本申請(qǐng)為2011年12月20日提交的發(fā)明名稱為“sanglifehrin衍生物及其制備方法”的pct申請(qǐng)pct/gb2011/052524的分案申請(qǐng)，所述pct申請(qǐng)進(jìn)入中國國家階段日期為2013年8月20日，申請(qǐng)?zhí)?01180068004.8。

本發(fā)明涉及sanglifehrin類似物，其可用作親環(huán)素抑制劑，例如在治療病毒感染、特別是通過rna病毒如丙型肝炎病毒(hcv)和hiv的感染中，和/或作為免疫抑制劑例如用于預(yù)防移植排斥和作為抗炎劑例如用于炎癥性病癥。本發(fā)明還提供了其在醫(yī)療中使用的方法，尤其是用于治療hcv感染，以及用作免疫抑制劑或抗炎劑，或在產(chǎn)生進(jìn)一步在醫(yī)療上有用的化合物中用作中間體的方法。

背景技術(shù)：

丙型肝炎

丙型肝炎病毒(hcv)是正鏈rna病毒，其感染是輸血后肝炎的主要原因。hcv是最常見的慢性血液性感染，也是美國肝病死亡的主要原因。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)有超過1.7億慢性hcv感染攜帶者，約為世界人口的3％。在未治療的hcv感染患者中，約70％–85％發(fā)展成慢性hcv感染，從而具有發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌的高風(fēng)險(xiǎn)性。在發(fā)達(dá)國家，50-76％的肝癌和三分之二的肝移植均是由于慢性hcv感染導(dǎo)致(manns等,2007)。

除肝病外，慢性感染的患者還可能發(fā)展成其他慢性hcv相關(guān)的疾病，并成為向他人的傳染源。hcv感染引起非肝并發(fā)癥，例如關(guān)節(jié)痛(關(guān)節(jié)疼痛)、皮疹、以及內(nèi)臟器官損傷(主要是腎)。hcv感染代表了一類重要的全球健康保健負(fù)擔(dān)，而且當(dāng)前并無用于丙型肝炎的疫苗(strader等，2004；jacobson等2007；manns等,2007pawlotsky,2005；zeuzem&hermann,2002)。

hcv的治療

現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理(soc)是皮下注射peg化的干擾素-α(pifnα)和口服施用抗病毒藥物利巴韋林24-48周。治療成功的定義為持續(xù)的病毒響應(yīng)(svr)，其定義為在治療結(jié)束和6個(gè)月后血清中無hcvrna。soc的總體響應(yīng)率主要依賴于基因型和治療前hcvrna水平。患有基因型2和3的患者相比感染基因型1的患者更易對(duì)soc響應(yīng)(melnikova,2008；jacobson等,2007)。

大量hcv患者不能對(duì)soc治療產(chǎn)生充分應(yīng)答，或由于副作用不能耐受治療，導(dǎo)致整個(gè)過程中頻繁出現(xiàn)問題。soc的總體臨床svr率僅為約50％(melnikova,2008)。耐藥性的發(fā)展是治療失敗的另一潛在因素(jacobson等2007)。soc在某些不被視為治療候選患者中是禁忌的，例如以往有顯著抑郁或心臟病史的患者。通常導(dǎo)致治療中斷的soc副作用包括流感樣疾病、發(fā)燒、疲勞、血液學(xué)疾病、貧血、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、脫發(fā)和抑郁(manns等,2007)。

考慮到soc長(zhǎng)期治療的副作用、耐藥性的出現(xiàn)以及總成功率的差強(qiáng)人意，hcv感染治療亟需更有效和更安全的新治療方式。新治療的目的包括改進(jìn)的效果、改進(jìn)的毒性、改進(jìn)的耐藥性、改進(jìn)的生命質(zhì)量和最后改善患者的順應(yīng)性。hcv生命周期較短，因此在藥物治療期間產(chǎn)生耐藥性是很常見的。

目前正在開發(fā)新的、靶向特異性的丙肝(stat-c)抗病毒治療藥物，也稱為直接作用的抗病毒藥(daa)，其靶向病毒蛋白如病毒rna聚合酶ns5b或病毒蛋白酶ns3(jacobson等,2007；parfieniuk等,2007)。此外，還正在開發(fā)靶向人蛋白(例如親環(huán)素)而非病毒靶標(biāo)的新化合物，其預(yù)期能夠使藥物治療過程中耐藥性發(fā)生率降低(manns等,2007；pockros,2008；pawlotskyj-m,2005)。

親環(huán)素抑制劑

親環(huán)素(cyp)是一族細(xì)胞內(nèi)蛋白，其具有促進(jìn)蛋白構(gòu)象變化和折疊的肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶活性。cyp涉及細(xì)胞過程如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、蛋白分泌和線粒體功能。人感染期間，hcv病毒在其生命周期內(nèi)募集cyp。最初，認(rèn)為cyp刺激促進(jìn)rna復(fù)制的hcv非結(jié)構(gòu)蛋白ns5brna聚合酶的rna結(jié)合活性，但是還存在若干假說，包括需要cypppiase活性。cyp的各種同工型，包括a和b，被認(rèn)為與hcv的生命周期有關(guān)(yang等,2008；appel等,2006；chatterji等,2009；gaither等,2010)。在小鼠(colgan等,2000)和人t細(xì)胞(braaten和luban,2001)中產(chǎn)生敲除的能力表明cypa對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和生存而言是任選的。在細(xì)菌(herrler等,1994)、鏈孢霉屬(neurospora)(tropschug等,1989)和釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)(dolinski等1997)中觀察到cypa同系物中斷的類似結(jié)果，因此，抑制cyp代表了治療hcv感染的新的和有吸引力的宿主靶點(diǎn)，以及對(duì)現(xiàn)有soc或stat-c藥物的新的可能添加，其目的是增加svr，防止耐藥性出現(xiàn)并降低治療副作用。

已知環(huán)孢菌素a(inoue等2003)(“csa”)及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的非免疫抑制臨床類似物debio-025(paeshuyse等2006；flisiak等2008)、nim811(mathy等2008)和scy-635(hopkins等,2009)能結(jié)合親環(huán)素，其作為親環(huán)素抑制劑在hcv感染中顯示了體外和臨床的效果(crabbe等,2009；flisiak等2008；mathy等2008；inoue等,2007；ishii等,2006；paeshuyse等,2006)。雖然早期關(guān)于csa的耐藥性研究顯示hcvns5brna聚合酶中具有突變，表明僅親環(huán)素b與hcv復(fù)制有關(guān)(robida等,2007)，最近的研究表明親環(huán)素a在hcv復(fù)制過程中是必要的(chatterji等2009；yang等,2008)?？紤]到ns5a病毒蛋白中的突變同樣與csa耐藥性相關(guān)，并且ns5a與cypa和cypb都相互作用以產(chǎn)生特異性的肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(ppiase)活性，進(jìn)一步提出了這兩種親環(huán)素在病毒生命周期中的作用(hanoulle等,2009)。

環(huán)孢菌素類似物的抗hcv效應(yīng)獨(dú)立于依賴于鈣調(diào)磷酸酶的免疫抑制性質(zhì)。這表明cyp結(jié)合是hcv活性所必需的，而不需要鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合。臨床上最新的用于治療hcv的親環(huán)素抑制劑debio-025在體內(nèi)和體外顯示了對(duì)于四種最流行的hcv基因型(基因型1、2、3和4)的效果。耐藥性研究顯示，導(dǎo)致debio-025耐藥性的突變不同于聚合酶和蛋白酶抑制劑耐藥性所報(bào)道的突變，并且沒有與stat-c/daa抗性病毒復(fù)制子的交叉耐藥性。更重要的是，debio-025還能預(yù)防導(dǎo)致對(duì)蛋白酶和聚合酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的逃逸突變的形成(crabbe等,2009)。

然而，基于csa的親環(huán)素抑制劑在臨床開發(fā)上具有許多問題，這些問題被認(rèn)為與其共有的結(jié)構(gòu)類型相關(guān)，包括：某些能引起治療終止和限制臨床劑量水平的不良事件；能引起可變效能的可變藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)；以及能引起給藥問題的藥物之間相互作用的風(fēng)險(xiǎn)增加。

接受debio-025的患者最常見的不良事件(aes)包括黃疸、腹痛、嘔吐、疲勞和發(fā)熱。臨床上最重要的ae是高膽紅素血癥和血小板計(jì)數(shù)減少(血小板減少癥)。peg-ifn能引起顯著的血小板減少癥，與debio-025組合能產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床問題。有關(guān)nim-811的早期臨床研究已描述了膽紅素增加和血小板減少二者(ke等,2009)。盡管debio-025臨床研究中觀察到的高膽紅素血癥在治療停止后得以逆轉(zhuǎn)，但其導(dǎo)致了16名患者中有4名由于該原因終止治療，并且在未來的試驗(yàn)中使用的劑量下調(diào)。由于親環(huán)素抑制劑對(duì)hcv的抗病毒作用是劑量相關(guān)的，劑量下降導(dǎo)致抗病毒效果的下降，當(dāng)采用單一療法時(shí)，許多后續(xù)的基于csa的親環(huán)素抑制劑試驗(yàn)顯示hcv病毒載量無下降或下降很少(lawitz等,2009；hopkins等,2009；nelson等,2009)。debio-025和環(huán)孢菌素a已知是膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如膽鹽輸出泵和其他肝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑(尤其是mrp2/cmoat/abcc2)(crabbe等,2009)。已提出與膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尤其是mrp2的相互作用可能是高劑量debio-025下發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥的原因(nelson等,2009wring等,2010)。通過抑制其他藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如oat1b1和oat1b3的csa類相關(guān)的藥物-藥物相互作用(ddi)(konig等,2010)也可能是個(gè)問題，有可能限制某些組合和在經(jīng)受協(xié)同感染例如hiv治療的一些患者中的使用(seden等,2010)。

此外，debio-025和環(huán)孢菌素a是通過細(xì)胞色素p450(尤其是cyp3a4)代謝的底物，并且已知是人p-糖蛋白(mdr1)的底物和抑制劑(crabbe等,2009)。已顯示環(huán)孢菌素a是cyp3a4的體外抑制劑(niwa等,2007)。這表明與其他作為cyp3a4底物、誘導(dǎo)物或抑制劑的藥物例如酮康唑、西米替丁和利福平之間可能存在增加的藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)。此外，與由p糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物之間也可能發(fā)生相互作用(例如地高辛)，其在接受其他并發(fā)疾病的藥物治療的hcv患者中可能引起嚴(yán)重的藥物相互作用(crabbe等2009)。已知csa具有高度可變的藥代動(dòng)力學(xué)，早期制劑顯示口服生物利用度為1-89％(kapurtzak等,2004)。患者血濃度若得不到昂貴的監(jiān)測(cè)，可導(dǎo)致由血漿濃度升高導(dǎo)致的副作用發(fā)生增加，或由血漿濃度下降導(dǎo)致的臨床應(yīng)答減少。

考慮到親環(huán)素抑制代表了hcv治療的新的有希望的途徑，需要發(fā)現(xiàn)和開發(fā)更有效和安全的cyp抑制劑用于hcv感染的聯(lián)合治療。

sanglifehrin

sanglifehrina(sfa)及其天然同源物屬于一類混合的非核糖體肽/多聚酮化合物(polyketides)，由鏈霉菌屬物種a92-308110(也稱為dsm9954)產(chǎn)生(參見wo97/02285)，其最初基于其對(duì)親環(huán)素a(cypa)的高親和性而發(fā)現(xiàn)。sfa是發(fā)酵液中最豐富的成分，與csa相比，其對(duì)于cypa的親和性要高約20倍。由此說明sanglifehrin可能可用于治療hcv(wo2006/138507)。體外測(cè)試表明，相對(duì)于csa，sanglifehrin顯示更低的免疫抑制活性(sanglier等,1999；fehr等,1999)。sfa以高親和性結(jié)合cypa的csa結(jié)合位點(diǎn)(kallen等,2005)。

sanglifehrin的生物合成

sanglifehrins通過混合型聚酮合酶(pks)/非核糖體肽合成酶(nrp)生物合成(參見wo2010/034243,qu等,2011)。22-元大環(huán)內(nèi)酯骨架由聚酮碳鏈和三肽鏈組成。肽鏈由一個(gè)天然氨基酸、纈氨酸和通過酰胺鍵連接的兩個(gè)非天然氨基酸：(s)-間-酪氨酸和(s)-六氫噠嗪-3-羧酸(piperazicacid)組成。苯丙氨酸的羥基化(或者在nrps上原位或者在生物合成之前)以產(chǎn)生(s)-間-酪氨酸被認(rèn)為通過sfaa的基因產(chǎn)物發(fā)生。

sanglifehrin的免疫抑制性作用

sfa作用的免疫抑制機(jī)制不同于其他已知的結(jié)合親免素的免疫抑制藥物，例如csa、fk506和雷帕霉素。sfa不抑制作為csa靶標(biāo)的鈣調(diào)磷酸酶的磷酸酶活性(zenke等2001)，相反其免疫抑制活性歸于白介素6(hartel等,2005)、白介素12(steinschulte等,2003)的抑制和白介素2依賴性t細(xì)胞增殖的抑制(zhang&liu,2001)。然而，sfa發(fā)揮其免疫抑制效果所通過的分子靶標(biāo)和機(jī)制目前尚不清楚。

sfa的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其與cypa的相互作用被認(rèn)為很大程度上由分子的大環(huán)部分介導(dǎo)。實(shí)際上，由sfa氧化裂解產(chǎn)生的大環(huán)化合物(羥基大環(huán))已顯示對(duì)于cypa具有高親和性(sedrani等,2003)。x-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)已顯示，該羥基大環(huán)結(jié)合cypa的位點(diǎn)與csa相同?；趕fa大環(huán)部分的類似物同樣先前顯示缺乏免疫抑制性(sedrani等,2003)，這就提供了設(shè)計(jì)非免疫抑制cyp抑制劑用于hcv治療的機(jī)會(huì)。

