本申請是中國專利申請?zhí)?00880105732.x，申請日2008年08月06日，發(fā)明名稱“用于選擇南方根結(jié)線蟲抗性大豆植物的方法和組合物”的分案申請(申請?zhí)枮?01410020821.1，分案申請?zhí)峤蝗諡?014年1月13日，發(fā)明名稱為“用于選擇南方根結(jié)線蟲抗性大豆植物的方法和組合物”)的分案申請。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2008年5月23日提交的美國臨時申請61/055519和2007年8月7日提交的美國臨時申請60/963836的優(yōu)先權(quán)。序列表的引入包含于2008年8月1日創(chuàng)建的、322千字節(jié)(在microsoft中計數(shù))的名為“pa_01413.txt”的文件的序列表包括45個核苷酸序列，并且在這里全部引入作為參考。本發(fā)明屬于植物育種和抗病性的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明包括培育含有與南方根結(jié)線蟲(srkn)抗病性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(qtl)的大豆植物的方法，該病是與病原體南方根結(jié)線蟲(meloidogyneincognita)相關(guān)的病害。本發(fā)明進一步涉及遺傳標(biāo)記在確定病原體南方根結(jié)線蟲抗病性的qtl中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步包括含有用于滲入優(yōu)良種質(zhì)中的賦予抗病性的qtl的種質(zhì)和該種質(zhì)在針對srkn抗性的育種計劃中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：根結(jié)線蟲(根結(jié)線蟲屬(meloidogyne)的種)是感染許多宿主并且在世界上引起廣泛的作物損害的植物病原體。在美國東南部，南方根結(jié)線蟲(meloidogyneincognita)，在本文中稱為srkn，是大豆(glycinemax(l))的主要害蟲。對使用殺線蟲劑的限制，包括取消dbcp(1,2-二溴-3-氯丙烷)和edb(二溴乙烷)，已經(jīng)促進了替代的srkn控制方法的發(fā)展(harris等人.cropsci.43:1848-1851(2003))。培育srkn抗性大豆栽培種是最有效的降低寄生蟲引起的產(chǎn)量和栽培者利益損失的方法(li等人.,theorapplgenet103:1167-1173(2001))。因此，已經(jīng)開發(fā)了大量的srkn抗性栽培種(ha等人.,cropscience44:758-763(2004))。已經(jīng)檢查了優(yōu)良大豆品種和保藏的種質(zhì)的srkn抗性。srkn抗性的兩種來源是pi96354和palmetto(美洲蒲葵)。對來自usda大豆種質(zhì)保藏中心(urbana,il)的2,370種大豆保藏物的表型篩查確定了pi96354是該保藏中心抗性最高的來源(luzzi,等人.cropsci.27:258-262(1987))。高度srkn抗性品種pi96354與srkn敏感的bossier之間的雜交允許將srkn抗性的主要數(shù)量性狀基因座(qtl)定位于可公開獲得的大豆遺傳連鎖圖的連鎖群(lg)o并且將次要qtl定位于lg-g(tamulonis等人.,cropsci.37:1903-1909(1997))。forrest是顯示srkn抗性并且在大豆品種開發(fā)中用作srkn抗性的親本來源的另外一個大豆品種。forrest和許多其它優(yōu)良品種中的srkn抗性的祖先來源被認為是palmetto(ha等人.cropsci.44:758-763(2004))。在forrest與敏感的bossier雜交的研究中鑒定了主要srkn抗性qtlrmi(luzzi等人.,jheredity85:484-486(1994))。對48個大豆品種的譜系分析和使用簡單序列重復(fù)(ssr)標(biāo)記的基因型分型提供了證據(jù)證明srkn抗性品種遺傳了來自祖先抗性來源的連鎖群o上的主要srkn抗性qtl(rmi)(ha等人.cropsci.44:758-763(2004))。通過使用對srkn抗性qtl的標(biāo)記輔助的選擇可以大大促進srkn抗性大豆的培育。單核苷酸多態(tài)性(snp)和(ssr)可以用作定位與srkn抗性有關(guān)的qtl的遺傳標(biāo)記。優(yōu)選snp，因為可以獲得使用snp標(biāo)記平臺的自動化、高通量篩選技術(shù)，這些技術(shù)可以縮短選擇和向大豆植物中滲入srkn抗性的時間。此外，snp標(biāo)記是理想的，因為特定snp等位基因來自于特定物種的現(xiàn)存群體中的獨立來源的可能性非常低。因此，snp標(biāo)記可用于跟蹤和輔助srkn抗性等位基因的基因滲入，特別是在srkn抗性單元型的情況下?？梢允褂胹np標(biāo)記篩選大豆遺傳連鎖圖的lg-o和lg-g上的srkn抗性qtl(ha等人.,cropsci.47(2)s73-s82(2007))。本發(fā)明提供并包括用于篩選和選擇包含srkn抗性qtl的大豆植物的方法和組合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種將等位基因滲入大豆植物中的方法，包括以下步驟：(a)提供大豆植物群體；(b)根據(jù)選自seqidno:1-4的大豆基因組核酸標(biāo)記，對該群體中的至少一個大豆植物進行基因型分型；(c)從該群體中選擇至少一個包含至少一個與srkn抗性相關(guān)的等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因選自seqidno:21-25。本發(fā)明進一步提供該大豆植物群體可以通過使至少一個srkn抗性大豆植物與至少一個srkn敏感性大豆植物雜交而產(chǎn)生。本發(fā)明進一步包括通過以下方法產(chǎn)生的優(yōu)良大豆植物：(a)提供大豆植物群體；(b)根據(jù)選自seqidno:1-4的大豆基因組核酸標(biāo)記，對該群體中的至少一個大豆植物進行基因型分型；(c)從該群體中選擇至少一個包含至少一個與srkn抗性相關(guān)的等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因選自seqidno:21-25。本發(fā)明進一步提供所述優(yōu)良大豆植物可以顯示轉(zhuǎn)基因性狀，其中該轉(zhuǎn)基因性狀選自除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、油產(chǎn)生改變、高產(chǎn)油量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、發(fā)芽和幼苗生長的控制、動物和人類營養(yǎng)增強、低棉子糖、環(huán)境應(yīng)激抗性、可消化性提高、加工性狀改善、風(fēng)味改善、固氮、雜種種子的產(chǎn)生和變應(yīng)原性降低。在進一步的實施方案中，賦予的除草劑耐受性選自對草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈、2,4-二氯苯氧基乙酸和達草滅除草劑的耐受性。本發(fā)明提供的方法可以進一步包括以下步驟：(d)測定選擇的大豆植物對誘導(dǎo)srkn的病原體的抗性。在該方法的某些實施方案中，在步驟(b)中通過選自單堿基延伸(sbe)、等位基因特異性引物延伸測序(aspe)、dna測序、rna測序、基于微陣列的分析、通用pcr、等位基因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜法、連接、延伸-連接和瓣核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的分析的分析方法實現(xiàn)基因型分型。本發(fā)明進一步提供一種將等位基因滲入大豆植物中的方法，包括：(a)提供大豆植物群體；(b)用至少一種核酸標(biāo)記篩查該群體；和(c)從該群體中選擇一個或多個包含srkn抗性等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因是選自srkn抗性基因座的等位基因，其中在其一個或多個基因座處的一個或多個等位基因選自srkn抗性等位基因1、srkn抗性等位基因2、srkn抗性等位基因3和srkn抗性等位基因4。