分。在其它一些實施方式中，大約每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個細胞分裂周期，移除并替換總培養(yǎng)物的一部分?！凹毎至阎芷凇北硎驹谥笖?shù)生長期間(即在富培養(yǎng)基中，在沒有例如接觸抑制的情況下)培養(yǎng)的細胞的平均倍增時間。在某些實施方式中，可通過限制或控制由細胞的乳酸鹽/酯生產(chǎn)來提高細胞效價和/或蛋白產(chǎn)率。可通過以受限方式限制向培養(yǎng)細胞進料葡萄糖，來控制乳酸鹽/酯生產(chǎn)，例如，如2005年3月31日公開的美國專利公開no.2005/0070013所述(還見美國專利no.7,429,491)。應(yīng)當(dāng)理解：對本文引用的所有專利、申請、geneids、參考序列或其它參考文獻而言，為了所有目的以及為了提到的其主張，通過引用將它們整體并入本文。當(dāng)通過引用并入的文獻和本申請之間存在任何矛盾時，以本申請為準。實施例實施例1：在rhbmp-2生產(chǎn)期間的規(guī)模擴大問題在bmp-2生產(chǎn)工藝的開發(fā)期間，用在1,900升生物反應(yīng)器中共表達rhbmp-2和二氫葉酸還原酶(dhfr)的cho細胞(本文中稱為emc-g5細胞)的高細胞密度培養(yǎng)物，觀察規(guī)模擴大的問題。以0.60x106個細胞/ml(3天的批次)或以0.30x106個細胞/ml(4天的批次)接種高細胞密度培養(yǎng)物。在分批重新進料工藝的第一次傳代期間，最終細胞密度通常達到3.0x106個細胞/ml，但是之后傳代的最終細胞密度逐漸下降。例如，三次傳代將導(dǎo)致產(chǎn)生分別為3.0x106、1.6x106和1.0x106個細胞/ml的收獲細胞密度。這種下降的生長速度導(dǎo)致培養(yǎng)基中bmp-2蛋白的量較低，并且整體生產(chǎn)力低于期望。在3升的規(guī)模下，下降的生長速度沒有重現(xiàn)。使用160公升的生物反應(yīng)器作為模型來研究該問題。在160l的生物反應(yīng)器中觀察到了下降的收獲細胞密度，如圖1中所示。其它實驗也顯示出相同的困難。在一次試驗中，第一次高密度傳代達到了2.99x106個細胞/ml的最終細胞密度，然而第二次傳代僅達到2.28x106個細胞/ml。在具有預(yù)傳代的對照條件下再次接種反應(yīng)器，繼而第一和第二次高密度傳代分別達到2.65x106個細胞/ml和1.49x106個細胞/ml的最終細胞密度。兩項對照實驗均顯示出規(guī)模擴大的問題，其中第一次高接種傳代達到高的最終密度，但是后續(xù)傳代的生長速度顯著地下降。bmp-2效價和比生產(chǎn)力數(shù)據(jù)顯示出相似的趨勢。在生長培養(yǎng)基中添加痕量元素d(“痕量d”)消除了培養(yǎng)基中的生產(chǎn)規(guī)模擴大問題。痕量d由3μm鐵、3μm鋅和0.03μm銅構(gòu)成。用痕量元素d時，高的接種批次(3天和4天)持續(xù)地達到3.0x106個細胞/ml或更高的收獲密度。高的生長速度和比生產(chǎn)力也得以保持。這表明痕量d正面影響細胞生長特性。在有或沒有補充鐵和銅的培養(yǎng)基中的細胞生長實驗的結(jié)果如圖2所示。為了試圖發(fā)現(xiàn)痕量d的哪種組分是最重要的，測試了僅補充有銅的培養(yǎng)基(未示出)。在第一個高接種批次達到超過3.0x106個細胞/ml之后，隨后的兩個批次顯示出下降的生長速度，這與對照批次(沒有痕量d)的表現(xiàn)相似。三次高接種傳代中下降的生長速度表明僅有銅對改進規(guī)模擴大問題來說是無效的。實施例2：右旋糖酐硫酸酯消除色譜異常在這些痕量金屬評估期間，在來自之前的高密度培養(yǎng)物中產(chǎn)生的rhbmp-2的尺寸排除色譜(cex)的第二個峰上觀察到異常的肩峰。發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)基中低水平的右旋糖酐硫酸酯(用10mg/l代替200mg/l)導(dǎo)致產(chǎn)生用磷酸鹽孵育之后的高得多的肩峰百分比(分別為：大約12％對大約4％)。右旋糖酐硫酸酯劑量應(yīng)答實驗表明：細胞培養(yǎng)基中更高水平的右旋糖酐硫酸酯以劑量依賴方式降低了觀察到的肩峰的量。右旋糖酐硫酸酯之前已顯示能在bmp-2生產(chǎn)期間增加蛋白產(chǎn)率。見例如美國專利nos.5,318,898和5,516,654。實施例3.1：在補充金屬的培養(yǎng)基中降低的細胞效價當(dāng)培養(yǎng)基中鐵和銅濃度富集時，偶爾觀察到細胞生長不穩(wěn)定，即使是在實驗室規(guī)模的生物反應(yīng)器中也如此。見圖3。假定：另外的金屬可與其它培養(yǎng)基組分相互作用并導(dǎo)致不穩(wěn)定的培養(yǎng)物生長。在組織培養(yǎng)瓶中的預(yù)備實驗中(圖4)，以0.08x106個細胞/ml的密度接種細胞，并使其生長4天。