與此相反，也有機(jī)會(huì)開發(fā)具有低毒性的免疫抑制劑，其用于例如預(yù)防移植排斥、自身免疫性、炎癥性和呼吸病癥，包括但不限于克羅恩病、貝赫切特綜合征、葡萄膜炎、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎綜合征、再生障礙性貧血(aplasticanaemia)、膽汁性肝硬化、哮喘、肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病(copd)和乳糜瀉的領(lǐng)域。sanglifehrin已顯示具有新的免疫抑制活性機(jī)理(zenke等,2001)，有可能通過樹突細(xì)胞趨化因子(immecke等,2011)起作用并且因此有機(jī)會(huì)開發(fā)具有與現(xiàn)行臨床試劑例如環(huán)孢菌素a、雷帕霉素和fk506不同的作用機(jī)理的試劑。

親環(huán)素抑制劑的其他治療用途

人免疫缺陷病毒(hiv)

親環(huán)素抑制劑如csa和debio-025已顯示在抑制hiv復(fù)制中具有潛在功效。親環(huán)素抑制劑被認(rèn)為在hiv逆轉(zhuǎn)錄的過程中/完成后干擾cypa的功能(ptak等,2008)。然而，當(dāng)臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)，debio-025僅分別使9名患者和2名患者的hiv-1rna水平下降≥0.5和>1log10拷貝/ml，而27名治療的患者未顯示hiv-1rna水平的下降(steyn等,2006)。隨后，debio-025在hcv/hiv共感染患者中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，顯示對(duì)hcv具有較好的效果，hiv臨床試驗(yàn)中斷(參見watashi等,2010)。

hiv的治療

世界范圍內(nèi)有3000萬人以上感染hiv-1，每年新增300萬例。自引入高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后(haart)(schopman等,2010)，治療選擇顯著改善。到2008年，已批準(zhǔn)約25種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物用于治療hiv-1，包括9種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nrti)、4種非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)、9種蛋白酶抑制劑(pi)、1種融合抑制劑、1種ccr5抑制劑和1種整合酶抑制劑(shafer和schapiro,2008)。然而，現(xiàn)有方案無一不能導(dǎo)致病毒的完全清除，其能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，而且抗病毒耐藥性依然是一個(gè)主要的問題。因此，仍然需要新的抗病毒治療劑，尤其是作用機(jī)制不同于現(xiàn)有批準(zhǔn)類型的藥物，例如親環(huán)素抑制劑。

乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒是肝dna病毒科家族的dna病毒，是乙型肝炎的病原體。與hcv和hiv不同，鮮有關(guān)于親環(huán)素抑制劑對(duì)乙型肝炎病毒的活性的報(bào)道。ptak等2008描述了debio-025對(duì)hbv的弱活性(ic504.1μm)，而xie等,2007描述了csa對(duì)于hbv的一些活性(ic50>1.3μg/ml)。這與hiv和hcv的情況大不相同，后者有眾多關(guān)于親環(huán)素抑制劑的納摩爾濃度級(jí)的抗病毒活性報(bào)道。

hbv的治療

hbv在世界范圍內(nèi)感染4億人群，是慢性病毒性肝炎和肝細(xì)胞癌的主要原因。2008年為止有6種藥物經(jīng)批準(zhǔn)用于治療hbv；干擾素α和peg化的干擾素α，三種核苷類似物(拉米夫定、恩替卡韋和特比夫定(telbivudine))和一種核苷酸類似物(阿德福韋二匹伏酯)。然而，由于耐藥性的高發(fā)率、耐受性較低和可能的副作用，需要新的治療選擇(ferir等,2008)。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mptp)的抑制

線粒體上高電導(dǎo)通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的打開引發(fā)了線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mpt)。這是導(dǎo)致氧化應(yīng)激、ca²⁺毒性和缺血/再灌注后肝細(xì)胞壞死和凋亡的原因。通過親環(huán)素抑制劑抑制親環(huán)素d(也稱為親環(huán)素f)已顯示能阻斷通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放，保護(hù)細(xì)胞在這些應(yīng)激后得以存活。親環(huán)素d抑制劑因此可用于涉及mptp開放的適應(yīng)癥，例如肌營養(yǎng)不良癥，尤其是ullrich先天性肌營養(yǎng)不良癥和bethlem肌病(millay等,2008,wo2008/084368,palma等,2009)、多發(fā)性硬化癥(forte等,2009)、糖尿病(fujimoto等,2010)、肌萎縮性側(cè)索硬化(martin2009)、雙相性精神障礙(kubota等,2010)、阿爾茨海默病(du和yan,2010)、亨廷頓舞蹈病(perry等,2010)、心肌梗塞后恢復(fù)(gomez等,2007)和慢性飲酒(king等,2010)。

其他治療用途

親環(huán)素抑制劑對(duì)于其他病毒具有潛在活性，因此可用于治療其感染，例如水痘-帶狀皰疹病毒(ptak等,2008)、甲型流感病毒(liu等,2009)、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合征冠狀病毒和其他人類和貓冠狀病毒(chen等,2005,ptak等,2008)、登革熱病毒(kaul等,2009)、黃熱病病毒(qing等,2009)、西尼羅病毒(qing等,2009)、西方馬腦炎病毒(qing等,2009)、巨細(xì)胞病毒(kawasaki等,2007)和痘苗病毒(castro等,2003)。

已有關(guān)于親環(huán)素抑制劑和親環(huán)素抑制在其他治療領(lǐng)域的用途的報(bào)道，例如在癌癥治療中(han等,2009)。

對(duì)sanglifehrin的一般評(píng)論

化合物例如sanglifehrin的藥物開發(fā)中的問題之一是快速代謝和葡萄苷酸化，導(dǎo)致低口服生物利用度。這可導(dǎo)致增加的食物效應(yīng)機(jī)會(huì)、更頻繁的從劑型中的不完全釋放和更高的患者間差異性。

因此仍然有需要鑒定新的親環(huán)素抑制劑和抗炎劑，其尤其可用于治療hcv感染和抗炎疾患，還可用于治療其他親環(huán)素抑制有效的疾病，例如hiv感染、肌營養(yǎng)不良癥或有助于心肌梗塞之后的恢復(fù)或免疫抑制是有效的的情形。優(yōu)選地，所述親環(huán)素抑制劑相對(duì)于現(xiàn)有的親環(huán)素抑制劑具有改善的性質(zhì)，包括一種或多種下列性質(zhì)：更長(zhǎng)的半衰期或增加的口服生物利用度，這可能通過減少的p450代謝和/或減少的葡萄苷酸化實(shí)現(xiàn)；改善的水溶解性；改善的對(duì)hcv的效能；降低的毒性(包括肝毒性)；改善的藥理學(xué)性質(zhì)，例如對(duì)靶器官的高度暴露(例如在hcv的情況下是肝)和/或長(zhǎng)的半衰期(使給藥頻率更低)；減少的藥物相互作用，例如通過降低cyp3a4代謝和抑制水平以及減少的(pgp)抑制(使得能夠?qū)崿F(xiàn)多藥物組合)，和改善的副作用特征，例如與mrp2的低結(jié)合，使高膽紅素血癥幾率下降；較低的免疫抑制效應(yīng)；改善的對(duì)耐藥性病毒株的活性，尤其是耐csa和csa類似物(例如debio-025)病毒株；以及更高的治療(和/或選擇性)指數(shù)。本發(fā)明公開了新的sanglifehrin類似物，其可具有一種或多種上述性質(zhì)。具體而言，本發(fā)明公開了新的突變合成的sanglifehrin類似物，其在至少一些實(shí)施方案中具有減少的通過p450的代謝或葡萄苷酸化，例如通過增加的微粒體半衰期所示，和/或具有改善的對(duì)hcv的效力，例如通過低復(fù)制子ec50和/或增加的選擇性指數(shù)所示。

還需要開發(fā)新的免疫抑制劑，其可在預(yù)防移植排斥中、或在治療自身免疫性、炎癥性和呼吸病癥中具有效用。優(yōu)選地，此類免疫抑制劑相對(duì)于已知天然sanglifehrin具有改善的性質(zhì)，包括一種或多種下列性質(zhì)：更長(zhǎng)的半衰期或增加的口服生物利用度，這可能通過減少的p450代謝和/或減少的葡萄苷酸化實(shí)現(xiàn)；改善的水溶解性；改善的在免疫抑制活性方面的效力，例如可在t細(xì)胞增殖測(cè)定中觀察到；降低的毒性(包括肝毒性)；改善的藥理學(xué)性質(zhì)，例如對(duì)靶器官的高度暴露和/或長(zhǎng)的半衰期(使給藥頻率更低)；減少的藥物-藥物相互作用，例如通過降低cyp3a4代謝和抑制水平以及減少的(pgp)抑制(易于實(shí)現(xiàn)多藥物組合)和改善的副作用特征。本發(fā)明公開了新的sanglifehrin類似物，其可具有一種或多種上述性質(zhì)。具體而言，本發(fā)明公開了新的sanglifehrin類似物，其在至少一些實(shí)施方案中具有減少的通過p450的代謝或葡萄苷酸化，例如通過增加的微粒體半衰期所示，和/或具有改善的免疫抑制性效力，例如通過低t細(xì)胞增殖ec50所示。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了新的sanglifehrin類似物，其通過突變合成產(chǎn)生。這些類似物可通過將間酪氨酸類似物飼喂至產(chǎn)sanglifehrin生物體例如鏈霉菌屬的種a92-308110(也稱為dsm9954)而產(chǎn)生，或更優(yōu)先地，通過將間酪氨酸類似物飼喂至產(chǎn)sanglifehrin生物體的遺傳工程衍生物(其中sfaa或sfaa同源物是失活或缺失的)而產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了突變合成的sanglifehrin類似物、用于制備這些化合物的方法以及這些化合物作為藥物或生產(chǎn)其他化合物的中間體的用途。

因此，本發(fā)明第一方面提供了根據(jù)下式(i)或式(ii)的突變合成的sanglifehrin類似物及其衍生物，或其可藥用的鹽：

其中：

r1、r2、r3、r4和r5獨(dú)立地表示h、f、cl、br、c2-6鏈烯基或c1-10烷基，其中所述烷基的一個(gè)或多個(gè)碳原子任選地被選自o、n和s(o)p的雜原子替換，其中p表示0、1或2且其中所述烷基的一個(gè)或多個(gè)碳原子任選地被羰基替換且其烷基可任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代；

x1、x2、x3、x4和x5獨(dú)立地表示c或n，且在表示n的任何這些基團(tuán)的情況下所連接的取代基不存在；

條件是其中r1、r3、r4和r5均表示h且x1、x2、x3、x4和x5均表示c，則r2不能表示oh；

包括其任何互變異構(gòu)體；或其異構(gòu)體，其中顯示為反式的c26、27位c＝c處的c＝c鍵(參考sanglifehrina的結(jié)構(gòu))為順式；并且包括其甲醇加成物，其中通過c-53酮和c-15羥基以及甲醇的結(jié)合形成縮酮。

上述結(jié)構(gòu)顯示了代表性的互變異構(gòu)體，本發(fā)明包括式(i)化合物的所有互變異構(gòu)體，例如圖示為烯醇化合物的酮化合物，反之亦然。

包括在式(i)定義中的特定互變異構(gòu)體是(i)c-53酮與c-15羥基形成半縮酮，或(ii)c-15和c-17羥基可與c-53酮組合形成縮酮。這里所有的編號(hào)使用母體sanglifehrina結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)。

定義

本文所用冠詞“一種”和“一個(gè)”是指所述冠詞的語法對(duì)象的一個(gè)或一個(gè)以上(即至少一個(gè))。例如“一種類似物”表示一種類似物或一種以上類似物。

本文所用術(shù)語“類似物”是指結(jié)構(gòu)上與另一種化合物類似的化合物，但在組成上有輕微差異(例如一個(gè)原子由另一個(gè)替換，或特定官能團(tuán)的存在或不存在)。

本文所用術(shù)語“炎性病癥”是指由炎癥引起的病癥的列表，包括但不限于尋常痤瘡、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、自身免疫性疾病(如急性彌散性腦脊髓炎(adem)、艾迪生病、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂抗體綜合征(aps)、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病(autoimmuneinnereardisease)、大皰性類天皰瘡、乳糜瀉(coaliacdisease)、查加斯病、慢性阻塞性肺疾病(copd)、克羅恩病、皮肌炎、1型糖尿病、子宮內(nèi)膜異位癥、古德帕斯丘綜合征、格雷夫斯病、吉蘭-巴雷綜合征、橋本氏病、化膿性汗腺炎、川崎氏病(kawasakidisease)、iga腎病變、特發(fā)性血小板減少性紫癜、間質(zhì)性膀胱炎、紅斑狼瘡、混合性結(jié)締組織病、硬斑病、多發(fā)性硬化(ms)、重癥肌無力、發(fā)作性睡眠、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、尋常型天皰瘡、惡性貧血、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、精神分裂癥、硬皮病、舍格倫綜合征、僵人綜合征、顳動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、白斑、韋格納肉芽腫病)、炎癥性腸疾病、盆腔炎癥性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和移植排斥。