本發(fā)明進一步包括通過以下方法產(chǎn)生的優(yōu)良大豆植物：(a)提供大豆植物群體；(b)用至少一種核酸標(biāo)記篩查該群體；和(c)從該群體中選擇一個或多個包含srkn抗性等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因是選自srkn抗性基因座的等位基因，其中在其一個或多個基因座處的一個或多個等位基因選自srkn抗性等位基因1、srkn抗性等位基因2、srkn抗性等位基因3和srkn抗性等位基因4。通過本發(fā)明的任一種方法產(chǎn)生的大豆或優(yōu)良大豆植物可以進一步包含轉(zhuǎn)基因性狀。該轉(zhuǎn)基因性狀可以選自除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、油產(chǎn)生改變、高產(chǎn)油量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、發(fā)芽和幼苗生長的控制、動物和人類營養(yǎng)增強、低棉子糖、環(huán)境應(yīng)激抗性、可消化性提高、加工性狀改善、風(fēng)味改善、固氮、雜種種子的產(chǎn)生和變應(yīng)原性降低。除草劑耐受性性狀可以選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈、2,4-二氯苯氧基乙酸和達草滅除草劑耐受性。本發(fā)明包括基本上純化的核酸分子，其包含選自seqidno:1-25、38-45及其互補序列的核酸序列。這些分離的核酸可以用于實施本發(fā)明的方法。用于檢測代表大豆dna中多態(tài)性的分子標(biāo)記的分離的核酸分子可以包含至少15個包括或者鄰近該多態(tài)性的核苷酸，其中該核酸分子與包括或者鄰近該多態(tài)性的dna任一條鏈中的相同數(shù)目連續(xù)核苷酸的序列至少90％相同，并且其中該分子標(biāo)記選自seqidno:1-4和26-27。該分離的核酸可以進一步包含可檢測標(biāo)記或者提供可檢測標(biāo)記的摻入。這種可檢測標(biāo)記可以選自同位素、熒光團、抗氧化劑、還原劑、核苷酸和半抗原。這種可檢測標(biāo)記可以通過化學(xué)反應(yīng)添加到核酸上或者通過酶反應(yīng)摻入。此處提供的分離的核酸分子可以包含包括或者鄰近該多態(tài)性的dna任一條鏈上的至少16、17、18或20個核苷酸。在其它實施方案中，該分離的核酸可以與所述分子標(biāo)記的至少一個等位基因在嚴格雜交條件下雜交。與缺乏srkn抗性等位基因的大豆植物相比，通過本發(fā)明的方法選擇的大豆植物在srkn的存在下可以進一步顯示出提高的谷物產(chǎn)量。在這些方法中，與缺乏srkn抗性等位基因的植物相比，選擇的一種或多種大豆植物在srkn的存在下可以顯示出至少0.5bu/a、1.0bu/a或1.5bu/a的谷物產(chǎn)量提高。特別地，本發(fā)明涉及以下各項：1.一種將等位基因滲入大豆植物的方法，包括：a.提供大豆植物群體；b.根據(jù)選自seqidno:1-4的大豆基因組核酸標(biāo)記，對該群體中的至少一個大豆植物進行基因型分型；c.從所述群體中選擇至少一個包含至少一個與srkn抗性相關(guān)的等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因選自seqidno:21-25。2.如第1項所述的方法，其中，所述群體是通過使至少一個srkn抗性大豆植物與至少一個srkn敏感性大豆植物雜交形成群體而產(chǎn)生的。3.如第1項所述的方法，其中，所述選擇的大豆植物顯示不差于大約3.5的srkn抗性反應(yīng)等級。4.如第1項所述的方法，進一步包括步驟(d)測定所述選擇的大豆植物對誘導(dǎo)srkn的病原體的抗性。5.如第1項所述的方法，其中所述基因型通過選自單堿基延伸(sbe)、等位基因特異性引物延伸測序(aspe)、dna測序、rna測序、基于微陣列的分析、通用pcr、等位基因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜法、連接、延伸-連接和瓣核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的分析的分析方法來確定。6.如第1項所述的方法，其中，所述大豆基因組核酸標(biāo)記是seqidno:3。7.通過以下步驟產(chǎn)生的優(yōu)良大豆植物：a.提供大豆植物群體；b.根據(jù)選自seqidno:1-4的大豆基因組核酸標(biāo)記，對該群體中的至少一個大豆植物進行基因型分型；c.從所述群體中選擇至少一個包含至少一個與srkn抗性相關(guān)的等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因選自seqidno:21-25。8.如第7項所述的優(yōu)良大豆植物，其中，所述優(yōu)良大豆植物顯示轉(zhuǎn)基因性狀。9.如第8項所述的優(yōu)良大豆植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因性狀選自除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、油產(chǎn)生改變、高產(chǎn)油量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、發(fā)芽和幼苗生長的控制、動物和人類營養(yǎng)增強、低棉子糖、環(huán)境應(yīng)激抗性、可消化性提高、加工性狀改善、風(fēng)味改善、固氮、雜種種子的產(chǎn)生和變應(yīng)原性降低。10.如第9項所述的優(yōu)良大豆植物，其中，所述除草劑耐受性是對至少一種選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈、2,4-二氯苯氧基乙酸和達草滅除草劑的除草劑的耐受性。11.一種將等位基因滲入大豆植物中的方法，包括：a.提供大豆植物群體；b.用至少一種核酸標(biāo)記篩查該群體；c.從該群體中選擇一個或多個包含srkn抗性等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因是選自srkn抗性基因座的等位基因，其中在其一個或多個基因座處的一個或多個等位基因選自srkn抗性等位基因1、srkn抗性等位基因2、srkn抗性等位基因3和srkn抗性等位基因4。12.如第11項所述的方法，其中所述群體是通過使至少一個srkn抗性大豆植物與至少一個srkn敏感性大豆植物雜交形成群體而產(chǎn)生的。13.如第11項所述的方法，其中，所述選擇的大豆植物顯示不差于大約3.5的srkn抗性反應(yīng)等級。14.如第11項所述的方法，進一步包括步驟(d)測定所述選擇的大豆植物對誘導(dǎo)srkn的病原體的抗性。15.如第11項所述的方法，其中，基因型通過選自單堿基延伸(sbe)、等位基因特異性引物延伸測序(aspe)、dna測序、rna測序、基于微陣列的分析、通用pcr、等位基因特異性延伸、雜交、質(zhì)譜法、連接、延伸-連接和瓣核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的分析的分析方法來確定。16.如第11項所述的方法，其中，所述核酸標(biāo)記選自seqidno:1-4。17.如第11項所述的方法，其中，與缺乏srkn抗性等位基因的大豆植物相比，所述選擇的一個或多個大豆植物在srkn的存在下顯示谷物產(chǎn)量增加。18.如第11項所述的方法，其中，與缺乏srkn抗性等位基因的植物相比，所述選擇的一個或多個大豆植物在srkn的存在下顯示至少0.5bu/a的谷物產(chǎn)量增加。19.如第11項所述的方法，其中，與缺乏srkn抗性等位基因的植物相比，所述選擇的一個或多個大豆植物在srkn的存在下顯示至少1.0bu/a的谷物產(chǎn)量增加。20.如第11項所述的方法，其中，與缺乏srkn抗性等位基因的植物相比，所述選擇的一個或多個大豆植物在srkn的存在下顯示至少1.5bu/a的谷物產(chǎn)量增加。21.通過以下步驟產(chǎn)生的優(yōu)良大豆植物：a.提供大豆植物群體；b.用至少一種核酸標(biāo)記篩查該群體；c.從該群體中選擇一個或多個包含srkn抗性等位基因的大豆植物，其中該srkn抗性等位基因是選自srkn抗性基因座的等位基因，其中在其一個或多個基因座處的一個或多個等位基因選自srkn抗性等位基因1、srkn抗性等位基因2、srkn抗性等位基因3和srkn抗性等位基因4。22.如第21項所述的優(yōu)良大豆植物，其中，所述優(yōu)良大豆植物顯示轉(zhuǎn)基因性狀。