補充有單獨的銅或鋅的培養(yǎng)基a1(140)支持了與未經(jīng)補充的培養(yǎng)基相當(dāng)?shù)纳L速度，而痕量d補充(另外的鐵、銅和鋅)則導(dǎo)致較低的生長速度。當(dāng)培養(yǎng)基a1僅補充有鐵時，細胞還顯示出生長速度的劑量依賴性減少。與在補充有鐵的培養(yǎng)基a1中生長的細胞相似，在培養(yǎng)基b1(248)中生長的細胞顯示出降低的生長速度。實施例3.2：吡哆醛-鐵的相互作用導(dǎo)致降低的生長速度在進一步的研究中，將引起生長速度缺陷的培養(yǎng)基a1與沒有引起生長速度缺陷的培養(yǎng)基a2相比較。注意到培養(yǎng)基a1主要含有吡哆醛，而培養(yǎng)基a2僅含有吡哆素。在不同的鐵濃度以及有和沒有吡哆醛的培養(yǎng)基a1和培養(yǎng)基a2中培養(yǎng)bmp-2emcg5細胞。培養(yǎng)基a1和a2的鐵和維生素b6的含量被概括于表2中。表2在保持于37℃及7％co2的孵育器中的組織培養(yǎng)皿中，對細胞培養(yǎng)3天。以0.15x106個細胞/ml下接種細胞，并在3天結(jié)束時收獲。用casy計數(shù)器對第三天的細胞加以計數(shù)，獲得最終細胞密度(單位為106個細胞/ml)。接著通過下式計算生長速度：生長速度(u)＝ln(最終細胞密度/起始細胞密度)/培養(yǎng)時間(小時)。結(jié)果見圖5中所示。已發(fā)現(xiàn)：吡哆醛而不是吡哆素，是與鐵相互作用的組分，其導(dǎo)致不持續(xù)的培養(yǎng)物性能。吡哆素是吡哆醛的前體。它們在培養(yǎng)基中可與維生素b6互換，并作為用于轉(zhuǎn)氨作用、脫羧基作用和去氨基作用的輔助因子。對于大多數(shù)的細胞培養(yǎng)工藝而言，培養(yǎng)基含有吡哆素、吡哆醛或二者均含并沒有差異。但是，某些濃度下的吡哆醛與增加的量的鐵相互作用，并對rhbmp-2生產(chǎn)工藝造成負面影響。如圖5所示，培養(yǎng)基a1引起相對于培養(yǎng)基a2的生長速度缺陷，另外的鐵會使得這種缺陷加劇。當(dāng)補充有吡哆醛時，培養(yǎng)基a2以鐵劑量依賴方式引起生長速度缺陷。從而，培養(yǎng)基中較高的鐵濃度和較高的吡哆醛濃度或比例的組合導(dǎo)致不穩(wěn)定的和并非最佳的培養(yǎng)物生長。實施例4：細胞密度和蛋白效價的強烈增大在進一步的培養(yǎng)基修飾(產(chǎn)生了培養(yǎng)基b2)(從培養(yǎng)基中除去吡哆醛)之后，細胞生長和bmp-2生產(chǎn)力得以持續(xù)，并且，相對于較早的工藝而言，在小規(guī)模生物反應(yīng)器和商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器中顯示出生產(chǎn)力的兩倍增加。見圖6和圖7。從而，在本申請中描述的對培養(yǎng)基的修飾消除了在將重組蛋白生產(chǎn)擴大到商業(yè)規(guī)模期間的出現(xiàn)的生長缺陷，導(dǎo)致高品質(zhì)重組蛋白的產(chǎn)率大幅增加。在工業(yè)上用來產(chǎn)生重組人類骨形成蛋白2(rhbmp-2)的細胞系是共表達bmp-2和dhfr的中國倉鼠卵巢(cho)系，其在本文中被稱為emc-g5。在以0.6x106個細胞/ml的目標(biāo)細胞密度接種的2,500升工作體積的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞。細胞被培養(yǎng)于培養(yǎng)基b2(見表4)中。培養(yǎng)物的溫度保持為37℃。在傳代的最初若干小時令培養(yǎng)物的ph下降至設(shè)定值7.10，并通過添加滴定劑來保持。培養(yǎng)基b2的初始ph是～7.30。以每種接種細胞密度，對培養(yǎng)物進行每3天2次和每4天2次的連續(xù)傳代。根據(jù)來自血氣分析儀(bga)的測量數(shù)據(jù)即時校準ph探測器。使用顯微鏡，通過手動計數(shù)來測定細胞密度和存活率，使用臺盼藍排除(trypanblueexclusion)來測定存活率。通過離心來收獲每次傳代后來自所有培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，接著對其加以過濾。表3和4顯示了在這些研究中使用的培養(yǎng)基配方。