本文所用術(shù)語“sanglifehrin(s)”是指結(jié)構(gòu)上類似sanglifehrina但在組成上有輕微差異的化合物(例如一個(gè)原子由另一個(gè)替換，或特定官能團(tuán)的存在或不存在)，尤其是通過鏈霉菌的種a92-308110發(fā)酵產(chǎn)生的那些。實(shí)例包括wo97/02285和wo98/07743中披露的sanglifehrin-樣化合物，例如sanglifehrinb。

本文所用術(shù)語“突變合成的sanglifehrin(s)”或“突變合成的sanglifehrin類似物”是指與sanglifehrina、b、c或d結(jié)構(gòu)類似但組成略微不同(如在一個(gè)或多個(gè)原子被另一個(gè)原子替換方面或在存在或缺少特定官能團(tuán)的情況下)的化學(xué)化合物，特別是通過鏈霉菌屬的種a92-308110或其突變體的發(fā)酵(其中培養(yǎng)物用間酪氨酸類似物飼喂)而產(chǎn)生的那些。

本文所用術(shù)語“間酪氨酸類似物”是指與間酪氨酸結(jié)構(gòu)類似但組成略微不同(如在一個(gè)或多個(gè)原子被另一個(gè)原子替換方面或在存在或缺少特定官能團(tuán)的情況下)的化學(xué)化合物，特別是在式(iii)中描述的那些。

本文所用術(shù)語“hcv”是指丙型肝炎病毒，是單鏈的rna包膜病毒，為黃病毒科(flaviviridae)成員。

本文所用術(shù)語“hiv”是指人類免疫缺陷病毒，是人獲得性免疫缺陷綜合征的病原體。

本文所用術(shù)語“生物利用度”是指施用后藥物或其他物質(zhì)在生物活性位點(diǎn)被吸收或可利用的程度或比率。該性質(zhì)依賴于多種因素，包括所述化合物的溶解性、胃腸道吸收速率、蛋白結(jié)合的程度和代謝等。本文中描述的各種生物利用度試驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(同樣參見egorin等2002)。

本申請(qǐng)中所用術(shù)語“水溶性”是指在水性介質(zhì)中的溶解性，例如ph7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，或5％的葡萄糖溶液。下文實(shí)施例部分“水溶性分析”給出了水溶性試驗(yàn)。

本發(fā)明化合物例如式(i)化合物的可藥用鹽包括從可藥用的無機(jī)或有機(jī)酸或堿形成的常規(guī)鹽，以及季銨的酸加成鹽。適當(dāng)?shù)乃峒映甥}的更具體例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羥基乙酸、甲酸、乳酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、棕櫚酸、丙二酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺羥基萘酸、氫碘酸、蘋果酸、硬脂酸、鞣酸的鹽等。尤其有價(jià)值的是鹽酸鹽。其他酸類例如草酸雖然本身不是可藥用的，但可用于制備獲得本發(fā)明化合物及其可藥用鹽的中間體的鹽。適當(dāng)?shù)膲A鹽的具體實(shí)例包括鈉、鋰、鉀、鎂、鋁、鈣、鋅、n,n'-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺和普魯卡因鹽。下文所述本發(fā)明的化合物包括式(i)的化合物及其可藥用的鹽。

本文所用術(shù)語“烷基”表示直鏈或支鏈的烷基。示例性烷基是c1-6烷基，例如c1-4烷基。

“鏈烯基”是指含有2個(gè)或多個(gè)碳原子的烷基，其被一個(gè)或多個(gè)雙鍵不飽和。

烷基的實(shí)例包括c1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基。鏈烯基的實(shí)例包括c2-4鏈烯基，例如–ch＝ch2和–ch2ch＝ch2。

術(shù)語“治療”包括預(yù)防性和治療性治療。

附圖說明

圖1：化合物結(jié)構(gòu)和sanglifehrina編碼系統(tǒng)

圖2：化合物14的¹hnmr

圖3：化合物15的¹hnmr

圖4：化合物16的¹hnmr

圖5：化合物17的¹hnmr

圖6：化合物18的¹hnmr

圖7：化合物19的¹hnmr

圖8：化合物20的¹hnmr

發(fā)明描述

如前所述，本發(fā)明提供了突變合成的sanglifehrin類似物、制備這些化合物的方法和醫(yī)療中使用這些化合物的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物是其甲醇加成物，其中通過c-53酮和c-15羥基以及甲醇結(jié)合形成縮酮。在另一個(gè)實(shí)施方案中，并非如此。

在某些實(shí)施方案中，r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)的碳原子被雜原子替換。

若-ch3被n替換，形成的基團(tuán)為–nh2。若-ch2-被n替換，形成的基團(tuán)為–nh-。若–chr-被n替換，形成的基團(tuán)為–nr-。因此r1、r2、r3、r4和r5中的氮原子可以是伯、仲或叔氮原子。

若-ch3被o替換，形成的基團(tuán)為–oh。

當(dāng)r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)的碳原子被雜原子替換時(shí)，其適當(dāng)?shù)乇籵、s或n、尤其是n或o、特別是o替換。

當(dāng)r1、r2、r3、r4和r5中的任一個(gè)含有基團(tuán)s(o)p時(shí)，變量p適當(dāng)?shù)乇硎?或1。在一個(gè)實(shí)施方案中，p表示0。在另一個(gè)實(shí)施方案中，p表示1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，p表示2。

當(dāng)r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)含有超過一個(gè)雜原子時(shí)，這些原子通常應(yīng)該被兩個(gè)或更多個(gè)碳原子隔開。

適當(dāng)?shù)?，r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)的碳原子未被任何雜原子替換，要不然表示oh或nh2。

當(dāng)r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)的碳原子被羰基替換時(shí)，羰基適當(dāng)?shù)匚挥诹硪惶荚踊虻优?。適當(dāng)?shù)?，羰基未位于硫或氧原子毗鄰?/p>

例如r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示–coc1-3烷基例如-come。

適當(dāng)?shù)?，r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)基團(tuán)的碳原子未被羰基替換。

r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示的c1-10烷基(例如c1-6烷基)可被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代。例如r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示–cf3?；蛘?，r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)可表示被一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè))cl或f原子取代的c1-10烷基(例如c1-6烷基)(例如–ch2ch2cl)。

適當(dāng)?shù)?，r1、r2、r3、r4和r5的c1-10烷基(例如c1-6烷基)未被鹵素取代。

當(dāng)r1、r2、r3、r4和r5基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)表示c1-10烷基(例如c1-6烷基)時(shí)，適當(dāng)?shù)卦摶鶊F(tuán)表示c1-4烷基(例如c1-2烷基如甲基)。

在一實(shí)施方案中，r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)表示c1-6烷基(如c1-2烷基)或c2-3鏈烯基例如r1、r2、r3、r4和r5中的一個(gè)或多個(gè)表示甲基。

適當(dāng)?shù)豶1表示h、f、cl、cf3、oh或c1-6烷基(例如甲基)。更適當(dāng)?shù)?，r1表示h或f，尤其是h。

適當(dāng)?shù)豶2表示h、f、cl、cf3、oh、nh2或c1-6烷基(例如甲基)。更適當(dāng)?shù)?，r2表示h、f、oh或nh2，尤其是oh。

適當(dāng)?shù)豶3表示h、f、cl、cf3、oh或c1-6烷基(例如甲基)。更適當(dāng)?shù)?，r3表示h、me或f。r3也可表示乙基。

適當(dāng)?shù)豶4表示h、f、cl、cf3、oh或c1-6烷基(例如甲基)。更適當(dāng)?shù)?，r4表示h或f。

適當(dāng)?shù)豶5表示h、f、cl、cf3、oh或c1-6烷基(例如甲基)。更適當(dāng)?shù)?，r5表示h或f。

適當(dāng)?shù)豶1、r2、r3、r4或r5中的一個(gè)或更多個(gè)、更適當(dāng)?shù)貎蓚€(gè)或更多個(gè)(例如三個(gè)或更多個(gè))不表示h。

適當(dāng)?shù)豶1、r2、r3、r4或r5中的一個(gè)或更多個(gè)、例如兩個(gè)或更多個(gè)表示f。

適當(dāng)?shù)豶3或r4或r3和r4表示f。在另一個(gè)實(shí)施方案中，r1和r3表示f。

在一個(gè)實(shí)施方案中，x1表示n(因此r1不存在)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，x1表示c。

適當(dāng)?shù)豿2表示c。

適當(dāng)?shù)豿3表示c。

適當(dāng)?shù)豿4表示c。

適當(dāng)?shù)豿5表示c。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該化合物是式(i)化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該化合物是式(ii)化合物。

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示h，r4表示f，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示f，r4表示f，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示f，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示me，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示h，r3表示h，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示nh2，r3表示h，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示f，r3表示h，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示h，r4表示f，r5表示h，x1表示n且x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

其也可表示為：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示h，r4表示f，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示f，r4表示f，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示f，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示me，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示h，r3表示h，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示nh2，r3表示h，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示f、r3表示h，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh、r3表示et、r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示f，r2表示oh，r3表示f，r4表示h，r5表示h且x1、x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

在本發(fā)明的適合實(shí)施方案中，r1表示h，r2表示oh，r3表示h，r4表示f，r5表示h，x1表示n且x2、x3、x4和x5表示c，如由下列結(jié)構(gòu)表示：

其也可表示為：

在一些實(shí)施方案中，c26,27位處的雙鍵(參考sanglifehrina的結(jié)構(gòu))可呈順式，而不是反式。

通常，本發(fā)明化合物通過突變合成制備。

通常，用于制備式(i)或(ii)的某些化合物或其可藥用鹽的方法，其包括：

·用sanglifehrin生產(chǎn)者(如鏈霉菌屬的種a92-308110(也稱為dsm9954)或更優(yōu)選地，sfaa基因或sfaa基因同源物失活或缺失的sanglifehrin生產(chǎn)者的培養(yǎng)物接種發(fā)酵液；

·用間酪氨酸類似物(如示于式(iii))飼喂發(fā)酵液

·允許發(fā)酵繼續(xù)直至產(chǎn)生sanglifehrin類似物

·提取和分離sanglifehrin類似物

其中r7表示h或酯形成基團(tuán)如烷基基團(tuán)，例如c1-6烷基如me。

適合地式(iii)中的x1、x2、x3、x4、x5、r1、r2、r3、r4和r5基團(tuán)如對(duì)于式(i)和(ii)的化合物所定義。

供料可以是式(iii)化合物的外消旋形式或l-形式。

式(iii)化合物或者商購可得或者通過標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)合成化學(xué)技術(shù)來制備。制備式(iii)化合物的一種通用路徑如下列流程1所示：

流程1：a)使式(iv)的醛與適合片段例如(r7o)2p(o)ch(nhpg)co2r7偶聯(lián)，b)如有需要，氫化和脫保護(hù)。pg＝保護(hù)基。

式(iv)的醛可商購可得或容易地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員合成。保護(hù)和脫保護(hù)化學(xué)可需要用于從式(iv)化合物產(chǎn)生式(iii)化合物。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知并且適合的保護(hù)基描述于greene’sprotectivegroupsinorganicsynthesis(wuts和greene,第4版,2007)中。

除了本文提供的具體方法和參考之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可請(qǐng)教用于合成方法的標(biāo)準(zhǔn)科教書參考，包括但不限于vogel’stextbookofpracticalorganicchemistry(furniss等,1989)和march’sadvancedorganicchemistry(smith和march,2001)中。

根據(jù)本發(fā)明的突變合成的sanglifehrin類似物可單獨(dú)地或與其他治療劑組合施用。兩種(或更多種)試劑的共施用可允許較低劑量的待使用的每種試劑，因此降低副作用可獲得改善的效力，由此更高的svr以及耐藥性的降低。

因此在一個(gè)實(shí)施方案中，突變合成的sanglifehrin類似物與一種或多種用于治療hcv感染的治療劑共施用，所述治療劑來自于護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn)。這可以是干擾素(例如pifnα和/或利巴韋林)。

在一個(gè)替代實(shí)施方案中，突變合成的sanglifehrin類似物與一種或多種其他抗病毒劑共施用，如stat-c/daa(用于治療hcv的特異性靶向藥物)，其可以是一種或多種以下抑制劑：非核苷聚合酶抑制劑(例如idx375、vch-222、bi207127、ana598、vch-916)、核苷或核苷酸聚合酶抑制劑(例如2’-c-甲基胞苷、2’-c-甲基腺苷、r1479,psi-6130、r7128、r1626)、蛋白酶抑制劑(例如biln-2061、vx-950(替拉瑞韋(telaprevir))、sch503034(波普瑞韋(boceprevir))、tmc435350、mk-7009、r7227/itmn-191、ea-058、ea-063)或病毒進(jìn)入抑制劑(例如pro206)。

制劑可以方便地以單位劑型呈遞，并可通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備。所述方法包括將活性成分(本發(fā)明的化合物)與載體混合的步驟，所述載體由一種或多種輔助成分構(gòu)成。通常，所述制劑可通過將活性成分與液相載體或精細(xì)粉碎的固相載體或兩者均勻且充分地混合而制備，如果需要的話，隨后使產(chǎn)物成型。