23.如第22項所述的優(yōu)良大豆植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因性狀選自除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、油產(chǎn)生改變、高產(chǎn)油量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、發(fā)芽和幼苗生長的控制、動物和人類營養(yǎng)增強、低棉子糖、環(huán)境應(yīng)激抗性、可消化性提高、加工性狀改善、風(fēng)味改善、固氮、雜種種子的產(chǎn)生和變應(yīng)原性降低。24.如第23項所述的優(yōu)良大豆植物，其中，所述除草劑耐受性是對至少一種選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈、2,4-二氯苯氧基乙酸和達草滅除草劑的除草劑的耐受性。25.用于檢測與srkn抗性相關(guān)的基因座的基本上純化的核酸分子，包含選自seqidno:1-25、38-45及其互補序列的核酸序列。26.一種鑒定大豆植物中的srkn抗性等位基因的方法，包括檢測與選自seqidno:1-4的snp標(biāo)記相關(guān)的基因座。27.一種分離的核酸分子，用于檢測代表大豆dna中的多態(tài)性的分子標(biāo)記，其中所述核酸分子包含至少15個包括或者鄰近所述多態(tài)性的核苷酸，其中所述核酸分子與包括或者鄰近所述多態(tài)性的dna任一條鏈中的相同數(shù)目連續(xù)核苷酸的序列至少90％相同，并且其中所述分子標(biāo)記選自seqidno:1-4。28.如第27項所述的分離的核酸，其中，所述核酸進一步包含可檢測標(biāo)記或者提供可檢測標(biāo)記的摻入。29.如第28項所述的分離的核酸，其中，所述可檢測標(biāo)記選自同位素、熒光團、氧化劑、還原劑、核苷酸和半抗原。附圖說明引入說明書中并且作為其一部分的附圖說明了本發(fā)明的實施方案，并且與說明書一起用來解釋本發(fā)明的原理。在附圖中：圖1.用于srkn抗性基因座的snp標(biāo)記的列表，指示出了每種標(biāo)記的抗性和敏感等位基因。對于標(biāo)記ns0102683，有兩個抗性等位基因：a和g，其中a是抗性的，g是高度抗性的。圖2.用于檢測srkn抗性的snp標(biāo)記。snp358的抗性單元型是ta，snp199的抗性單元型是aa。每個標(biāo)記處來自兩個多態(tài)性的單元型可以用于篩選srkn抗性。核酸序列的簡要說明seqidno:1是來源于大豆的與srkn抗性基因座rmi相關(guān)的基因組序列。seqidno:2是來源于大豆的與srkn抗性基因座rmi相關(guān)的基因組序列。seqidno:3是來源于大豆的與srkn抗性基因座rmi相關(guān)的基因組序列。seqidno:4是來源于大豆的與srkn抗性基因座rmi相關(guān)的基因組序列。seqidno:5是用于擴增seqidno:1的正向pcr引物。seqidno:6是用于擴增seqidno:1的反向pcr引物。seqidno:7是用于擴增seqidno:2的正向pcr引物。seqidno:8是用于擴增seqidno:2的反向pcr引物。seqidno:9是用于擴增seqidno:3的正向pcr引物。seqidno:10是用于擴增seqidno:3的反向pcr引物。seqidno:11是用于擴增seqidno:4的正向pcr引物。seqidno:12是用于擴增seqidno:4的反向pcr引物。seqidno:13是用于檢測seqidno:1的srkn抗性基因座的探針。seqidno:14是用于檢測seqidno:1的srkn抗性基因座的第二探針。seqidno:15是用于檢測seqidno:2的srkn抗性基因座的探針。seqidno:16是用于檢測seqidno:2的srkn抗性基因座的第二探針。seqidno:17是用于檢測seqidno:3的srkn抗性基因座的探針。seqidno:18是用于檢測seqidno:3的srkn抗性基因座的第二探針。seqidno:19是用于檢測seqidno:4的srkn抗性基因座的探針。seqidno:20是用于檢測seqidno:4的srkn抗性基因座的第二探針。seqidno:21是對應(yīng)于seqidno:1的srkn抗性等位基因1。seqidno:22是對應(yīng)于seqidno:2的srkn抗性等位基因2。seqidno:23是對應(yīng)于seqidno:3的srkn抗性等位基因3。seqidno:24是對應(yīng)于seqidno:4的srkn抗性等位基因4。seqidno:25是對應(yīng)于seqidno:4的第二srkn抗性等位基因基序。seqidno:26是來源于大豆的對應(yīng)于srkn抗性基因座rmi的基因組序列。seqidno:27是來源于大豆的對應(yīng)于lg-g上的srkn抗性基因座的基因組序列。seqidno:28是用于擴增seqidno:26的正向pcr引物。seqidno:29是用于擴增seqidno:26的反向pcr引物。seqidno:30是用于擴增seqidno:27的正向pcr引物。seqidno:31是用于擴增seqidno:27的反向pcr引物。seqidno:32是用于檢測seqidno:26的srkn抗性基因座的探針。seqidno:33是用于檢測seqidno:26的srkn抗性基因座的第二探針。seqidno:34是用于檢測seqidno:27的srkn抗性基因座的探針。seqidno:35是用于檢測seqidno:27的srkn抗性基因座的第二探針。seqidno:36是對應(yīng)于seqidno:26的srkn抗性等位基因5。seqidno:37是對應(yīng)于seqidno:27的srkn抗性等位基因6。seqidno:38是用于檢測seqidno:2的srkn抗性基因座的雜交探針。seqidno:39是用于檢測seqidno:2的srkn抗性基因座的第二雜交探針。seqidno:40是用于檢測seqidno:3的srkn抗性基因座的雜交探針。seqidno:41是用于檢測seqidno:3的srkn抗性基因座的第二雜交探針。seqidno:42是用于檢測seqidno:2的srkn抗性基因座的正向單堿基延伸探針。seqidno:43是用于檢測seqidno:2的srkn抗性基因座的反向單堿基延伸探針。seqidno:44是用于檢測seqidno:3的srkn抗性基因座的正向單堿基延伸探針。seqidno:45是用于檢測seqidno:3的srkn抗性基因座的反向單堿基延伸探針。發(fā)明詳述本文提供的定義和方法限定本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實施本發(fā)明。除非另有說明，應(yīng)當(dāng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解術(shù)語。在分子生物學(xué)中的常用術(shù)語的定義也可以在以下文獻中找到：alberts等人,molecularbiologyofthecell,第5版,garlandpublishing,inc.:newyork,2007；rieger等人,glossaryofgenetics:classicalandmolecular,第5版,springer-verlag:newyork,1991；king等人,adictionaryofgenetics,第6版,oxforduniversitypress:newyork,2002；和lewin,genesix,oxforduniversitypress:newyork,2007。使用如37cfr§1.822所述的dna堿基命名法?！暗任换颉敝柑囟ǖ幕蜃幍奶娲蛄?；等位基因的長度可以小到1個核苷酸堿基，但通常較大。等位基因序列可以表示為核酸序列或由該核酸序列編碼的氨基酸序列?！盎蜃笔窃谕ǔＳ蓞⒄拯c發(fā)現(xiàn)的基因組序列上的位置；例如，作為基因或基因部分或基因間區(qū)域的短dna序列。本發(fā)明的基因座在群體中包含一種或多種多態(tài)性，即，在一些個體中存在替代的等位基因。如本文所用，“多態(tài)性”是指在一個或多個個體的群體中存在一個或多個基因座處的核酸序列的一種或多種變異。變異可以包括但不限于一個或多個堿基的變化、一個或多個核苷酸的插入或一個或多個核苷酸的缺失。多態(tài)性的產(chǎn)生可能是由于核酸復(fù)制中的隨機過程，通過誘變，由于移動的基因組元件，拷貝數(shù)變異，和減數(shù)分裂過程，如不等交換、基因組復(fù)制和染色體斷裂和融合。