本發(fā)明涉及他克莫司生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種提高他克莫司產(chǎn)量的發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

他克莫司(fk506)是一種由鏈霉菌產(chǎn)生的新型23元大環(huán)內(nèi)酯聚酮類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，其效力比應(yīng)用較廣的環(huán)孢霉素a(cyclosporina，csa)高近100倍，而毒副作用比環(huán)孢素a更少，還具有低死亡率、高移植存活率、依賴性小等優(yōu)點(diǎn)。

他克莫司廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風(fēng)、nethenton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療。目前臨床應(yīng)用于預(yù)防肝臟或腎臟移植術(shù)后的移植物排斥反應(yīng)，治療肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實(shí)體器官移植術(shù)后應(yīng)用其他免疫抑制藥物無(wú)法控制的移植物排斥反應(yīng)。然而受制于他克莫司發(fā)酵水平較低、生產(chǎn)成本高等因素，很多器官移植患者在經(jīng)濟(jì)上無(wú)法接受，導(dǎo)致其推廣應(yīng)用受到了一定的限制。

目前針對(duì)他克莫司產(chǎn)量低下的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外展開(kāi)了一系列的研究，從實(shí)驗(yàn)效果來(lái)看，菌種選育無(wú)疑是一種能夠有效提高他克莫司產(chǎn)量的方法。例如：王秀琴等采用通過(guò)復(fù)合誘變的方法對(duì)出發(fā)菌株筑波鏈霉菌進(jìn)行處理，得到一株高產(chǎn)菌株，其發(fā)酵產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高73.6%。鄭軍榮等應(yīng)用化學(xué)和物理誘變劑對(duì)他克莫司產(chǎn)生菌進(jìn)行菌種誘變，并利用莽草酸和哌可酸及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物作為選擇壓力篩選出高產(chǎn)突變株，相對(duì)發(fā)酵效價(jià)提高了約2倍。jung等通過(guò)逐漸提高培養(yǎng)基中他克莫司的濃度來(lái)增加菌株對(duì)產(chǎn)物的耐受性，最終獲得的菌株產(chǎn)量達(dá)到972mg/l。袁暉等通過(guò)紫外誘變加抗性篩選的方法處理產(chǎn)他克莫司的鏈霉菌，得到1株高產(chǎn)菌，其50l罐產(chǎn)量達(dá)到918mg/l。

但是菌種選育工作的不確定性高、工作強(qiáng)度大，并且選育的高產(chǎn)菌種始終面臨著生產(chǎn)能力退化的問(wèn)題，為他克莫司的生產(chǎn)埋下了不穩(wěn)定的隱患。因此有必要研究開(kāi)發(fā)新的方法，提高他克莫司的產(chǎn)量，以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種提高他克莫司產(chǎn)量的發(fā)酵方法，使得他克莫司的發(fā)酵產(chǎn)量明顯提高。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種提高他克莫司產(chǎn)量的發(fā)酵方法，在常規(guī)的他克莫司發(fā)酵過(guò)程中加入吸附樹(shù)脂以及流加補(bǔ)充糊精，所述吸附樹(shù)脂在發(fā)酵時(shí)間為48h～60h時(shí)加入，所述吸附樹(shù)脂的加入體積與發(fā)酵液體積比為0.001～0.1:1；所述流加補(bǔ)充糊精在發(fā)酵時(shí)間為1h～60h時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加，所述流加補(bǔ)充糊精的流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入0.5～3g糊精。

本發(fā)明采用新型發(fā)酵工藝，在恰當(dāng)?shù)陌l(fā)酵過(guò)程中加入有效量的可吸附他克莫司的樹(shù)脂，有效降低由于他克莫司的積累而引起對(duì)自身菌體的有害作用；同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)充糊精，保證發(fā)酵體系擁有充足的能量，延長(zhǎng)生產(chǎn)菌的生產(chǎn)周期，從而提高他克莫司產(chǎn)量。

所述吸附樹(shù)脂為中等極性大孔樹(shù)脂和/或非極性大孔樹(shù)脂。

優(yōu)選地，所述吸附樹(shù)脂包括但不限于xad16、hp20、hz801、hzd-3、sp850和hz830中的任一種或多種。最優(yōu)選地，所述吸附樹(shù)脂為xad16樹(shù)脂。

優(yōu)選地，所述吸附樹(shù)脂的加入體積與發(fā)酵液體積比為0.03～0.1:1。最有選地，所述吸附樹(shù)脂的加入體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1。

優(yōu)選地，所述流加補(bǔ)充糊精在發(fā)酵時(shí)間為48h～60h時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加。

優(yōu)選地，所述流加補(bǔ)充糊精的流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入1～2g糊精。更優(yōu)選地，所述流加補(bǔ)充糊精的流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入2g糊精。

以上所述他克莫司的發(fā)酵生產(chǎn)工藝得到的他克莫司。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供的他克莫司的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，包括以下改進(jìn)：1)添加特異性吸附他克莫司的吸附樹(shù)脂；2)發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)充糊精。在他克莫司發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)添加特異性吸附樹(shù)脂，這樣在發(fā)酵時(shí)吸附樹(shù)脂在達(dá)到吸附平衡之前將持續(xù)的吸附發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的他克莫司，降低產(chǎn)物在發(fā)酵液中的濃度，解決了他克莫司發(fā)酵時(shí)的反饋抑制作用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)液體發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司，提高他克莫司產(chǎn)量；另一方面，吸附樹(shù)脂經(jīng)過(guò)再生處理后可重復(fù)使用，從而進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。糊精的流加補(bǔ)充保證了發(fā)酵體系擁有充足的能量，延長(zhǎng)生產(chǎn)菌的生產(chǎn)周期，從而提高他克莫司產(chǎn)量。相比現(xiàn)有的發(fā)酵方法，本發(fā)明的發(fā)酵方法可以大大提高發(fā)酵產(chǎn)物他克莫司的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，具有非常好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋說(shuō)明，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

以下實(shí)施例和對(duì)比例中，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后加入xad16樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為1022mg/l。

實(shí)施例2

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后加入xad16樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入2g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為1248mg/l。

實(shí)施例3

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)60小時(shí)后加入hp20樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.001:1，同時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入1g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為663mg/l。

實(shí)施例4

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后加入hz801樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.03:1，同時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入3g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為779mg/l。

實(shí)施例5

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)1小時(shí)后開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。培養(yǎng)至48h時(shí)加入sp850樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.03:1。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為713mg/l。

實(shí)施例6

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后加入hzd-3樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為983mg/l。

實(shí)施例7

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后加入hz830樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為921mg/l。

對(duì)比例1

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾上述發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為492mg/l。

對(duì)比例2

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后加入xad16樹(shù)脂，樹(shù)脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾上述發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為873mg/l。

對(duì)比例3

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實(shí)消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時(shí)后開(kāi)始流加補(bǔ)充糊精，流加速度按每小時(shí)每100ml發(fā)酵液加入2g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結(jié)束發(fā)酵。使用濾布過(guò)濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹(shù)脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測(cè)解析液中他克莫司的含量，結(jié)果為603mg/l。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。