本發(fā)明的化合物通常以包含活性成分(任選以無毒有機(jī)或無機(jī)酸或堿加成鹽形式)的藥物制劑形式、以可藥用的劑型口服施用。根據(jù)所治療的病癥和患者，以及施用途徑，所述組合物可以以不同劑量施用。

例如，本發(fā)明的化合物可以以片劑、膠囊、胚珠(ovules)、酏劑、溶液或混懸液的形式口服、經(jīng)頰或舌下施用，其可以含有矯味劑或著色劑，用于即釋、緩釋或控釋應(yīng)用。

所述片劑可含有賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸，崩解劑例如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、羥乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽，以及顆粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥丙基纖維素(hpc)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外還可包括潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油山崳酸酯和滑石。

可使用類似類型的固相組合物用作明膠膠囊的填充劑。這方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳中的糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。對(duì)于水性混懸液和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可與多種甜味劑或矯味劑、著色劑或染料、乳化劑和/或混懸劑以及如水、乙醇、丙二醇和甘油及其組合的稀釋劑組合。

片劑可通過壓縮或模制制備，任選使用一種或多種輔助成分。壓縮片劑可通過在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中壓縮活性成分制備，其中活性成分是自由流動(dòng)的形式，例如粉末或顆粒，任選與粘合劑(例如聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。模制片劑可通過在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末化化合物的混合物制備。片劑任選地被包衣或刻痕，可配制以提供活性成分的緩釋或控釋，例如用不同比例的羥丙基甲基纖維素來提供需要的釋放性質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的適合口服施用的制劑可以是離散的單位形式，例如膠囊、扁囊劑或片劑，其各自含有預(yù)定量的活性成分；粉末或顆粒；在水性液體或非水性液體中的溶液或混懸液；或作為水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑?；钚猿煞忠部梢允谴笸鑴?、藥糖劑(electuary)或糊劑。

應(yīng)當(dāng)理解，除上述具體提到的成分外，本發(fā)明的制劑可包括其他本領(lǐng)域的常規(guī)試劑，其依據(jù)所考慮制劑的類型而定，例如適于口服施用的制劑可包括矯味劑。

有益地，如防腐劑和緩沖劑的試劑可溶于載體。為提高穩(wěn)定性，組合物可在填充至容器中后冷凍，在真空下除去水分。隨后將無水凍干粉末密封在小瓶中，并可提供用于在使用前重構(gòu)液體的附加的一小瓶注射用水。

本發(fā)明化合物施用的劑量根據(jù)具體的化合物、涉及的疾病、患者以及所述疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度和患者的身體條件以及所選擇的施用途徑而不同。適當(dāng)?shù)膭┝靠捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員方便的確定。

根據(jù)施用的方法，所述組合物可含有0.1％重量、優(yōu)選5-60％、更優(yōu)選10-30％重量的本發(fā)明的化合物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明化合物的最優(yōu)量和各劑量的施用間隔將由所治療病癥的性質(zhì)和程度；施用的形式、途徑和位點(diǎn)；以及所治療的特定個(gè)體的年齡和狀況決定，并且醫(yī)生將最終確定使用的合適劑量。該劑量可酌情重復(fù)施用。如果出現(xiàn)副作用，可根據(jù)正常的臨床實(shí)踐調(diào)整或減少劑量和/或給藥頻率。

本發(fā)明的其他方面包括：

-根據(jù)本發(fā)明的化合物，其用作藥物；

-根據(jù)本發(fā)明的化合物，其用作治療病毒感染(尤其是rna病毒感染)例如hcv或hiv感染的藥物，用作抗炎劑或用于預(yù)防器官移植排斥；

-包含根據(jù)本發(fā)明的化合物和可藥用稀釋劑或載體的藥物組合物；

-包含根據(jù)本發(fā)明的化合物和可藥用稀釋劑或載體以及第二種或后續(xù)的活性成分的藥物組合物，所述第二種或后續(xù)的活性成分尤其是用于治療病毒感染例如hcv或hiv感染的活性成分，用作抗炎劑或用于預(yù)防器官移植排斥；

-治療病毒感染(尤其是rna病毒感染)例如hcv或hiv感染、用作抗炎劑或用于預(yù)防器官移植排斥的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康谋景l(fā)明化合物；

-根據(jù)本發(fā)明的化合物在制備用于治療病毒感染例如hcv或hiv感染、用作抗炎劑或用于預(yù)防器官移植排斥的藥物中的用途。

-用于產(chǎn)生突變合成的sanglifehrin(如式(i)或(ii)的化合物)的方法，其包括對(duì)產(chǎn)sanglifehrin細(xì)菌如鏈霉菌屬的種(例如a92-308110)飼喂式(iii)化合物或其鹽，并培養(yǎng)細(xì)菌以使產(chǎn)生突變合成的sanglifehrin。

-根據(jù)前述段落的方法，其中所述產(chǎn)sanglifehrin細(xì)菌是其中sfaa基因或sfaa基因同源物失活或缺失的鏈霉菌屬的種。

-根據(jù)前述兩個(gè)段落的方法，其進(jìn)一步包括分離突變合成的sanglifehrin的步驟。

新的式(iii)(如列于表1中的那些以及列于表1中的任何式(iii)化合物的酸和酯)和式(iv)的化合物(包括其鹽和酯)也形成本發(fā)明的方面。

通用方法

材料和方法

菌株和生長(zhǎng)條件

生產(chǎn)sanglifehrin的鏈霉菌屬的種a92-308110(dsm編號(hào)9954,購自dsmz,braunschweig,德國)也稱為biot-4253和biot-4370或其衍生物、例如biot-4585在培養(yǎng)基燕麥瓊脂、mam、isp4或isp2上于28℃維持(見下文)。

pkc1139(一種標(biāo)準(zhǔn)鏈霉菌屬-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒)獲自johninnescentre,uk并且其描述于bierman等人，1992和kieser等人，2000。

biot-4585在燕麥瓊脂上于28℃生長(zhǎng)7-10天。將瓊脂平板表面收集的孢子放入20％w/v無菌甘油的蒸餾水中，以0.5ml的量分存于-80℃。使用冷凍的孢子儲(chǔ)存液接種種子培養(yǎng)基sgs或sm25-3。將接種的種子培養(yǎng)基在200和300rpm之間以5.0或2.5cm振幅(throw)在27℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。用2.5％-10％種子培養(yǎng)基接種發(fā)酵培養(yǎng)基sgp-2或bt6，在200和300rpm之間以5.0或2.5cm振幅在24℃振蕩培養(yǎng)4-5天。隨后收集培養(yǎng)物用于提取。

間酪氨酸類似物

(2s)-2-氨基-3-(6-羥基(2-吡啶基))丙酸甲酯、l-3-氨基苯基丙氨酸甲酯、l-4-甲基-間酪氨酸甲酯、l-4-氟-間酪氨酸甲酯和l-4,5-二氟-間酪氨酸甲酯購自netchem(usa)。

dl-3-氟苯基丙氨酸和l-苯基丙氨酸購自sigma(uk)。

dl-間酪氨酸購自fluorochem(uk)。

l-間酪氨酸購自alfaaesar(uk)。

dl-4-氟間酪氨酸(8)、dl-5-氟間酪氨酸(9)、2-氨基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10)、2-氨基-3-(2-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(11)、2-氨基-3-(2-氟-3-羥基苯基)丙酸甲酯(12)和2-氨基-3-(2,6-二氟-3-羥基苯基)丙酸甲酯(13)如下合成：

dl-4-氟間酪氨酸(8)

在-70℃向8-1(3g，19.5mmol)在干燥dcm(150ml)中的溶液滴加bbr3(4m于dcm中，14.6ml，58.5mmol)。加入后，將反應(yīng)混合物在-20℃攪拌3h，小心加入冰水，用dcm萃取。用水和鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，過濾，濃縮。通過快速硅膠色譜純化殘余物，得到所需化合物8-2。

在室溫向8-2(0.9g，6.4mmol)在丙酮(40ml)中的溶液加入k2co3(2.2g，16mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。加入水，在真空下除去丙酮，然后用etoac萃取，用水和鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，過濾，濃縮。通過快速硅膠色譜純化殘余物，得到所需化合物8-3.

將8-3(1g，4.34mmol)、馬尿酸(860mg，4.80mmol)、naoac(400mg)和ac2o(2.2ml)的混合物在80℃攪拌2h。將黃色反應(yīng)混合物冷卻，加入冷的etoh(10ml)，將混合物在冰浴中冷卻15min，然后倒入30ml冰水，冷凍，通過過濾收集產(chǎn)物。在真空中干燥固體，獲得8-4。

將8-4(300mg，0.8mmol)和naoac(71mg，0.87mmol)在meoh(50ml)中的溶液在室溫?cái)嚢柽^夜。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘余物溶于50mletoac中，用水洗滌etoac溶液兩次，濃縮，得到8-5。

將8-5(360mg，0.89mmol)在meoh(50ml)中的溶液于標(biāo)準(zhǔn)壓力下在10％pd/c(77mg)上氫化20h。通過過濾除去催化劑后，蒸發(fā)溶劑，得到產(chǎn)物8-6。

將8-6(210mg)在3nhcl(10ml)中的溶液回流24h。將溶液濃縮至干，通過反相-combiflash純化殘余物，得到目標(biāo)產(chǎn)物8。

dl-5-氟間酪氨酸(9)和2-氨基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10)

在-78℃向9-1(20g，97.55mmol)在四氫呋喃(100ml)中的溶液滴加正丁基鋰(43ml，2.5m，107.3mmol)。將其攪拌30分鐘，在該溫度加入n,n-二甲基甲酰胺(15.1ml，195.1mmol)。將其再攪拌30分鐘，除去冷浴。1小時(shí)后，用飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)。用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌有機(jī)層，干燥(硫酸鈉)，過濾，濃縮。通過硅膠色譜純化殘余物，得到9-2。

在-70℃向9-2(6g，38.9mmol)在干燥dcm(200ml)中的溶液滴加bbr3(4m于dcm中，30ml，116.8mmol)。加入后，將反應(yīng)混合物在-20℃攪拌3小時(shí)，小心加入冰水，用dcm萃取。用水和鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，過濾，濃縮。通過快速硅膠色譜純化殘余物，得到所需化合物9-3。

在室溫向2-(芐氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷?；?乙酸甲酯(4.64g，14mmol)在dcm(150ml)中的溶液加入dbu(4.26g，28mmol)。10min后，加入9-3(1.95g，14mmol)，將所得混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。將溶液用etoac(150ml)稀釋，分離，將有機(jī)層用1nhcl洗滌，經(jīng)na2so4干燥，過濾，濃縮。通過快速硅膠色譜純化殘余物，得到9-4。

將9-4(1g)在meoh(20ml)中的溶液在標(biāo)準(zhǔn)壓力下于200mg10％pd/c上氫化過夜。通過過濾除去催化劑后，蒸發(fā)溶劑，得到10。

向10(300mg，1.4mmol)在etoh(30ml)中的溶液加入naoh水溶液(2n，4ml)，將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?0分鐘。除去溶劑，將殘余物用2nhcl中和至ph＝6，通過過濾收集形成的白色晶體，得到目標(biāo)化合物9。

2-氨基-3-(2-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(11)

在-78℃向化合物11-1(1.4g，9mmol)在50mldcm中的溶液滴加bbr3(4m于dcm中，3.6ml，13.5mmol)。加入后，將反應(yīng)在-20℃攪拌4小時(shí)。然后緩慢加入冰/水，分離各層，用水和鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。殘余物不經(jīng)進(jìn)一步純化即可用于下一步驟。

在室溫向2-(芐氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷?；?乙酸甲酯(3g，9mmol)在100mldcm中的溶液加入dbu(2.8g，18mmol)，10min后，加入化合物11-2(來自最后一步的粗化合物)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將溶液用dcm(50ml)稀釋，用1nhcl(20ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜純化殘余物(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到11-3。

將化合物11-3(500mg，1.5mmol)在meoh(20ml)中的混合物在標(biāo)準(zhǔn)壓力下于50mg10％pd/c上氫化過夜。通過過濾除去催化劑后，蒸發(fā)溶劑以得到粗產(chǎn)物，其通過反相-combiflash純化，得到11，為白色固體。

2-氨基-3-(2-氟-3-羥基苯基)丙酸甲酯(12)

在-78℃向化合物12-1(1.4g，9mmol)在50mldcm中的溶液滴加bbr3(4m于dcm中，3.6ml，13.5mmol)。加入后，將反應(yīng)在-20℃攪拌4小時(shí)。緩慢加入冰/水后，分離各層，用水和鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。殘余物不經(jīng)進(jìn)一步純化即可用于下一步驟。

在室溫向2-(芐氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷?；?乙酸甲酯(3g，9mmol)在100mldcm中的溶液加入dbu(2.7ml，18mmol)，10min后加入化合物12-2(來自最后一步的粗化合物)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將溶液用dcm(100ml)稀釋，用1nhcl(30ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)純化殘余物，得到12-3。

將化合物12-3(500mg，1.44mmol)在meoh(10ml)中的混合物在標(biāo)準(zhǔn)壓力下于100mg10％pd/c上氫化過夜。通過過濾除去催化劑后，蒸發(fā)溶劑以得到粗產(chǎn)物，其通過反相-combiflash純化，得到所需化合物12，為白色固體。

2-氨基-3-(2,6-二氟-3-羥基苯基)丙酸甲酯(13)