在群體中，變異可能經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)或可能以低頻率存在，前者在普通植物育種中具有更大的應(yīng)用，而后者則可能與罕見但重要的表型變異有關(guān)。有用的多態(tài)性可包括單核苷酸多態(tài)性(snp)、dna序列中的插入或缺失(indel)、dna序列的簡單序列重復(fù)(ssr)、限制性片段長度多態(tài)性以及標(biāo)簽snp。遺傳標(biāo)記、基因、dna衍生序列、單元型、rna衍生序列、啟動子、基因的5'非翻譯區(qū)、基因的3'非翻譯區(qū)、microrna、sirna、qtl、衛(wèi)星標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、mrna、dsmrna、轉(zhuǎn)錄概況以及甲基化模式可能包括多態(tài)性。另外，上述這些的存在、不存在或拷貝數(shù)的變化可能包括多態(tài)性。如本文所用，“標(biāo)記”是指可用于區(qū)別生物體的可檢測的特征。這樣的特征的例子可包括遺傳標(biāo)記、蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)水平、油組成、油水平、碳水化合物組成、碳水化合物水平、脂肪酸組成、脂肪酸水平、氨基酸組成、氨基酸水平、生物聚合物、藥品、淀粉組成、淀粉水平、可發(fā)酵的淀粉、發(fā)酵產(chǎn)量、發(fā)酵效率、能量產(chǎn)量、次生化合物、代謝物、形態(tài)特征和農(nóng)藝學(xué)特征。如本文所用，“遺傳標(biāo)記”是指多態(tài)性核酸序列或核酸特征。遺傳標(biāo)記可由一個或多個特定的變異序列或共有序列代表。在另一種意義上，“遺傳標(biāo)記”是分離的變異體或這種序列的共有序列。如本文所用，“標(biāo)記試驗”指使用特定方法檢測特定基因座處的多態(tài)性的方法，例如，至少一種表型的測定(如種子顏色、花的顏色或其它視覺可檢測的性狀)、限制性片段長度多態(tài)性(rflp)、單堿基延伸、電泳、序列比對、等位基因特異性寡核苷酸雜交(aso)、隨機擴增的多態(tài)性dna(rapd)、基于微陣列的技術(shù)和核酸測序技術(shù)等。如本文所用，“分型”(“typing”)指確定給定的大豆基因組多態(tài)性的特定等位基因形式的任何方法。例如，通過確定存在哪種核苷酸(即，a、g、t或c)，對單核苷酸多態(tài)性(snp)進行分型。通過確定是否存在indel來確定插入/缺失(indel)。通過包括但不僅限于標(biāo)記分析的多種分析方法可以對indel進行分型。如本文所用，術(shù)語“鄰近”，當(dāng)用來描述與包含多態(tài)性的dna雜交的核酸分子時，指的是與直接緊靠該多態(tài)性核苷酸堿基位置的dna序列雜交的核酸。例如，可在單堿基延伸試驗中使用的核酸分子“鄰近”該多態(tài)性。如本文所用，“探詢位置”是指固體載體上的物理位置，可以對其進行查詢以獲取一個或多個預(yù)定的基因組多態(tài)性的基因分型數(shù)據(jù)。如本文所用，“共有序列”是指構(gòu)建的dna序列，其確定基因座處等位基因的snp和indel多態(tài)性。共有序列可以基于基因座處dna的任一鏈，并且表示該基因座中每種snp的任一個的核苷酸堿基及該基因座中的所有indel的核苷酸堿基。因此，雖然共有序列可能不是一個實際的dna序列的拷貝，但共有序列可用于精確設(shè)計用于基因座中的實際多態(tài)性的引物和探針。如本文所用，術(shù)語“單核苷酸多態(tài)性”，也縮寫為“snp”，是指單個位點上的多態(tài)性，其中，所述多態(tài)性構(gòu)成單堿基對改變、一個或多個堿基對的插入或一個或多個堿基對的缺失。如本文所用，術(shù)語“單元型”是指由至少一種多態(tài)性分子標(biāo)記限定的單元型窗口內(nèi)的染色體區(qū)域。每個單元型窗口中的獨特的標(biāo)記指紋組合限定了該窗口的各個單元型。此外，例如重組導(dǎo)致的單元型的變化可能導(dǎo)致單元型的修飾，使其只包含與性狀可操作地連鎖的初始(親本)單元型的一部分，例如，通過與基因、qtl或轉(zhuǎn)基因物理連鎖。單元型中的任何這樣的變化都包括在我們對于構(gòu)成單元型的內(nèi)容的定義中，只要該基因組區(qū)域的功能完整性不變或改善。如本文所用，術(shù)語“單元型窗口”是指通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的統(tǒng)計分析建立的，且處于連鎖不平衡的染色體區(qū)域。因此，將位于該區(qū)域內(nèi)的一個或多個分子標(biāo)記基因座處的兩個近交個體(或兩個配子)之間的狀態(tài)同一性(identitybystate)作為整個區(qū)域的譜系同一性(identity-by-descent)的證據(jù)。每個單元型窗口包含至少一個多態(tài)性分子標(biāo)記。單元型窗口可以沿基因組中的每個染色體作圖。單元型窗口本身不是固定不變的，且考慮到逐漸增加的分子標(biāo)記密度，本發(fā)明預(yù)計單元型窗口的數(shù)目和大小將會發(fā)展，窗口數(shù)目逐漸增加，其各自的大小逐漸減小，從而導(dǎo)致在根據(jù)標(biāo)記基因座的狀態(tài)同一性確定譜系同一性方面的置信度逐漸增加。如本文所用，“基因型”是指表型的遺傳部分，且可以使用標(biāo)記間接表征，或通過核酸測序直接表征。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括表型特性、代謝譜、遺傳標(biāo)記或一些其它類型的標(biāo)記?；蛐涂梢詷?gòu)成至少一個遺傳標(biāo)記基因座的等位基因或至少一個單元型窗口的單元型。在某些實施方案中，基因型可以代表單個基因座，而在其它實施方案中，它可以代表整個基因組寬的一組基因座。在另一種實施方案中，基因型可以反映染色體的一部分、整個染色體、基因組的一部分和整個基因組的序列。如本文所用，“表型”是指可能受基因表達影響的細胞或生物體的可檢測的特征。如本文所用，“連鎖”是指雜交產(chǎn)生配子類型的相對頻率。例如，如果基因座a具有基因“a”或“a”，基因座b具有基因“b”或“b”，具有aabb的親本i與具有aabb的親本b之間的雜交將產(chǎn)生4種可能的配子，其中基因分離為ab、ab、ab和ab?？疹A(yù)期為獨立相等地分離成4個可能的基因型中的每一個，即，如果沒有連鎖，每個基因型將會有1/4的配子。配子分離成基因型不等于1/4是由于連鎖。如本文所用，“連鎖不平衡”，是針對一代的許多個體的群體中配子類型的相對頻率而定義的。如果等位基因a的頻率是p，a是p'，b是q，b是q'，那么基因型ab的預(yù)期頻率(沒有連鎖不平衡)是pq，ab是pq’，ab是p’q，ab是p’q’。相對于預(yù)期頻率的任何偏差稱為連鎖不平衡。當(dāng)兩個基因座處于連鎖不平衡時，它們被稱為是“遺傳連鎖的”。如本文所用，“數(shù)量性狀基因座(qtl)”指在一定程度上控制通常連續(xù)分布的、可用數(shù)字表示的性狀的基因座。如本文所用，“抗性等位基因”是指包括與srkn抗性相關(guān)的多態(tài)性等位基因的核酸序列。如本文所用，術(shù)語“大豆”是指大豆(glycinemax)，且包括可用包括野生大豆種在內(nèi)的大豆培育出的所有植物品種。如本文所用，術(shù)語“包括”指“包括但不限于”。如本文所用，術(shù)語“優(yōu)良品系”指通過針對優(yōu)異的農(nóng)藝學(xué)表現(xiàn)進行育種和選擇而產(chǎn)生的任何品系。農(nóng)民或大豆育種者可以買到的優(yōu)良大豆品種的非限制性的例子包括ag00802、a0868、ag0902、a1923、ag2403、a2824、a3704、a4324、a5404、ag5903和ag6202(asgrowseeds,desmoines,iowa,usa)；bpr0144rr、bpr4077nrr和bpr4390nrr(bioplantresearch,camppoint,illinois,usa)；dkb17-51和dkb37-51(dekalbgenetics,dekalb,illinois,usa)；及dp4546rr和dp7870rr(delta&pinelandcompany,lubbock,texas,usa)；jg03r501、jg32r606cadd和jg55r503c(jglinc.,greencastle,indiana,usa)；nks13-k2(nkdivisionofsyngentaseeds,goldenvalley,minnesota,usa)；90m01、91m30、92m33、93m11、94m30、95m30和97b52(pioneerhi-bredinternational,johnston,iowa,usa)；sg4771nrr和sg5161nrr/sts(soygenetics,llc,lafayette,indiana,usa)；s00-k5、s11-l2、s28-y2、s43-b1、s53-a1、s76-l9和s78-g6(syngentaseeds,henderson,kentucky,usa)。