表3組分培養(yǎng)基a1培養(yǎng)基a2氨基酸mmmmala0.2000.100精氨酸2.5200.550天冬酰胺0.8000.450天冬氨酸0.2000.250cyshcl,h2o0.4000.400胱氨酸2hcl1.4001.400谷氨酸0.2000.100谷氨酰胺8.0008.000甘氨酸0.4000.100hishclh2o0.2200.175異亮氨酸0.8000.450亮氨酸0.8000.650賴氨酸hcl0.8000.500甲硫氨酸0.2000.200苯丙氨酸0.4000.250脯氨酸0.6000.300絲氨酸2.0002.000蘇氨酸0.8000.400色氨酸0.0800.080酪氨酸2na0.4000.200l-纈氨酸0.8000.400表3續(xù)表4表4續(xù)在本文公開的本發(fā)明的描述和實踐的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它實施方式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。說明書和實施例僅被考慮為示例性的，本發(fā)明的真實范圍和宗旨將由隨后的權(quán)利要求書指出。以下內(nèi)容對應(yīng)于母案申請中的原始權(quán)利要求書，現(xiàn)作為說明書的一部分并入此處：1.生產(chǎn)bmp-2的方法，所述方法包括以下步驟：i)在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2的dna分子的合適的宿主細胞，所述的培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.25μm的鐵、聚陰離子化合物，并且若存在吡哆醛，所述吡哆醛占所述培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；并ii)回收感興趣的蛋白，其中在具有大于大約3l的容量的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述宿主細胞。2.根據(jù)項1的方法，其中所述鐵的濃度為至少大約5μm。3.根據(jù)項1的方法，其中所述培養(yǎng)基能支持至少大約2x106個細胞/ml的收獲密度。4.根據(jù)項1的方法，其中所述培養(yǎng)基中還包含選自由吡哆素、吡哆胺、吡哆素5’-磷酸酯、吡哆胺5’-磷酸酯構(gòu)成的組的至少一種維生素b6。5.根據(jù)項4的方法，其中所述培養(yǎng)基具有至少大約15μm的總的維生素b6濃度。6.根據(jù)項4的方法，其中所述培養(yǎng)基具有小于1.2的吡哆醛與吡哆素的比率。7.根據(jù)項6的方法，其中吡哆醛與吡哆素的所述比率小于0.4。8.根據(jù)項1的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約10nm的銅。9.根據(jù)項1的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約0.2μm的鋅。10.根據(jù)項1的方法，其中所述聚陰離子化合物是右旋糖酐硫酸酯。11.根據(jù)項10的方法，其中所述右旋糖酐硫酸酯以至少大約10mg/l的濃度存在。12.根據(jù)項10的方法，其中所述右旋糖酐硫酸酯以至少大約100mg/l的濃度存在。13.根據(jù)項11的方法，其中所述右旋糖酐硫酸酯具有大約5,000至500,000g/摩爾之間的分子量。14.根據(jù)項13的方法，其中所述右旋糖酐硫酸酯具有大約7,000g/摩爾的分子量。15.根據(jù)項1的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含總濃度為至少大約20mm的氨基酸。16.根據(jù)項15的方法，其中所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約0.5mm的l-胱氨酸。17.根據(jù)項16的方法，其中所述培養(yǎng)基包含濃度為至多大約0.3mm的l-谷氨酸。18.根據(jù)項1的方法，其中所述的培養(yǎng)基具有大約260至360mosm之間的初始滲透壓。19.根據(jù)項1的方法，其中所述bmp-2是哺乳動物bmp-2。20.根據(jù)項19的方法，其中所述哺乳動物bmp-2是人類bmp-2(hbmp-2)。21.根據(jù)項20的方法，其中所述人類bmp-2是重組的(rhbmp-2)。22.根據(jù)項1的方法，其中所述合適的宿主細胞選自由cos細胞、cho細胞、bhk細胞、balb/c3t3細胞或293細胞構(gòu)成的組。23.根據(jù)項22的方法，其中所述合適的宿主細胞是cho細胞。24.根據(jù)項23的方法，其中所述cho細胞具有降低的dhfr基因表達。25.根據(jù)項1的方法，其中所述在具有至少大約160l的容量的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)合適的宿主細胞。26.根據(jù)項25的方法，其中所述生物反應(yīng)器具有至少大約500l的容量。27.根據(jù)項26的方法，其中所述生物反應(yīng)器具有至少大約2,500l的容量。28.根據(jù)項27的方法，其中所述生物反應(yīng)器具有至少大約12,000l的容量。29.