在0℃向2,4-二氟苯酚(2g，15.4mmol)在50mldmf中的溶液加入k2co3(3.2g，23.1mmol)和bnbr(2.2ml，18.5mmol)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入水(100ml)和ea(200ml)，將有機(jī)層用水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)純化殘余物，得到粗13-1。

在-78℃向化合物13-1(2g，9mmol)在10mlthf中的溶液滴加n-buli(4ml，2.5m)，攪拌30min。加入dmf(1.3g，0.018mmol)，再次攪拌30min。然后除去冷浴，將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，之后用水淬滅。將其用乙酸乙酯萃取(20mlx3)，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)純化殘余物，得到13-2，為黃色固體。

在室溫向2-(芐氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷?；?乙酸甲酯(728mg，2.2mmol)在20mldcm中的溶液加入dbu(319mg，2.1mmol)。10min后，加入化合物13-2(500mg，2mmol)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將溶液用dcm(50ml)稀釋，用1nhcl(20ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)純化殘余物，得到為黃色油狀物的13-3。

將在meoh(20ml)中的化合物13-3(600mg，1.32mmol)在標(biāo)準(zhǔn)壓力下于60mg10％pd/c上氫化過夜。通過過濾除去催化劑后，蒸發(fā)溶劑以得到粗產(chǎn)物，其通過反相-combiflash純化，得到所需化合物13，為白色固體。

培養(yǎng)基配方

用于制備培養(yǎng)基的水使用milliporeelixanalyticalgradewaterpurificationsystem制備。

sgs種子培養(yǎng)基

滅菌前ph用10mnaoh/10mh2so4調(diào)節(jié)至ph7.0

通過在121℃加熱20-30min來滅菌(高壓滅菌)

注意

*消泡劑僅在種子發(fā)酵罐中使用，而非種子培養(yǎng)瓶

**考慮接種體積相應(yīng)調(diào)節(jié)最終體積

痕量元素溶液b

sgp2生產(chǎn)培養(yǎng)基

滅菌前ph用10mnaoh調(diào)節(jié)至ph6.8

通過在121℃加熱20-30min來滅菌(高壓滅菌)

注意

*最終體積根據(jù)接種體積相應(yīng)調(diào)節(jié)

**消泡劑僅在發(fā)酵罐中使用，而非培養(yǎng)瓶

sm25-3培養(yǎng)基

成分

甘油(fisherscientific,g/0650/25)40g

大豆蛋白胨a3sc(organotechnie)10g

麥芽汁(difco)21g

至最終體積1l

滅菌前ph未經(jīng)調(diào)節(jié)(即ph7.0)

isp4培養(yǎng)基

成分

isp痕量鹽溶液1ml

瓊脂20g

至最終體積1l

以少量體積的冷水用淀粉制備糊劑并調(diào)至500ml體積

將其他成分加至在500ml水中的溶液ii，ph應(yīng)該在ph7.0至ph7.4之間(ph7.3)，將兩種溶液混合在一起并加入瓊脂

isp痕量鹽

成分

feso4.7h2o1g

mncl2.4h2o1g

znso4.7h2o1g

至最終體積1l

在4℃貯存

一般發(fā)酵方法

將冷藏保存的biot-4585孢子貯備液在室溫融化。通過在具有泡沫塞(foamplug)的2l錐形燒瓶中將4.0ml孢子貯備液轉(zhuǎn)移到400ml培養(yǎng)基sm25來制備營養(yǎng)培養(yǎng)物(種子培養(yǎng)物)。在27℃和250rpm(5.0cm振幅)下培養(yǎng)48小時(shí)。在具有泡沫塞的2l錐形燒瓶中將25ml種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到250ml生產(chǎn)培養(yǎng)基sgp2+5％hp20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培養(yǎng)24小時(shí)后，將2ml的所需前體在1m鹽酸中的250mm外消旋體或125mm對(duì)映異構(gòu)體純的溶液以及2ml的250mmdl-六氫噠嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每個(gè)生產(chǎn)燒瓶，得到最終濃度為1mm的前體的單獨(dú)對(duì)映異構(gòu)體。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下繼續(xù)再培養(yǎng)四天。

通過lc-uv和lc-uv-ms分析培養(yǎng)發(fā)酵液

加入培養(yǎng)發(fā)酵液(1ml)和乙酸乙酯(1ml)，混合15-30分鐘，隨后離心10分鐘。收集0.4ml有機(jī)層，蒸干，隨后重溶于0.20ml乙腈中。

hplc條件：

c18hyperclonebdsc18柱3u,4.6mmx150mm

配備phenomenexanalyticalc18安全預(yù)柱(kj0-4282)

柱溫50℃

流速1ml/min

uv監(jiān)測(cè)240nm

進(jìn)樣體積20ul

溶劑梯度：

0min：55％b

1.0min：55％b

6.5min：100％b

10.0min：100％b

10.05min：55％b

13.0min：55％b

溶劑a是水+0.1％甲酸

溶劑b是乙腈+0.1％甲酸

在這些條件下sfa在5.5min時(shí)洗脫

在這些條件下sfb在6.5min時(shí)洗脫

lcms在整合的agilenthp1100hplc系統(tǒng)與brukerdaltonicsesquire3000+電噴霧質(zhì)譜儀(陽離子模式)上進(jìn)行，使用前述的色譜和溶劑。

qclc-ms方法

hplc條件：

c18hyperclonebdsc18柱3u,4.6mmx150mm

裝有phenomenexanalyticalc18安全預(yù)柱(kj0-4282)

柱溫50℃

流速1ml/min

uv監(jiān)測(cè)210、240和254nm

溶劑梯度：

0min：10％b

2.0min：10％b

15min：100％b

17min：100％b

17.05min：10％b

20min：10％b

溶劑a是水+0.1％甲酸

溶劑b是乙腈+0.1％甲酸

ms條件

ms在切換模式操作(正和負(fù)之間切換)，從150掃描到1500amu.

體外分析lc-ms方法(例如用于微粒體穩(wěn)定性評(píng)估)

使用api-2000、api-4000或uplc儀器

hplc條件：

對(duì)于15：acquityuplcbehc18(2.1×50mm,1.7μm)

對(duì)于化合物5、14、16、17、18、19ultimatexb-c18(2.1×50mm,5μm)

柱溫50℃

流速0.6ml/min

溶劑梯度a1(例如用于化合物15)：

0.2min：20％b

0.6min：95％b

1.1min：95％b

1.15min：20％b

1.5min：停止

溶劑a是h2o-0.025％fa-1mmnh4oac

溶劑b是acn-0.025％fa-1mmnh4oac

溶劑梯度a2(例如用于化合物5、14、16、17、18、19)：

0.3min：10％b

0.8min：95％b

2.3min：95％b

2.31min：10％b

3.5min：停止

溶劑a是h2o-0.1％fa

溶劑b是meoh-0.1％fa

負(fù)掃描模式：

mrm設(shè)置：

躍遷[da]

211089.7→504.2

正掃描模式：

mrm設(shè)置：

用于評(píng)價(jià)hcv抗病毒活性的體外復(fù)制子測(cè)定

針對(duì)基因型1hcv的抗病毒效果可如下測(cè)定：在加入測(cè)試物前1天，將含有hcv基因型1bi389luc-ubi-neo/ns3-3’/5.1復(fù)制子的huh5.2細(xì)胞(vrolijk等,2003)在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基[dmem(目錄號(hào)41965039)，補(bǔ)充有10％fcs、1％非必需氨基酸(11140035)、1％青霉素/鏈霉素(15140148)和2％遺傳霉素(10131027)；invitrogen]中以1.3-1.4的比例傳代培養(yǎng)，在75ml組織培養(yǎng)瓶(technoplasticproducts)中生長(zhǎng)3-4天，收集并接種在測(cè)試培養(yǎng)基中(dmem,10％fcs,1％非必需氨基酸,1％青霉素/鏈霉素)，在96孔組織培養(yǎng)微量滴定板(falcon,becktondickinson用于評(píng)價(jià)抗代謝效應(yīng)，culturplate,perkinelmer用于評(píng)價(jià)抗病毒效應(yīng))中以密度6500細(xì)胞/孔(100μl/孔)接種。將微量滴定板溫育過夜(37℃,5％co2,95-99％相對(duì)濕度)，產(chǎn)生未匯合的細(xì)胞單層。制備稀釋液系列；各稀釋液至少制備兩份。分析建立后，將微量滴定板溫育72小時(shí)(37℃,5％co2,95-99％相對(duì)濕度)。

為評(píng)價(jià)抗代謝效應(yīng)，吸出測(cè)試培養(yǎng)基，用75μl5％mts(promega)在無酞紅培養(yǎng)基中的溶液替換，溫育1.5小時(shí)(37℃,5％co2,95-99％相對(duì)濕度)。在波長(zhǎng)為498nm處測(cè)定吸光度(safire²,tecan)，將光密度(od值)轉(zhuǎn)化為未處理對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。

為評(píng)價(jià)抗病毒效應(yīng)，吸出測(cè)試培養(yǎng)基，細(xì)胞單層用pbs洗滌。吸出洗滌緩沖液，加入25μlglo裂解緩沖液(目錄號(hào)e2661,promega)，室溫下使裂解進(jìn)行5分鐘。隨后加入50μl熒光素酶分析系統(tǒng)(目錄號(hào)e1501,promega)，立即量化熒光素酶的發(fā)光信號(hào)(1000ms積分時(shí)間/孔,safire²,tecan)。將相對(duì)發(fā)光單位轉(zhuǎn)化為未處理對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。

ec50和ec90(從劑量效應(yīng)曲線獲得)分別表示病毒復(fù)制被抑制50％和90％時(shí)的濃度。cc50(從劑量效應(yīng)曲線獲得)表示細(xì)胞的代謝活性下降至未處理細(xì)胞的50％的濃度。選擇性指數(shù)(si)表示化合物的治療窗，按照cc50/ec50計(jì)算。

一定濃度的化合物被認(rèn)為能在hcv復(fù)制子系統(tǒng)中產(chǎn)生確切的抗病毒效應(yīng)，此時(shí)該特定濃度下抗復(fù)制子效應(yīng)高于70％的閾值，且觀察到不超過30％的代謝活性下降。

對(duì)于結(jié)果參見實(shí)施例12。

用于評(píng)價(jià)基因型1a和2a的hcv抗病毒活性的體外復(fù)制子測(cè)定

將復(fù)制子細(xì)胞(基因型1a(h77)和2a(jfh-1)的亞基因組復(fù)制子)在37℃于5％co2培養(yǎng)箱中于dulbecco’s改性必需培養(yǎng)基(dmem)、10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素-鏈霉素(pen-strep)、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、250μg/mlg418中生長(zhǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)物試劑可購自mediatech(herndon,va)。

使復(fù)制子細(xì)胞胰蛋白酶化并且以5x10³個(gè)細(xì)胞/孔接種于具有不含g418的上述培養(yǎng)基的96-孔平板中。第二天，將培養(yǎng)基用含有在存在5％fbs下連續(xù)稀釋的化合物的dmem替換。hcv復(fù)制子抗病毒測(cè)定檢查一系列化合物稀釋液中化合物的效應(yīng)。簡(jiǎn)言之，將含有hcv復(fù)制子的細(xì)胞接種于96孔平板中。試驗(yàn)品用dmem+5％fbs連續(xù)稀釋。將所稀釋的化合物施加至平板中的適合孔。在37℃溫育72小時(shí)后，處理細(xì)胞。來自每個(gè)孔的細(xì)胞內(nèi)rna用rneasy96kit(qiagen)提取。hcvrna水平通過逆轉(zhuǎn)錄酶-實(shí)時(shí)pcr測(cè)定、使用one-steprt-pcrmastermixreagents(appliedbiosystems,fostercity,ca)和abiprism7900序列檢測(cè)系統(tǒng)(appliedbiosystems)來測(cè)定，如前所述(vrolijk等，2003)。用核糖體rna對(duì)照試劑(appliedbiosystems)作為細(xì)胞數(shù)的指示來測(cè)量細(xì)胞毒性效應(yīng)。然后將hcvrna和核糖體rna的量用于獲得適用的ic50值(對(duì)復(fù)制子復(fù)制抑制50％的濃度)。

微粒體代謝評(píng)價(jià)(微粒體穩(wěn)定性測(cè)定)

微粒體中的代謝率可如下進(jìn)行測(cè)試：

將小鼠或人類肝微粒體用緩沖液c(0.1m磷酸鉀緩沖液，1.0mmedta,ph7.4)稀釋至2.5mg/ml的濃度。然后通過將50ul5um化合物加標(biāo)溶液(spikingsolution)(在9.5ulacn中的0.5ul10mmdmso儲(chǔ)存溶液，加至990ulbufferc)加至50μl微粒體溶液(2.5mg/ml)、110ulbufferc且充分混合來制備微粒體穩(wěn)定性樣品。所有樣品在37℃預(yù)溫育約15分鐘。隨后，通過在輕輕混合下加入40ulnadph溶液(12.5mm)來引發(fā)反應(yīng)。在0、15、30、45和60分鐘時(shí)移取等分試樣(40ul)，且用含有內(nèi)標(biāo)的acn(120ul)淬滅。通過離心(4000rpm,15min)移除蛋白，通過lc-ms/ms分析樣品平板的化合物濃度。然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算半衰期，將分析物濃度與最初存在的量進(jìn)行比較。