優(yōu)良植物是來自優(yōu)良品種的代表性的植物。本發(fā)明提供了可用于篩選位于連鎖群o和連鎖群g上的srkn抗性qtl的snpdna標(biāo)記(cregan,等人cropsci.39:1464-1490(1999))。用來監(jiān)測連鎖群o上的srkn抗性qtlrmi的滲入的snp標(biāo)記包括選自ns0094902、ns0097935、ns0135583、ns0102683和snp358的那些。snp標(biāo)記snp199用來監(jiān)測連鎖群g上的srkn抗性qtl的滲入。在本發(fā)明中，說明性srkn抗性基因座rmisnp標(biāo)記序列(seqidno:1)可以使用如seqidno:5和6所示的引物擴增，并且利用如seqidno:13或14所示的探針檢測。說明性srkn抗性基因座rmisnp標(biāo)記序列(seqidno:2)可以使用如seqidno:7和8所示的引物擴增，并且利用如seqidno:15、16、38、39、42或43所示的探針檢測。說明性srkn抗性基因座rmisnp標(biāo)記序列(seqidno:3)可以使用如seqidno:9和10所示的引物擴增，并且利用如seqidno:17、18、40、41、44或45所示的探針檢測。說明性srkn抗性基因座rmisnp標(biāo)記序列(seqidno:4)可以使用如seqidno:11和12所示的引物擴增，并且利用如seqidno:19或20所示的探針檢測。說明性srkn抗性基因座rmisnp標(biāo)記序列(seqidno:26)可以使用如seqidno:28和29所示的引物擴增，并且利用如seqidno:32或33所示的探針檢測。說明性srkn抗性基因座rmisnp標(biāo)記序列(seqidno:27)可以使用如seqidno:30和31所示的引物擴增，并且利用如seqidno:34或35所示的探針檢測。本發(fā)明也提供了包含選自seqidno:21-25、36-37及其互補序列的核酸序列的大豆植物。本發(fā)明還提供了包含選自seqidno:1-4、25和26、其片段和它們的互補序列的核酸序列的大豆植物。本發(fā)明還提供了包含選自seqidno:5-20和27-34、它們的片段和它們的互補序列的核酸序列的大豆植物。在一個方案中，大豆植物包含選自seqidno:21-25、36-37及其互補序列的2、3或4個核酸序列。在另一方案中，大豆植物包含選自seqidno:1-4、26和27、它們的片段和它們的互補序列的2、3或4個核酸序列。在進一步的方案中，大豆植物包含選自seqidno:5-20和27-34、它們的片段和它們的互補序列的2、3或4個核酸序列。如本文使用的srkn是指任何srkn變種或分離種。本發(fā)明的大豆植物可以對一種或多種能夠引起或誘導(dǎo)srkn的線蟲具有抗性。一方面，本發(fā)明提供了srkn抗性植物以及用于根據(jù)對根結(jié)線蟲屬引起的srkn的抗性或敏感性篩選大豆植物的方法和組合物。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了用于根據(jù)對南方根結(jié)線蟲的抗性或敏感性篩選大豆植物的方法和組合物。本發(fā)明進一步提供，選擇的植物來自大豆屬(glycine)的成員，更特別地來自glycinearenaria、glycineargyrea、glycinecanescens、glycineclandestine、glycinecurvata、glycinecyrtoloba、glycinefalcate、glycinelatifolia、glycinelatrobeana、glycinemax、glycinemicrophylla、glycinepescadrensis、glycinepindanica、glycinerubiginosa、野大豆(glycinesoja)、大豆屬的種(glycinesp.)、glycinestenophita、glycinetabacina和短絨野大豆(glycinetomentella)。本發(fā)明的植物可以是具有非常高的抗性、抗性、基本抗性、中度抗性、相當(dāng)?shù)目剐浴⒉糠挚剐?、中度敏感性或敏感性的大豆植物。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了將要通過任何方法測定其對srkn的抗性或敏感性的大豆植物，以確定大豆植物是否具有非常高的抗性、抗性、基本抗性、中度抗性、相當(dāng)?shù)目剐?、部分抗性、中度敏感性或敏感性。一方面，本發(fā)明提供了用于根據(jù)對南方根結(jié)線蟲種引起的srkn的抗性、免疫性或敏感性篩選大豆植物的方法和組合物。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了用于根據(jù)對南方根結(jié)線蟲的抗性、免疫性或敏感性篩選大豆植物的方法和組合物。針對對srkn的抗性、免疫性或敏感性，基于蟲癭(gall)或卵群(eggmass)的數(shù)目，對大豆植物進行表型分型和打分(taylor和sasser,biology,identificationandcontrolofroot-knotnematodes(meloidogynespecies):acooperativepublicationofthedepartmentofplantpathology.p.111(1978))。本發(fā)明的srkn抗性等位基因可以被引入優(yōu)良大豆品系中?！皟?yōu)良品系”是通過針對優(yōu)異的農(nóng)藝學(xué)表現(xiàn)進行育種和選擇而產(chǎn)生的任何品系。本發(fā)明的srkn抗性等位基因也可以被引入包含一種或多種以下基因的優(yōu)良大豆轉(zhuǎn)基因植物中：除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、油產(chǎn)生改變、高產(chǎn)油量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、發(fā)芽和幼苗生長的控制、動物和人類營養(yǎng)增強、低棉子糖、環(huán)境應(yīng)激抗性、可消化性提高、工業(yè)酶、藥用蛋白質(zhì)、肽和小分子、加工性狀改善、風(fēng)味改善、固氮、雜種種子的產(chǎn)生、變應(yīng)原性降低、生物聚合物和生物燃料等。這些農(nóng)藝學(xué)性狀可通過植物生物技術(shù)方法在大豆中作為轉(zhuǎn)基因提供。一種或多種抗病性qtl等位基因可以從任何包含該等位基因的植物(供體)引入到任何接受體大豆植物中。一方面，接受體大豆植物可以包含另外的srkn抗性基因座。另一方面，接受體大豆植物可以包含轉(zhuǎn)基因。另一方面，在保持引入的qtl的同時，可以通過回交或其它合適的方法來減少提供抗病性qtl的植物的遺傳貢獻。一方面，來自大豆植物中的供體材料的核遺傳物質(zhì)可能少于或是大約50％、少于或是大約25％、少于或是大約13％、少于或是大約5％、3％、2％或1％，但該遺傳物質(zhì)包含一種或多種感興趣的srkn抗性基因座。進一步可以理解，本發(fā)明的大豆植物可能顯示任何相對成熟組的特征。一方面，成熟組選自組000、00、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。qtl的等位基因可以包含多個基因或其它遺傳因素，甚至在連續(xù)基因組區(qū)域或連鎖群如單元型內(nèi)。如本文所用的，抗性基因座的等位基因可以包含一個以上的基因或其它遺傳因素，其中，每個單獨的基因或遺傳組分也能夠顯示等位基因變異，并且其中每個基因或遺傳因素也能夠引發(fā)對所述數(shù)量性狀的表型效應(yīng)。在本發(fā)明的一方面，qtl的等位基因包含也能夠顯示等位基因變異的一個或多個基因或其它遺傳因素。術(shù)語“qtl的等位基因”的使用并不排除包含一個以上的基因或其它遺傳因素的qtl。特別是，本發(fā)明中的“qtl的等位基因”可以表示單元型窗口中的單元型，其中表型可以是害蟲抗性。單元型窗口是可以用一組一個或多個多態(tài)性標(biāo)記定義和示蹤的連續(xù)的基因組區(qū)域，其中，多態(tài)性指示譜系同一性。