根據(jù)項27的方法，其中通過分批重新進料、補料分批或灌注法來培養(yǎng)所述宿主細胞。30.根據(jù)項29的方法，其中通過分批重新進料來培養(yǎng)所述宿主細胞。31.根據(jù)項30的方法，其中在基本恒定的溫度下培養(yǎng)所述宿主細胞。32.根據(jù)項31的方法，其中所述溫度為大約36-38℃。33.根據(jù)項1的方法，還包括在丁基瓊脂糖凝膠樹脂上純化所述bmp-2的步驟。34.根據(jù)項33的方法，其中所述純化還包括下述步驟：將含有所述bmp-2的條件培養(yǎng)基應(yīng)用至肝素樣樹脂，獲得含有所述bmp-2的流出液，并將所述流出液應(yīng)用至丁基瓊脂糖凝膠樹脂。35.生產(chǎn)bmp-2的方法，所述方法包括以下步驟：i)在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2蛋白的dna分子的合適的宿主細胞，所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.5μm的鐵、聚陰離子化合物和濃度為至少大約15μm的維生素b6，并且若存在吡哆醛，所述吡哆醛占所述培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；并ii)回收bmp-2蛋白，其中在具有大于大約3l的容量的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述宿主細胞。36.根據(jù)項35的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約10nm的銅。37.根據(jù)項35的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約0.2μm的鋅。38.根據(jù)項35的方法，其中所述宿主細胞是cho細胞。39.根據(jù)項35的方法，其中所述bmp-2是rhbmp-2。40.根據(jù)項35的方法，其中所述聚陰離子化合物是濃度為至少大約10mg/l的右旋糖酐硫酸酯。41.根據(jù)項35的方法，其中所述培養(yǎng)基包含總濃度為至少大約20mm的氨基酸。42.根據(jù)項41的方法，其中所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約0.5mm的l-胱氨酸。43.根據(jù)項42的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含濃度為至多大約0.3mm的l-谷氨酸。44.根據(jù)項35的方法，其中所述培養(yǎng)基具有在大約260至360mosm之間的初始滲透壓。45.生產(chǎn)bmp-2的方法，所述方法包括以下步驟：i)在分批重新進料工藝中，在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2蛋白的dna分子的cho細胞，所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.5μm的鐵、濃度為至少大約10nm的銅、總濃度為至少大約20mm的氨基酸、濃度為至少大約0.5mm的l-胱氨酸、濃度為至少大約10mg/l的右旋糖酐硫酸酯和濃度為至少大約15μm的維生素b6，并且若存在吡哆醛，所述吡哆醛占所述培養(yǎng)基中維生素b6的摩爾濃度的少于大約55％；并ii)回收bmp-2蛋白，其中在具有至少大約160l的容量的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述宿主細胞。46.根據(jù)項45的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含濃度為至少大約0.2μm的鋅。47.生產(chǎn)bmp-2的方法，所述方法包括以下步驟：i)在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼bmp-2的dna分子的合適的宿主細胞，所述培養(yǎng)基包含濃度為至少大約2.25μm的鐵、聚陰離子化合物，并且若存在吡哆醛，所述吡哆醛以小于大約15μm的濃度存在；并ii)回收需要的蛋白，其中在具有大于大約3l的容量的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述宿主細胞。48.根據(jù)項1到31或35到47中任何一項的方法，還包括純化所述bmp-2的步驟。49.根據(jù)項48的方法，還包括將經(jīng)純化的bmp-2配制為藥物的步驟。50.通過項1到49中的任何一項的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。51.含項50的產(chǎn)品的藥物制劑。52.項50的產(chǎn)品用于制備用于治療骨組織缺陷、損傷、疾病或病癥的患者的藥劑的用途。當(dāng)前第1頁12