對(duì)于結(jié)果參見實(shí)施例13。

肝細(xì)胞穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將先前存于液氮中的冷藏保存的肝細(xì)胞置于37±1℃振蕩水浴中2分鐘±15秒。然后將肝細(xì)胞加至10x體積的預(yù)溫?zé)岬膋rebs-henseleit碳酸氫鹽(khb)緩沖液(2000mg/l葡萄糖，無碳酸鈣和碳酸氫鈉，sigma)，輕輕混合，以500rpm離心3分鐘。離心后，小心移除上清液，加入10x體積的預(yù)溫?zé)岬膋hb緩沖液以使細(xì)胞沉淀物重懸。將其輕輕混合，以500rpm離心3分鐘。然后移取上清液，棄去。然后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)確定細(xì)胞存活力和產(chǎn)率，且這些值用來產(chǎn)生人類肝細(xì)胞懸浮液至適當(dāng)接種密度(活細(xì)胞密度＝2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml)。將2x施用溶液在預(yù)溫?zé)岬膋hb(1％dmso)中制備(200um加標(biāo)溶液：在980uldmso中的20ul底物儲(chǔ)存溶液(10mm)，2x施用溶液：10ul在990μlkhb中的200um加標(biāo)溶液(稀釋后為2um)。

將50ul預(yù)溫?zé)岬?x施用溶液加至各孔中，加入50ul預(yù)溫?zé)岬母渭?xì)胞溶液(2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml)，開始計(jì)時(shí)。然后將平板在37℃溫育。在輕輕混合下完成溫育時(shí)間(0、15、30、60和120分鐘)后將含有內(nèi)標(biāo)的100ul乙腈加至每個(gè)孔中，加入50ul預(yù)溫?zé)岬母渭?xì)胞溶液(2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml)。在結(jié)束溫育后，確定細(xì)胞存活力。將樣品在4℃以4000rpm離心15分鐘，上清液用超純水稀釋2倍，化合物水平通過lc-ms/ms分析。

水溶性評(píng)價(jià)

水溶性可如下測(cè)定：在室溫在100％dmso中制備10mmsanglifehrin類似物的儲(chǔ)存溶液。在琥珀色小瓶中用0.1mpbsph7.3的溶液或100％dmso一式三份將0.01ml等分試樣稀釋至0.5ml。在室溫在vibraxvxr振蕩器上振蕩所得0.2mm的溶液6小時(shí)，隨后將所得溶液或混懸液轉(zhuǎn)移至2mleppendorf管中，在13200rpm離心30分鐘。隨后如前所述通過lcms方法分析上清液等分試樣。

或者，在ph7.4的pbs中的溶解度如下測(cè)定：使用50％meoh的水溶液將測(cè)試化合物和對(duì)照化合物稀釋至40μm、16μm、4μm、1.6μm、0.4μm、0.16μm、0.04μm和0.002μm，產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)隨后進(jìn)一步用meoh:pbs1:1以1:20稀釋。1:20稀釋后的終濃度為2000nm、800nm、200nm、80nm、20nm、8nm、2nm和1nm。標(biāo)準(zhǔn)品隨后與含有內(nèi)標(biāo)(羥基大環(huán),6)的同樣體積acn(1:1)混合。離心樣品(5min,12000rpm)，隨后通過lc/ms分析。

將測(cè)試化合物制備成10mm濃度的在dmso中的儲(chǔ)存液。將儲(chǔ)存液一式兩份用ph7.4的pbs在1.5mleppendorf管中稀釋至目標(biāo)濃度100μm，最終dmso濃度為1％(例如將4μl10mmdmso儲(chǔ)存液稀釋入396μl100mm的磷酸緩沖液)。樣品管隨后在室溫下輕微振蕩4小時(shí)。離心樣品(10min,15000rpm)以沉淀不溶的顆粒。將上清液轉(zhuǎn)移至新的管中并用pbs稀釋(各試驗(yàn)樣品的稀釋因子通過化合物在所用分析儀器上的信號(hào)水平驗(yàn)證)。將稀釋的樣品隨后與同樣體積的meoh混合(1:1)。樣品最終與同樣體積(1:1)的含內(nèi)標(biāo)(羥基大環(huán),6)的acn混合用于lc-ms/ms分析。

細(xì)胞滲透性評(píng)價(jià)

細(xì)胞滲透性可如下測(cè)定：將測(cè)試化合物以10mm溶于dmso，隨后進(jìn)一步在緩沖液中稀釋，產(chǎn)生最終10μm的給藥濃度。熒光標(biāo)記物熒光黃同樣被納入以監(jiān)測(cè)膜完整性。隨后將測(cè)試化合物應(yīng)用于caco-2細(xì)胞單層的頂表面，測(cè)定滲透到基底外側(cè)區(qū)室的化合物。以反方向進(jìn)行(底外側(cè)到頂部)來研究主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。使用lc-ms/ms量化測(cè)試化合物和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照化合物(例如普萘洛爾和醋丁洛爾)的水平。

體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

體內(nèi)分析也可用于測(cè)定化合物的生物利用度。通常，將化合物通過靜脈內(nèi)和口服施用到受試動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)體內(nèi)，在預(yù)定的間隔取血樣測(cè)定所述藥物相對(duì)于時(shí)間的血漿濃度如何變化。血漿濃度相對(duì)于時(shí)間的變化可使用標(biāo)準(zhǔn)模型用于計(jì)算化合物的絕對(duì)生物利用度百分?jǐn)?shù)。典型的方案實(shí)例如下文所述。

向小鼠靜脈內(nèi)或口服施用1、10或100mg/kg的本發(fā)明化合物或其母體化合物。在5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、420和2880分鐘取血樣，通過hplc測(cè)定樣品中本發(fā)明化合物或母體化合物的濃度。血漿濃度的時(shí)間進(jìn)程可用于產(chǎn)生關(guān)鍵參數(shù)，例如血漿濃度-時(shí)間曲線下面積(auc–其與到達(dá)體循環(huán)的未改變的藥物總量成正比)、最大(峰值)血漿濃度、最大血漿藥物濃度發(fā)生時(shí)的時(shí)間(峰值時(shí)間)、其他用于精確測(cè)定生物利用度的因素包括：化合物的終末半衰期、總體內(nèi)清除率、穩(wěn)態(tài)分配容積和f％。這些參數(shù)隨后經(jīng)非區(qū)室或區(qū)室方法分析獲得計(jì)算的生物利用度百分?jǐn)?shù)，該類方法的例子參見egorin等2002及其參考文獻(xiàn)。

口服和靜脈內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的體內(nèi)評(píng)價(jià)(特定方法)

對(duì)于sanglifehrin類似物，進(jìn)行全血分析。將化合物在5％乙醇/5％cremophorel/90％鹽水中配制，用于口服和靜脈內(nèi)施用。用1mg/kg靜脈內(nèi)或10mg/kg口服對(duì)3只雄性cd1小鼠的各組進(jìn)行給藥。在給藥前和在0.25、0.5、2、8和24小時(shí)時(shí)通過隱靜脈采集血液樣品(40ul)，用等量的dh2o稀釋，立即置于干冰上。樣品存于-70℃直至分析。通過lcms如下確定樣品中本發(fā)明化合物或母體化合物的濃度：將20ul血液：h2o(1:1,v/v)/pk樣品加入100ng/ml的20ul內(nèi)標(biāo)(羥基大環(huán)化合物，6)、20ul工作溶液/meoh和150ulcan，以1500rpm渦旋1分鐘，以12000rpm離心5min。然后將上清液注入lc-ms/ms。對(duì)血液濃度的時(shí)程作圖，其用于獲得全血濃度-時(shí)間曲線下面積(auc–其直接與達(dá)到體循環(huán)的未變化藥物的總量成比例)。如有可能，這些值用來產(chǎn)生口服生物利用度(f％)和其它pk參數(shù)。

細(xì)胞毒性的體外評(píng)價(jià)

將獲自atcc的huh-7和hepg2細(xì)胞在含有10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素-鏈霉素(pen-strep)和1％谷氨酰胺的dulbecco’s改性必需培養(yǎng)基(dmem)中生長(zhǎng)；而將cem細(xì)胞(獲自atcc的人類t細(xì)胞白血病細(xì)胞)在含有10％fbs、1％pen-strep和1％谷氨酰胺的rpmi1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。從獲自至少兩個(gè)正常篩選的供者的全血分離新鮮人類pbmc。簡(jiǎn)言之，通過低速離心使外周血細(xì)胞沉淀/洗滌2-3次，重懸浮于pbs中，以除去受污染的血小板。然后將經(jīng)洗滌的血細(xì)胞用dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(d-pbs)進(jìn)行1:1稀釋，于50ml離心管中用14ml淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(lymphocyteseparationmedium)(lsm；mediatech,inc.的cellgrow；密度1.078+/-0.002g/ml；cat.#85-072-cl)分層，以600xg離心30分鐘。從所產(chǎn)生的界面小心吸取帶條紋的pbmc，隨后通過低速離心用pbs洗滌2x。最終洗滌后，通過臺(tái)盼藍(lán)排阻對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1x10⁷個(gè)細(xì)胞/ml在補(bǔ)充有15％胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺、4μg/mlpha-p的rpmi1640中重懸浮。使細(xì)胞在37℃溫育48-72小時(shí)。在溫育后，對(duì)pbmc進(jìn)行離心，重懸浮于含有15％fbs、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、10ug/ml慶大霉素和20u/ml重組人類il-2的rpmi1640中。

通過測(cè)試每種化合物(一式三份)針對(duì)上述細(xì)胞的半對(duì)數(shù)濃度來評(píng)價(jià)化合物細(xì)胞毒性。僅含有培養(yǎng)基的細(xì)胞用作細(xì)胞對(duì)照(cc)。將huh-7和hepg2細(xì)胞以5x10³個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔平板中。第二天，吸取培養(yǎng)基，加入含有5％fbs的100ul相應(yīng)培養(yǎng)基。在微量滴定管中以2x濃度制備測(cè)試藥物稀釋液，將100ul每種濃度置于標(biāo)準(zhǔn)格式的適合孔中。72小時(shí)后，處理細(xì)胞以用于細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。

將pbmc稀釋于新鮮培養(yǎng)基中，以5x10⁴個(gè)細(xì)胞/孔(體積100l)平鋪于96孔圓底微板的內(nèi)部孔中。類似地，以1x10⁴個(gè)細(xì)胞/孔平鋪cem細(xì)胞。然后，將100ul2x試驗(yàn)藥物制劑加至標(biāo)準(zhǔn)格式的適合孔中。將培養(yǎng)維持六至七天，然后處理以進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。

使用cytotox-one^tm均質(zhì)膜完整性測(cè)定試劑盒(promega)確定細(xì)胞毒性。該測(cè)定以熒光、均質(zhì)模式測(cè)量乳酸脫氫酶(ldh)從具有受損膜的細(xì)胞中的釋放。用酶聯(lián)測(cè)定測(cè)量釋放到培養(yǎng)基中的ldh，該酶聯(lián)測(cè)定導(dǎo)致刃天青轉(zhuǎn)化成熒光試鹵靈產(chǎn)物。所產(chǎn)生的熒光的量與所溶解細(xì)胞的數(shù)目成比例。將六個(gè)連續(xù)稀釋濃度的每種化合物施加至細(xì)胞，以(適用時(shí))獲得tc50(降低細(xì)胞存活力50％的藥物的毒性濃度)和tc90(降低細(xì)胞存活力90％的藥物的毒性濃度)值。

mdr1和mrp2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制的體外評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)mdr1(p糖蛋白1)和mrp2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制和激活，可使用solvobiotechnology公司的體外atp酶測(cè)定法(glavinas等,2003)。在釩酸鹽存在或不存在情況下，將化合物(0.1、1、10和100μm)與mdr1或mrp2膜囊泡孵育，研究潛在的atp酶激活。此外，在維拉帕米/柳氮磺吡啶存在下進(jìn)行類似的孵育，以檢測(cè)可能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白atp酶活性抑制。atp酶活性通過分光光度法定量無機(jī)磷酸鹽而測(cè)定。從atp酶活性的釩酸鹽敏感性增加計(jì)算激活。通過維拉帕米/柳氮磺吡啶介導(dǎo)的atp酶活性下降測(cè)定抑制。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1–鏈霉菌屬的種a92-308110(dsm9954)的sfaa缺失突變體的構(gòu)建

1.1sfaa缺失構(gòu)建體的構(gòu)建

通過用ecorv和stui消化來切斷包含sfaa(核苷酸位置14396-21362，ncbi序列登錄號(hào)fj809786)的粘粒tl3006(seqidno.3)的～7kbecorv-stui片段，將所得的分離片段直接連接到pkc1139中，pkc1139之前已用ecorv消化且用蝦堿性磷酸酶(roche)處理。該質(zhì)粒被稱為psgk268。

使用由genebridges供應(yīng)的red/et重組試劑盒(目錄號(hào)k006)進(jìn)行包含在該克隆中的sfaa基因的框內(nèi)缺失。

(seqidno.1)sfaa17161f5’-cgctctgtggcgcctggtttccaagcggctcgcggaccggcaccggcacatgcataattaaccctcactaaagggcg-3’

(seqidno.2)sfaa17825r5’-tggatgtatcgtcgcaggacgcccagaattcacctgcgacgtcctccagatgcattaatacgactcactatagggctc-3’