該窗口中的單元型可以通過每個標(biāo)記處的等位基因的獨特指紋確定。如本文所用的，等位基因是占據(jù)染色體上給定基因座的基因的幾種替代形式之一。當(dāng)染色體上的給定基因座處存在的所有等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果染色體上的給定基因座處存在的等位基因不同，該植物在該基因座處是雜合的。本發(fā)明的植物在任何特定的srkn抗性基因座處或?qū)τ谔囟ǖ亩鄳B(tài)性標(biāo)記，可能是純合或雜合的。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的植物的部分。植物部分包括但不限于，種子、胚乳、胚珠和花粉。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面，植物部分是種子。本發(fā)明也提供了大豆的容器，該容器中超過50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的種子包含srkn抗性基因座，其中該基因座處的一個或多個等位基因選自srkn抗性等位基因1、srkn抗性等位基因2、srkn抗性等位基因3或srkn抗性等位基因4。大豆種子的容器可以含有任何數(shù)量、重量或體積的種子。例如，容器可以含有至少或超過大約10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、80、90、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000個或更多的種子。另一方面，容器可以含有大約或超過大約1克、5克、10克、15克、20克、25克、50克、100克、250克、500克或1000克種子。此外，容器可以含有至少或超過大約0盎司、1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅、10磅、15磅、20磅、25磅或50磅或更多的種子。大豆種子的容器可以是本領(lǐng)域中可以獲得的任何容器。例如，容器可以是盒子、袋子、罐、包、囊、卷帶、桶或管。另一方面，大豆種子的容器中含有的種子可以是處理過的或未處理的大豆種子。一方面，種子可以經(jīng)過處理以改善發(fā)芽，例如通過引發(fā)種子或者通過消毒以防御種子攜帶的病原體。另一方面，種子可以用任何可以使用的涂層涂覆，以改善例如可種植性、種子發(fā)芽和防御種子攜帶的病原體。種子涂層可以是任何形式的種子涂層，包括但不限于?；?、薄膜涂層和硬外層。本發(fā)明的植物或其部分可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和再生。從各種組織類型再生大豆植物的方法和大豆的組織培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，widholm等人,invitroselectionandculture-inducedvariationinsoybean,insoybean:genetics,molecularbiologyandbiotechnology,verma和shoemaker編,cabinternational,wallingford,oxon,england(1996))。如大豆的植物的再生技術(shù)可以使用多種組織或細胞類型作為起始原料。尤其是對于大豆，已經(jīng)開發(fā)了再生方法，其開始于某些分化的組織類型，如，分生組織(cartha等人,can.j.bot.59:1671-1679(1981))、下胚軸節(jié)(cameya等人,plantscienceletters21:289-294(1981))和莖節(jié)點段(saka等人,plantscienceletters,19:193-201(1980)；cheng等人,plantscienceletters,19:91-99(1980))。已報道了由未成熟大豆胚的外植體產(chǎn)生的體細胞胚再生完整的性成熟的大豆植物(ranch等人,invitrocellular&developmentalbiology21:653-658(1985))。也已報道了通過器官發(fā)生和胚發(fā)生從組織培養(yǎng)物再生成熟大豆植物(barwale等人,planta167:473-481(1986)；wright等人,plantcellreports5:150-154(1986))。qtl的抗病性效果可能隨各個基因型和測定抗病性效果的環(huán)境條件而變化。植物育種領(lǐng)域的技術(shù)人員不需要過多的實驗就可以利用此處所述的方法從植物群體中或從親本基因型集合中選擇那些當(dāng)含有病害基因座時導(dǎo)致相對于該基因型抗病性增強的植物。本發(fā)明包括一種將等位基因滲入大豆植物中的方法，包括：(a)使至少一個包含選自seqidno:21-25、36和37的核酸序列的第一大豆植物與至少一個第二大豆植物雜交，以形成群體，(b)用一種或多種核酸標(biāo)記篩查該群體，以確定來自該群體的一個或多個大豆植物是否含有該核酸序列，和(c)從該群體中選擇一個或多個包含選自seqidno:21-25、36和37的核酸序列的大豆植物。本發(fā)明包括一種將等位基因滲入大豆植物中的方法，包括：(a)使至少一個srkn抗性大豆植物與至少一個srkn敏感性植物雜交，以形成群體，(b)用一種或多種核酸標(biāo)記篩查所述群體，以確定來自所述群體的一個或多個大豆植物是否在lg-o或lg-g上含有srkn抗性基因座。本發(fā)明包括分離的核酸分子。這些分子包括那些與srkn基因座遺傳或物理連鎖的能夠檢測多態(tài)性的核酸分子。這些分子可以被稱為標(biāo)記?？梢酝ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)獲得與srkn抗性基因座連鎖的另外的標(biāo)記。一方面，核酸分子能夠檢測是否存在位于距離srkn抗性基因小于30、25、20、15、10、5、2或1厘摩(centimorgans)的標(biāo)記。另一方面，使用qgeneversion2.23(1996)和默認參數(shù)進行srkn測定，標(biāo)記顯示2或更高、3或更高、4或更高的lod得分。另一方面，核酸分子能夠檢測選自srkn抗性基因座rmi的基因座中的標(biāo)記。在另一方面，核酸分子能夠檢測srkn抗性qtl中的標(biāo)記。在進一步的方面，核酸分子選自seqidno:1-4、26和27、其片段、其互補序列及能夠與這些核酸分子中的一個或多個特異性雜交的核酸分子。在優(yōu)選的一方面，本發(fā)明的核酸分子包括那些在中度嚴格條件(例如，大約2.0xssc和大約65℃)下與seqidno:1至seqidno:45所示的一個或多個核酸分子或其互補分子或其中任一個的片段特異性雜交的核酸分子。在特別優(yōu)選的一方面，本發(fā)明的核酸在高嚴格條件下與seqidno:1至seqidno:45所示的一個或多個核酸分子或互補分子或其中任一個的片段特異性雜交。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子具有seqidno:1至seqidno:45所示的核酸序列或其互補序列或其中任一個的片段。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子與seqidno:1至seqidno:45所示的核酸序列或其互補序列或其中任一個的片段共有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本發(fā)明的進一步的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子與seqidno:1至seqidno:45所示的核酸序列或其互補序列或其中任一個的片段共有95％-100％的序列同一性。在本發(fā)明的更優(yōu)選的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子與seqidno:1至seqidno:45所示的核酸序列或其互補序列或其中任一個的片段共有98％-100％的序列同一性。核酸分子或其片段在某些情況下能夠與其它核酸分子特異性雜交。如本文所用，如果兩個核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，那么這兩個分子能夠彼此特異性雜交。如果它們表現(xiàn)出完全的互補性，則一核酸分子與另一核酸分子“互補”。如本文所用，當(dāng)一個分子的每個核苷酸都與另一分子的核苷酸互補時，這兩個分子顯示“完全互補”。