使用兩個(gè)寡核苷酸sfaa17161f和sfaa17825r，使用koddna聚合酶，由在試劑盒中提供的frt-pgk-gb2-neo-frt模板dna擴(kuò)增新霉素標(biāo)記物。所產(chǎn)生的～1.7kb擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳分離，利用qiaex樹脂從凝膠純化。

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將質(zhì)粒psgk268轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh10b，在含有安普霉素(50μg/ml)的平板上選擇?；旧习凑誫enebridges試劑盒方案進(jìn)行缺失構(gòu)建體的引入。使單個(gè)菌落在2ty安普霉素(50ug/ml)中生長(zhǎng)過夜，用predet(tet)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在30℃用安普霉素(50ug/ml)和四環(huán)素(3ug/ml)選擇。在30℃于3ml2ty安普霉素(50ug/ml)和四環(huán)素(3μg/ml)中使用單個(gè)菌落制備該菌株的過夜培養(yǎng)物。在30℃使用0.5ml該培養(yǎng)物接種10ml2ty安普霉素(50ug/ml)和四環(huán)素(3ug/ml)，生長(zhǎng)直到od600nm～0.5。將1.4ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至2個(gè)eppendorf管中的每個(gè)，將50ul10％阿拉伯糖加至一個(gè)管以誘導(dǎo)red/et重組蛋白的表達(dá)。在37℃將管振搖～1小時(shí)。將經(jīng)誘導(dǎo)的和未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞在臺(tái)式離心機(jī)中沉淀，用冷凍的無菌水洗滌兩次；每次經(jīng)過再混懸和離心，沉淀細(xì)胞。將所產(chǎn)生的沉淀物混懸于約30-40ul水中，保持于冰上。將之前分離的1.7kb斷裂片段加至經(jīng)誘導(dǎo)的和未經(jīng)誘導(dǎo)的管中，轉(zhuǎn)移到在冰上的1mmbiorad電穿孔杯(electrocuvette)中。對(duì)樣品進(jìn)行電穿孔(bioradmicropulser，1.8kv，所得的時(shí)間常數(shù)～4ms)，加入1ml2ty(無抗生素)，混合以除去杯中的細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃于振蕩(1100rpm，eppendorf精巧型熱混合器)下溫育～3小時(shí)，隨后平鋪在含有安普霉素(50ug/ml)和卡那霉素(25ug/ml)的2ty平板上，在37℃溫育過夜。將來自經(jīng)誘導(dǎo)的樣品平板的克隆挑染到含有50μg/ml卡那霉素的2ty平板上，以純化且確認(rèn)卡那霉素抗性卡帶(cassette)的引入。在各個(gè)細(xì)菌菌落上使用pcr來確認(rèn)卡帶的引入。由這些培養(yǎng)物制備質(zhì)粒，將其消化，以確認(rèn)所期望的質(zhì)粒psgk270。然后用nsii消化質(zhì)粒以除去標(biāo)記物片段，將剩余部分重新連接以生產(chǎn)sfaa框內(nèi)缺失的構(gòu)建體psgk271。

1.2鏈霉菌屬的種a92-308110(dsm9954)的偶聯(lián)和sfaa缺失的引入

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將質(zhì)粒psgk271轉(zhuǎn)化入大腸桿菌et12567puz8002中，在含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(10μg/ml)的2ty平板上選擇。將所得菌株接種于3ml含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(10ug/ml)的液體2ty中，在37℃、250rpm溫育過夜。在50mlfalcon管中使用0.8ml該培養(yǎng)物接種10ml含有安普霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25ug/ml)和氯霉素(10ug/ml)的液體2ty，在37℃、250rpm溫育直到od600nm到達(dá)～0.5。將所得培養(yǎng)物在4℃以3500rpm離心10分鐘，用10ml2ty培養(yǎng)基洗滌兩次，每次洗滌后離心沉淀細(xì)胞。將所得沉淀物再混懸于0.5ml2ty中，在使用前保持在冰上。該過程的時(shí)間安排與下述鏈霉菌屬孢子的完全制備保持一致。

通過再混懸于～3ml20％甘油中，從1-2周齡的匯合平板上收集鏈霉菌屬的種a92-308110(dsm9954)(biot-4370)的孢子。離心(5000rpm,10分鐘室溫)孢子，用50mmtes緩沖液洗滌兩次，之后再懸浮于1ml50mmtes緩沖液中，在2個(gè)eppendorf管之間平分。將這些管在50℃水浴中熱休克10分鐘，然后加入0.5ml2ty，在eppendorf精巧型熱混合器中于37℃溫育4-5小時(shí)。

將所制備的大腸桿菌et12567puz8002psgk271和biot-4370按比例1:1(各菌株250ul)和1:3(100ul大腸桿菌)混合，隨即在r6平板上展開，轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中。溫育約2小時(shí)后，將這些平板用2ml含有萘啶酮酸的無菌水覆蓋，得到25ug/l的最終平板內(nèi)濃度。將培養(yǎng)板放回到37℃培養(yǎng)箱中過夜，隨后用2ml含有安普霉素的無菌水覆蓋，得到20-25ug/l的最終平板內(nèi)濃度。接合后體菌落在約4-7天后出現(xiàn)，將其置于含有安普霉素(25ug/l)和萘啶酮酸(25ug/l)的isp4培養(yǎng)基上，在37℃溫育。一旦觀察到足夠的菌絲生長(zhǎng)，將菌株在37℃再轉(zhuǎn)移到含有安普霉素(25ug/l)的isp4培養(yǎng)基中，使孢子形成。隨后通過轉(zhuǎn)移到isp4(無抗生素)以及在37℃溫育3-4天，將菌株傳代培養(yǎng)3次(促進(jìn)去除溫度敏感質(zhì)粒)。最后將菌株轉(zhuǎn)至isp4，在28℃培養(yǎng)進(jìn)行完全孢子生長(zhǎng)(5-7天)。收集孢子，在28℃連續(xù)稀釋至isp4平板上，選擇單個(gè)菌落。形成孢子的單個(gè)菌落一式二份轉(zhuǎn)移至含或不含安普霉素(25μg/l)的isp4平板，以確定質(zhì)粒損失，使其生長(zhǎng)～7天，然后測(cè)試sanglifehrin的生成。

1.3在falcon管中篩選菌株用于生產(chǎn)sanglifehrin

使用孢子形成良好的菌株的單個(gè)～7mm瓊脂塊接種7ml無菌sm25-3培養(yǎng)基，在27℃、200rpm下在2”振幅的振蕩器中溫育。48小時(shí)生長(zhǎng)后，將0.7ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有7ml含5％hp20樹脂的sgp2培養(yǎng)基的無菌falcon管中。使培養(yǎng)物在24℃、300rpm下在1英寸振幅振蕩培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)5天，然后收集。移除0.8ml細(xì)胞培養(yǎng)物，將其量分到2mleppendorf管中，分裝前保證樹脂在整個(gè)培養(yǎng)物中充分分散。加入0.8ml乙腈和15ul甲酸，將所述管混合約30分鐘。通過離心使混合物變澄清，將170ul提取液移入hplc小瓶中，通過hplc分析。

1.4回復(fù)至野生型或sfaa表型的菌株分析

通過hplc分析菌株提取物。生產(chǎn)sanglifehrina和b的菌株沒有進(jìn)一步分析，因?yàn)槠湟鸦貜?fù)為野生型。缺少sanglifehrina和b生成的菌株顯示低水平(～1-2mg/l)的峰保留時(shí)間6.5分鐘(顯示sanglifehrin樣生色團(tuán))。通過lcms分析表明，該峰具有m/z1073，比期望的sanglifehrinm/z低16個(gè)單位。假定，該峰是由于在間羥基酪氨酸不存在下?lián)饺氡交彼崴隆?/p>

隨后使顯示sanglifeherin生產(chǎn)缺失的八個(gè)菌株再生長(zhǎng)，評(píng)價(jià)潛在的sfaa突變是否可能用化學(xué)方法補(bǔ)充以使突變合成的方法生成新的sanglifehrin。將菌株在sm25-3種子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至含有5％樹脂的sgp2生產(chǎn)培養(yǎng)基。另外生長(zhǎng)24小時(shí)后，將菌株一式三份地用2mmdl間羥基酪氨酸(添加100ul0.16m在1mhcl中的溶液)或2mml-苯基丙氨酸飼喂，未飼喂的菌株用作對(duì)照。也對(duì)菌株飼喂2-哌啶酸(2mm)的甲醇溶液以增強(qiáng)產(chǎn)物產(chǎn)率。另外4天生長(zhǎng)后收集菌株，提取，通過hplc分析。顯示間羥基酪氨酸完全補(bǔ)充sfaa突變，添加l-苯基丙氨酸增加了-16amu化合物的水平。選擇菌株biot-4585作為sfaa缺失突變體用于進(jìn)一步研究。

實(shí)施例2–用于構(gòu)建sfaa缺失構(gòu)建體的其它方法

可使用其它方法產(chǎn)生sfaa缺失突變體。實(shí)例包括sfaa插入失活突變體(如來自wo2010/034243的實(shí)施例12(其內(nèi)容通過引用整體并入本文))。該菌株如wo2010/034243中所述產(chǎn)生，給予該菌株名稱biot-4452。

在產(chǎn)生sfaa缺失的替代程序中，使用作為模板的粘粒tl3006(seqidno.3)和koddna聚合酶，使用兩個(gè)寡核苷酸15209f5’-cagagaattcgcggtacggggcggacgacaaggtgtc-3’(seqidno.4)和17219r5’-gcgcatgcatgtgccggtgccggtccgcgagccgcttgg-3’(seqidno.5)來擴(kuò)增同源物上游區(qū)域。擴(kuò)增產(chǎn)物用t4多核苷酸激酶(neb)處理，克隆入puc18中，通過用蝦堿性磷酸酶(roche)處理已使puc18脫磷酸化。通過限制消化來檢查所產(chǎn)生的構(gòu)建體，完全測(cè)序，以確保產(chǎn)生所需序列并且在聚合酶擴(kuò)增期間未引入錯(cuò)誤。用ecori和nsii消化該構(gòu)建體，通過凝膠電泳分析產(chǎn)物。從凝膠切除含有所需序列的條帶(即上游同源性～2kb)，使用標(biāo)準(zhǔn)程序(qiaex樹脂)純化。使用作為模板的粘粒tl3006(seqidno.3)和koddna聚合酶，使用第二組寡核苷酸(seqidno.6)17766f5’-cctcatgcatctggaggacgtcgcaggtgaattctgggcg-3’和19763r5’-gggcaagcttctcctggctgagcttgaacatcg-3’(seqidno.7)來擴(kuò)增同源物下游區(qū)域。擴(kuò)增產(chǎn)物用t4多核苷酸激酶(neb)處理，克隆入puc18中，通過用蝦堿性磷酸酶(roche)處理已使puc18脫磷酸化。通過限制消化來檢查所產(chǎn)生的構(gòu)建體，完全測(cè)序，以確保產(chǎn)生所需序列并且在聚合酶擴(kuò)增期間未引入錯(cuò)誤。用hindiii和nsii消化該構(gòu)建體，通過凝膠電泳分析產(chǎn)物。從凝膠切除含有所需序列的條帶(即下游同源物～2kb)，使用標(biāo)準(zhǔn)程序(qiaex樹脂)純化。用ecori和hindiii消化載體pkc1139，將大載體片段通過凝膠電泳分離，通過標(biāo)準(zhǔn)方法(qiaex樹脂)純化。然后將分離的上游和下游同源性片段以三方連接方式克隆入pkc1139的該片段，從而產(chǎn)生所需的sfaa缺失構(gòu)建體。

在用于產(chǎn)生sfaa缺失構(gòu)建體的進(jìn)一步替代程序中，使用商業(yè)基因合成(即genscript或其它供應(yīng)商)產(chǎn)生含有所需序列(seqidno.8)的構(gòu)建體。使用bamhi和xbai消化該商購構(gòu)建體，從而切除所關(guān)注的序列，通過凝膠電泳分析產(chǎn)物。從凝膠切除含有所需序列(～4kb)的條帶，使用標(biāo)準(zhǔn)程序純化。用bamhi和xbai消化載體pkc1139，大片段通過凝膠電泳分離，通過標(biāo)準(zhǔn)方法來純化。然后將兩個(gè)分離片段連接在一起，從而產(chǎn)生所需的sfaa缺失構(gòu)建體。

使用實(shí)施例部分1.2中的方法，通過接合將這些替代sfaa缺失構(gòu)建體引入至鏈霉菌屬的種a92-308110(dsm9954)中。

實(shí)施例3-sfaa缺失突變體的陣列飼喂

在mam、isp4、isp3或isp2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后制備sfaa破壞的突變體(biot-4452或biot-4585)的孢子貯備液，保存于20％w/v甘油/蒸餾水中，存于-80℃。通過在帶有泡沫塞的50ml離心管中將孢子貯備液(1％v/v)接種到7ml種子培養(yǎng)基(sm25培養(yǎng)基)中來制備營養(yǎng)培養(yǎng)物(種子培養(yǎng)物)。將培養(yǎng)管在27℃、250rpm(5cm振幅)下溫育48h。在帶有泡沫塞的50ml離心管中將10％種子培養(yǎng)物(v/v)轉(zhuǎn)移到7ml生產(chǎn)培養(yǎng)基sgp-2中。在24℃和300rpm(2.5cm振幅)下進(jìn)行培養(yǎng)。為了生產(chǎn)sanglifehrin突變合成類似物，接種后24小時(shí)將0.05ml0.32m飼喂化合物(突變合成元)溶液(于1nhcl中)加至各管中，得到最終濃度為2mm。此外，在24小時(shí)時(shí)將0.05ml0.32m六氫噠嗪-3-羧酸溶液(于甲醇中)加至各管中，得到最終濃度為2mm。飼喂后將培養(yǎng)繼續(xù)另外四天。

通過將0.8ml全發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到2ml具塞eppendorf管中來提取樣品。加入0.8ml乙腈，以及0.015ml甲酸。然后將混合物在vibrax上振搖30分鐘。然后將管以13000rpm離心10分鐘，移除0.15ml上清液用于分析。如通用方法所述分析提取液。

表1示出以這種方式飼喂的突變合成元，以及觀察到的sanglifehrin突變合成產(chǎn)物的lcmsh+和na+加成物、預(yù)期的分子量和保留時(shí)間。示出涉及sanglifehrina類似物的主峰。在所有情況中，也觀察到sanglifehrinb類似物的lcms峰(質(zhì)量–18)。

表1

實(shí)施例4–63-氟sanglifehrina,化合物14的分離

利用2-氨基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯和dl-六氫噠嗪-3-羧酸作為前體，如通用方法中所述進(jìn)行發(fā)酵，在26小時(shí)時(shí)加入兩者。

收集培養(yǎng)物后，將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用磁力攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過離心或通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品(1.3g)。

將粗提取液(1.3g)溶于乙酸乙酯(2ml)中，加載到用乙酸乙酯(500ml)調(diào)節(jié)的硅膠柱(10x2cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后用逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(278mg)溶于甲醇(1.8ml)中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以50％b進(jìn)行6分鐘，隨后在30分鐘時(shí)梯度至100％b。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(20mg)。

實(shí)施例5-62,63-氟sanglifehrina,化合物15的分離

利用(s)-2-氨基-3-(3,4-二氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯和dl-六氫噠嗪-3-羧酸作為前體，如通用方法中所述進(jìn)行發(fā)酵，在26小時(shí)時(shí)加入兩者。

收集培養(yǎng)物后，將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用磁力攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過離心或通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品(1.6g)。

將粗提取物(1.6g)溶于2ml乙酸乙酯中，加載到用500ml乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱(10x2cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(188mg)溶于1.8ml甲醇中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以50％b進(jìn)行6分鐘，隨后在30分鐘時(shí)梯度至100％b。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(15mg)。

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實(shí)施例6-62-氟sanglifehrina,化合物16的分離

使用(s)-2-氨基-3-(4-氟-3-羥基苯基)丙酸甲酯和dl-六氫噠嗪-3-羧酸前體。根據(jù)通用方法進(jìn)行，不同的是在27小時(shí)時(shí)加入前體。

收集培養(yǎng)物后，將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用磁力攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過離心或通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。

在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品(4.2g)。

將粗提取物(4.2g)溶于4ml乙酸乙酯中，加載到用500ml乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱(15x2cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(390mg)溶于2.4ml甲醇中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以50％b進(jìn)行6分鐘，隨后在30分鐘時(shí)梯度至100％b。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(38mg)。

實(shí)施例7-62-甲基sanglifehrina,化合物17的分離

將冷藏保存的biot-4585孢子貯備液在室溫解凍。通過在帶有泡沫塞的2l錐形燒瓶中將0.4ml孢子貯備液轉(zhuǎn)移到400ml培養(yǎng)基sm25中來制備營養(yǎng)培養(yǎng)物(種子培養(yǎng)物)。將培養(yǎng)在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下進(jìn)行48小時(shí)。在帶有泡沫塞的2l離心管中將種子培養(yǎng)物20ml轉(zhuǎn)移到400ml生產(chǎn)培養(yǎng)基sgp2+5％hp20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培養(yǎng)24小時(shí)后，將2ml的200mm(s)-2-氨基-3-(3-羥基-4-甲基苯基)丙酸甲酯在1m鹽酸中的溶液和2ml400mmdl-六氫噠嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每個(gè)生產(chǎn)燒瓶，得到前體的個(gè)體對(duì)映異構(gòu)體的1mm最終濃度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下繼續(xù)培養(yǎng)另外四天。

將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用頂置式槳式攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過離心或通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品(7.6g)。

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將粗提取物(7.6g)溶于5ml乙酸乙酯中，加載到用500ml乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱(15x2cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(319mg)溶于2.4ml甲醇中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以50％b進(jìn)行6分鐘，隨后在30分鐘時(shí)梯度至100％b。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(14.9mg)。

實(shí)施例8-61-脫羥基sanglifehrina,化合物18的分離

將冷藏保存的biot-4585孢子貯備液在室溫解凍。通過在帶有泡沫塞的2lerlenmeyer燒瓶中將0.4ml孢子貯備液轉(zhuǎn)移到400ml培養(yǎng)基sm25中來制備營養(yǎng)培養(yǎng)物(種子培養(yǎng)物)。將培養(yǎng)在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下進(jìn)行48小時(shí)。在7lapplikon發(fā)酵罐中將種子培養(yǎng)物500ml轉(zhuǎn)移到4.5l生產(chǎn)培養(yǎng)基sgp2+5％hp20中，在24℃、400rpm(級(jí)聯(lián)dot對(duì)照)、2.5l/min氣流和30％dot(級(jí)聯(lián)攪拌對(duì)照)下培養(yǎng)。在培養(yǎng)24小時(shí)后，將7.5ml的667mm(s)-2-氨基-3-苯基丙酸在1m鹽酸中的溶液加至發(fā)酵罐，得到前體的1mm最終濃度。在24℃、400rpm(級(jí)聯(lián)dot對(duì)照)、2.5l/min氣流和30％dot(級(jí)聯(lián)攪拌對(duì)照)下繼續(xù)培養(yǎng)另外四天。

將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用頂置式槳式攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取，但是第二提取液通過離心回收。在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品(55g)。

將粗提取物(55g)混懸于80％甲醇的水溶液中，用300ml己烷萃取兩次。在甲醇/水部分(蒸發(fā)至干)中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物。將該干燥的提取物(48g)溶于30ml乙酸乙酯中，加載到用1l乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱(20x5cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(813mg)溶于甲醇中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以50％b進(jìn)行6分鐘，隨后在30分鐘時(shí)梯度至100％b。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(34mg)。

實(shí)施例9-58-脫(3-羥基苯基)-58-(3-羥基(2-吡啶基)-sanglifehrina,化合物19的分離

采用(2s)-2-氨基-3-(3-羥基(2-吡啶基))丙酸甲酯和dl-六氫噠嗪-3-羧酸前體。根據(jù)通用方法進(jìn)行，不同的是在營養(yǎng)(種子)培養(yǎng)期間培養(yǎng)箱振幅為2.5cm。

將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用頂置式漿式攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗提取物(7g)。

將粗提取物(7g)溶于4ml乙酸乙酯中，加載到用500ml乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱(15x2cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等至100％丙酮，然后1％甲醇逐步至于丙酮中的5％甲醇)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(204mg)溶于甲醇中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以50％b進(jìn)行6分鐘，隨后在30分鐘時(shí)梯度至100％b。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(4mg)。

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實(shí)施例10-61-脫羥基-61-氟sanglifehrina,化合物20的分離

將冷藏保存的biot-4585孢子貯備液在室溫解凍。通過在帶有泡沫塞的2lerlenmeyer燒瓶中將0.4ml孢子貯備液轉(zhuǎn)移到400ml培養(yǎng)基sm25中來制備營養(yǎng)培養(yǎng)物(種子培養(yǎng)物)。將培養(yǎng)在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下進(jìn)行48小時(shí)。在帶有泡沫塞的2lerlenmeyer燒瓶中將種子培養(yǎng)物20ml轉(zhuǎn)移到400ml生產(chǎn)培養(yǎng)基sgp2+5％hp20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培養(yǎng)24小時(shí)后，將2ml的400mm2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸在1m鹽酸中的溶液和2ml400mmdl-六氫噠嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每個(gè)生產(chǎn)燒瓶，得到前體的個(gè)體對(duì)映異構(gòu)體的1mm最終濃度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下繼續(xù)培養(yǎng)另外四天。

將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用頂置式漿式攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。通過對(duì)殘留的細(xì)胞和樹脂混合物離心，獲得第三提取液。在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品(10.5g)。

將粗提取物(10.5g)溶于7ml乙酸乙酯中，加載到用500ml乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱(15x2cm)上。將柱用乙酸乙酯洗脫，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10％、20％、30％等)。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料(342mg)溶于甲醇中，通過制備型hplc純化。使用watersxterramsc18柱(10微米，19cmx250mm)，溶劑以21ml/min泵送。溶劑a為水且溶劑b為乙腈。將柱等度洗脫，進(jìn)樣后以53％b進(jìn)行30分鐘。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體(6mg)。

實(shí)施例11-61-脫羥基-61-氨基sanglifehrina,化合物21的分離

將冷藏保存的biot-4585孢子貯備液在室溫解凍。通過在帶有泡沫塞的2lerlenmeyer燒瓶中將0.4ml孢子貯備液轉(zhuǎn)移到400ml培養(yǎng)基sm25中來制備營養(yǎng)培養(yǎng)物(種子培養(yǎng)物)。將培養(yǎng)在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下進(jìn)行48小時(shí)。在帶有泡沫塞的2lerlenmeyer燒瓶中將種子培養(yǎng)物20ml轉(zhuǎn)移到400ml生產(chǎn)培養(yǎng)基sgp2+5％hp20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培養(yǎng)24小時(shí)后，將2ml的200mm(s)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙酸甲酯在1m鹽酸中的溶液加至每個(gè)生產(chǎn)燒瓶，得到前體的1mm最終濃度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下繼續(xù)培養(yǎng)另外四天。

將發(fā)酵液混合，用甲酸調(diào)節(jié)至約ph3，離心(3300g)25min，從凈化的發(fā)酵液分離細(xì)胞和樹脂。在測(cè)試確定存在少于5％的目標(biāo)化合物后，棄去凈化的發(fā)酵液。使用頂置式漿式攪拌器將細(xì)胞和樹脂與2體積乙腈攪拌1小時(shí)。通過在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞和樹脂的第二次乙腈提取。通過對(duì)殘留的細(xì)胞和樹脂混合物離心，獲得第三提取液。

在減壓下將合并的乙腈提取液濃縮至殘留的含水體積，然后調(diào)節(jié)至ph6。將其用乙酸乙酯萃取兩次，在減壓下將合并的有機(jī)物蒸發(fā)至干，得到最終粗品。

將粗提取物溶于乙酸乙酯中，加載到用乙酸乙酯調(diào)節(jié)的硅膠柱上。將柱用具有遞增極性的有機(jī)溶劑洗脫。收集約250ml級(jí)分，目標(biāo)化合物通過分析型lc鑒定，合并，蒸發(fā)至干。將該材料溶于甲醇中，通過制備型hplc純化。純級(jí)分通過hplc-uv鑒定，合并。在減壓下將這些級(jí)分蒸發(fā)至干，獲得目標(biāo)化合物，為灰白色無定形固體。

實(shí)施例12-生物學(xué)數(shù)據(jù)–復(fù)制子系統(tǒng)中hcv抗病毒活性的體外評(píng)價(jià)

使用huh5.2細(xì)胞，如通用方法中所述在復(fù)制子測(cè)定中分析化合物。包括環(huán)孢菌素a,1、sanglifehrina,5和羥基大環(huán)化合物6作為比較。

可以看出，14、15、16和17均在huh5.2復(fù)制子測(cè)定中非常有效(由低ec50所示)，其對(duì)所述細(xì)胞系具有良好選擇性(由高選擇性指數(shù)所示)。先前描述的sanglifehrina,5在hcv抑制方面的效力比14、15和17弱，且環(huán)孢菌素a,1的效力較弱，而1和5兩者具有較差的選擇性指數(shù)。

實(shí)施例13–微粒體穩(wěn)定性

如通用方法中所述分析化合物在人類和小鼠肝微粒體中的穩(wěn)定性。包括sanglifehrina,5作為比較。

可以看出，與sanglifehrina(5)相比，本發(fā)明化合物14、15、16、17、18和19均具有增加的在人類肝微粒體中的穩(wěn)定性，并且14、15和17也均在小鼠肝微粒體中更穩(wěn)定。

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本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利和專利申請(qǐng)?jiān)趦?nèi)，均以最大可能的程度通過參考并入本文。

在整個(gè)說明書和以下權(quán)利要求中，除非上下文另外說明，術(shù)語“包含”及其變體例如“包括”、“含有”應(yīng)當(dāng)理解為包括所述的整體或步驟或整體的組，但并不排除任何其他整體或步驟或整體或步驟的組。

序列表

<110>百奧帝卡技術(shù)有限公司

s.j.摩斯

m.a.格雷戈里

b.威爾金森

s.g.肯德魯

c.j.馬丁

<120>新化合物及它們的制備方法

<130>boa-p1201pct

<150>gb1021522.6

<151>2010-12-20

<150>gb1113626.4

<151>2011-08-08

<160>8

<170>patentin版本3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>1

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<211>78

<212>dna

<213>人工

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<223>引物

<400>2

tggatgtatcgtcgcaggacgcccagaattcacctgcgacgtcctccagatgcattaata60

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<211>46596

<212>dna

<213>人工

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<223>粘粒

<400>3

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