如果兩個分子在至少常規(guī)的“低嚴格”的條件下能互相雜交，具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們保持彼此退火，那么這兩個分子是“最低限度互補的”。類似地，如果兩個分子在常規(guī)的“高嚴格”的條件下能互相雜交，具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們保持彼此退火，那么這兩個分子是“互補的”。sambrook等人,in:molecularcloning,alaboratorymanual,2ndedition,coldspringharborpress,coldspringharbor,newyork(1989)與haymes等人,in:nucleicacidhybridization,apracticalapproach,irlpress,washington,dc(1985)描述了常規(guī)的嚴格條件。因而偏離完全互補性是允許的，只要這種偏離沒有完全消除該分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子作為引物或探針，只需要在序列上充分互補，以在所采用的特定的溶劑和鹽濃度下能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如本文所用，基本上同源的序列是在高嚴格條件下與所比較的核酸序列的互補序列特異性雜交的核酸序列。本發(fā)明的核酸探針和引物可以在嚴格條件下與靶dna序列雜交。術(shù)語“嚴格的雜交條件”是指在該條件下，探針或引物特異性地與靶序列雜交而不與非靶序列雜交，這可以根據(jù)經(jīng)驗確定。術(shù)語“嚴格的條件”是功能上的定義，涉及通過sambrook等人,1989,9.52-9.55所述的具體的雜交程序，核酸探針與靶核酸(即，與感興趣的特定核酸序列)的雜交。也參見sambrook等人,19899.47-9.52,9.56-9.58；kanehisa1984nucl.acidsres.12:203-213；wetmur等人1968j.mol.biol.31:349-370。促進dna雜交的合適的嚴格條件是，例如，大約45℃、6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)，接著50℃、2.0xssc洗滌，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，或可以在currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.,1989,6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從大約2.0xssc、50℃的低嚴格條件到大約0.2xssc、50℃的高嚴格條件中選擇。另外，洗滌步驟中的溫度可以從低嚴格條件的室溫大約22℃增加到高嚴格條件的大約65℃。溫度和鹽都可以變化，或者，溫度或鹽濃度可以保持不變，而另一個變量發(fā)生變化。本發(fā)明考慮，如果保持探針或引物與靶序列結(jié)合的特異性，可以使用如較低的雜交和/或洗滌溫度的較低嚴格雜交條件，來確認具有較低的序列相似性的相關(guān)的序列。因此，本發(fā)明的核苷酸序列可用于選擇性地與dna、rna或cdna片段的互補延伸形成雙鏈分子的能力。核酸分子片段可以是任何大小的片段，且示例性的片段包括seqidno:1至seqidno:45所示的核酸序列及其互補序列的片段。一方面，片段可以是15-25、15-30、15-40、15-50、15-100、20-25、20-30、20-40、20-50、20-100、25-30、25-40、25-50、25-100、30-40、30-50及30-100。另一方面，片段可以是大于10、15、20、25、30、35、40、50、100或250個核苷酸。本發(fā)明的遺傳標(biāo)記包括“顯性”或“共顯性”標(biāo)記?！肮诧@性標(biāo)記”揭示兩個或多個等位基因的存在(每個二倍體個體中有兩個)?！帮@性標(biāo)記”揭示只存在一個等位基因。顯性標(biāo)記表型(例如，dna帶)的存在表明在純合或雜合條件下存在一個等位基因。不存在顯性標(biāo)記表型(例如，不存在dna帶)僅能證明存在“某些其它”不明確的等位基因。在群體中的個體主要是純合的且基因座主要是二態(tài)性(dimorphic)的情況下，顯性和共顯性標(biāo)記可能具有同樣的價值。隨著群體變得越來越雜合和多等位基因化(multiallelic)，共顯性標(biāo)記往往比顯性標(biāo)記提供更多的基因型信息?？梢允褂门c本發(fā)明的qtl的等位基因遺傳連鎖或相關(guān)的標(biāo)記，如單序列重復(fù)標(biāo)記(ssr)、aflp標(biāo)記、rflp標(biāo)記、rapd標(biāo)記、表型標(biāo)記、snp、同工酶標(biāo)記、微陣列、轉(zhuǎn)錄概況(walton,1993；burow等人.1988)。鑒定這些標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域中已知的。通過使用核酸擴增方法可有利于dna、rna或cdna樣品中的多態(tài)性位點的檢測。這些方法特異性地增加了跨越多態(tài)性位點或包含該位點和位于其遠端或近端的序列的多核苷酸的濃度。這些擴增的分子可以通過凝膠電泳、熒光檢測方法或其它方法很容易地檢測。實現(xiàn)這種擴增的一種方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)(mullis等人1986coldspringharborsymp.quant.biol.51:263-273；歐洲專利50,424；歐洲專利84,796；歐洲專利258,017；歐洲專利237,362；歐洲專利201,184；美國專利4,683,202；美國專利4,582,788；和美國專利4,683,194)，其中使用能夠與以雙鏈形式限定多態(tài)性的近端序列雜交的引物對。在一種優(yōu)選的檢測多態(tài)性的方法中，可以通過美國專利5,210,015、5,876,930和6,030,787中公開的方法檢測snp和indel，其中，寡核苷酸探針具有與探針的5'和3'端共價連接的5'熒光報告染料3'猝滅染料。當(dāng)探針完整時，報告染料接近猝滅染料導(dǎo)致報告染料熒光被抑制，例如通過由福斯特型能量轉(zhuǎn)移(forster-typeenergytransfer)。在pcr正向和反向引物與位于多態(tài)性兩側(cè)的靶dna的特定序列雜交過程中，雜交探針與位于擴增的pcr產(chǎn)物中的含有多態(tài)性的序列雜交。在隨后的pcr循環(huán)中，具有5’→3’核酸外切酶活性的dna聚合酶切開探針，并分離報告染料與猝滅染料，導(dǎo)致報告染料的熒光增強。一種有用的試驗是可從abbiosystems獲得的試驗，其在一個反應(yīng)中采用4種合成寡核苷酸，其同時擴增大豆基因組dna，區(qū)別存在的等位基因，并直接提供用于區(qū)別和檢測的信號。4種寡核苷酸中的2種作為pcr引物，并產(chǎn)生包含待檢測的多態(tài)性的pcr產(chǎn)物。另外兩個是等位基因特異性熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)探針。在這種試驗中，使用兩種攜帶不同的熒光報告染料的fret探針，其中，將獨特的染料摻入可以與兩個等位基因中的僅僅一個高特異性退火的寡核苷酸中。有用的報告染料包括但不限于6-羧基-4,7,2’,7’-四氯熒光素(tet)、2'-氯-7'-苯基-1,4-二氯-6-羧基熒光素(vic)和6-羧基熒光素亞磷酰胺(fam)。一種有用的猝滅劑是6-羧基-n,n,n’,n’-四甲基羅丹明(tamra)。此外，化學(xué)封閉每個fret探針的3’末端，使得它不能作為pcr引物發(fā)揮作用。也提供了用作被動參比的第三熒光團，例如羅丹明x(rox)，以幫助相關(guān)熒光值在隨后的標(biāo)準(zhǔn)化(校正反應(yīng)裝配中的空間誤差)。在每一個pcr循環(huán)中，fret探針以等位基因特異性的方式與模板dna分子退火。當(dāng)酶遇到退火探針的5'端時，退火的(不是非退火的)fret探針被taqdna聚合酶降解，從而從猝滅劑附近釋放出熒光團，其中使用熒光光度法確定兩種熒光團各自的熒光，以及被動參比的熒光。兩種染料各自的熒光的標(biāo)準(zhǔn)化強度與樣本中最初存在的每種等位基因的量成比例，因此，可以推斷出樣本的基因型。為了qtl作圖，包括的標(biāo)記應(yīng)當(dāng)是來源特征性的，以對隨后的群體作出推斷。snp標(biāo)記對于作圖是理想的，因為特定的snp等位基因源自特定物種的現(xiàn)存群體中的獨立來源的可能性較低。因此，snp標(biāo)記可用于示蹤和輔助qtl的滲入，特別是在為作為單元遺傳的緊密連鎖的等位基因的單元型的情況下?？梢酝ㄟ^基因作圖模型建立另外的標(biāo)記分子的遺傳連鎖，所述基因作圖模型例如，但不限于，lander等人(lander等人,genetics,121:185-199(1989))報道的側(cè)翼標(biāo)記模型，和區(qū)間作圖(intervalmapping)，其基于其中所述的最大似然法，并用軟件包mapmaker/qtl執(zhí)行(lincoln和lander,mappinggenescontrollingquantitativetraitsusingmapmaker/qtl,whiteheadinstituteforbiomedicalresearch,massachusetts,(1990))。另外的軟件包括qgene,version2.23(1996),departmentofplantbreedingandbiometry,266emersonhall,cornelluniversity,ithaca,ny。使用qgene軟件是一種特別優(yōu)選的方法。對于標(biāo)記的存在，計算最大似然估計值(mle)，以及假設(shè)沒有qtl效應(yīng)的mle，以避免假陽性。然后計算優(yōu)勢率的log10(lod)：lod＝log10(存在qtl的mle/假定沒有連鎖qtl的mle)。lod得分基本上指示，假定存在qtl，相對于不存在qtl，數(shù)據(jù)增大的可能性有多大。對于給定的置信度，比如95％，為了避免假陽性的lod閾值取決于標(biāo)記的數(shù)量和基因組的長度。lander等人(1989)說明了顯示lod閾值的曲線圖，且arús和moreno-gonzález,plantbreeding,hayward,bosemark,romagosa(編)chapman&hall,london,第314-331頁(1993)進一步對其描述?？梢允褂昧硗獾哪Ｐ汀Ｒ呀?jīng)報導(dǎo)了對于區(qū)間作圖的許多修改和可供選擇的方法，包括使用非參數(shù)法(kruglyak等人,1995genetics,139:1421-1428)。也可以使用多元回歸方法或模型，其中，在大量標(biāo)記上對性狀進行回歸(jansen,biometricsinplantbreed,vanoijen,jansen(編)proceedingsoftheninthmeetingoftheeucarpiasectionbiometricsinplantbreeding,thenetherlands,第116-124頁(1994)；weber和wricke,advancesinplantbreeding,blackwell,berlin,16(1994))。jansen等人(jansen等人,genetics,136:1447-1455(1994))和zeng(zeng,genetics136:1457-1468(1994))報道了組合了區(qū)間作圖與回歸分析的程序，由此將表型回歸到給定的標(biāo)記區(qū)間的單個假定的qtl上，且同時回歸到作為'輔助因素'的標(biāo)記數(shù)量上。一般來說，輔助因素的使用減少了估計的qtl位置的偏差和抽樣誤差(utz和melchinger,biometricsinplantbreeding,vanoijen,jansen(編)proceedingsoftheninthmeetingoftheeucarpiasectionbiometricsinplantbreeding,thenetherlands,第195-204頁(1994))，從而提高qtl作圖的精度和效率(zeng1994)。這些模型可以擴展到多環(huán)境實驗，以分析基因型-環(huán)境的相互作用(jansen等人,1995theor.appl.genet.91:33-3)。合適的作圖群體的選擇對于圖譜的構(gòu)建是重要的。合適的作圖群體的選擇取決于所用的標(biāo)記系統(tǒng)的類型(tanksley等人,molecularmappinginplantchromosomes.chromosomestructureandfunction:impactofnewconceptsj.p.gustafson和r.appels(編).plenumpress,newyork,第157-173頁(1988))。必須考慮在作圖群體中所用的親本的來源(適應(yīng)的相對于外來的)。染色體配對和重組率在遠緣雜交(適應(yīng)的×外來的)中會受到嚴重干擾(抑制)，且一般產(chǎn)生大大降低的連鎖距離。與近緣雜交(適應(yīng)的×適應(yīng)的)的后代相比，遠緣雜交通常會提供具有相對較大的多態(tài)性陣列的分離群體。f2群體是自交的第一代。通常一個f1植物自交，產(chǎn)生所有基因都以孟德爾(1:2:1)方式分離的群體。使用共顯性標(biāo)記系統(tǒng)從完全分類的f2群體中獲得最大遺傳信息(mather,measurementoflinkageinheredity:methuenandco.,(1938))。在顯性標(biāo)記的情況中，需要后代測試(例如f3,bcf2)來確定雜合子，從而使其等同于完全分類的f2群體。但是由于后代測試的成本和時間原因，這一程序通常是不可行的。f2個體的后代測試通常在其中表型不能一貫地反映基因型(例如抗病性)或性狀表達受qtl控制的圖譜構(gòu)建中使用。來自后代測試群體(例如f3或bcf2)的分離數(shù)據(jù)可以在圖譜構(gòu)建中使用。然后可以基于標(biāo)記-性狀圖譜關(guān)聯(lián)(f2,f3)，對雜交后代進行標(biāo)記輔助的選擇，其中連鎖群沒有被重組事件完全分離(即最大不平衡)。重組近交系(ril)(遺傳相關(guān)的系，通常是>f5，從繼續(xù)自交的f2系向純合性發(fā)展)可以作為作圖群體使用。通過使用ril可以將從顯性標(biāo)記獲得的信息最大化，因為所有的基因座都是純合的或接近純合。在緊密連鎖的條件下(即，大約<10％的重組)，對于每個個體，在ril群體中評估的顯性和共顯性標(biāo)記比在回交群體中的每個標(biāo)記類型提供更多的信息(reiter等人,1992proc.natl.acad.sci.(usa)89:1477-1481)。然而，由于標(biāo)記之間的距離增大(即，基因座變得更加獨立)，ril群體中的信息明顯減少。回交群體(例如，通過成功的品種(輪回親本)和攜帶前者不具有的性狀的另一品種(供體親本)之間雜交產(chǎn)生)可作為作圖群體來使用?？梢耘c輪回親本進行一系列回交，以恢復(fù)大部分其需要的性狀。因此，產(chǎn)生由幾乎類似于輪回親本的個體組成的群體，但每個個體攜帶不同量的或嵌合的來自供體親本的基因組區(qū)域。如果輪回親本中的所有基因座都是純合的，且供體親本和輪回親本具有截然不同的多態(tài)性標(biāo)記等位基因，回交群體可以用于對顯性標(biāo)記作圖(reiter等人1992)。使用共顯性或顯性標(biāo)記從回交群體獲得的信息少于從f2群體獲得的信息，因為從每株植物采集一個而不是兩個重組配子。然而，與ril相比，回交群體提供更多的信息(在低標(biāo)記飽和度時)，因為ril群體中的連鎖的基因座之間的距離增加(即，大約0.15％的重組)。增加的重組對于緊密連鎖的分析是有益的，但在構(gòu)建具有低標(biāo)記飽和度的圖譜時可能是不需要的。為了產(chǎn)生除了接受探詢的性狀或基因組區(qū)域之外在遺傳組成上幾乎相同的個體的陣列，通過多次回交產(chǎn)生的接近等基因的品系(nil)可用作作圖群體。在用nil作圖時，預(yù)計僅有一部分多態(tài)性基因座將定位于選定的區(qū)域。集群分離分析法(bsa)是為快速鑒定標(biāo)記和感興趣的性狀之間的連鎖而開發(fā)的方法(michelmore等人1991proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:9828-9832)。在bsa中，從一次雜交產(chǎn)生的分離群體中抽取兩個集群dna樣品。這些集群包含特定性狀(對特定病害具有抗性或敏感性)或基因組區(qū)域相同但在非連鎖的區(qū)域是任意的(即，雜合的)個體。與靶區(qū)域不連鎖的區(qū)域在bsa中的許多個體的集群樣品之間沒有差異。本發(fā)明的植物可以是育種計劃的一部分或由育種計劃產(chǎn)生。育種方法的選擇取決于植物繁殖方式、待改善的性狀的遺傳性以及商業(yè)使用的栽培種的類型(例如，f1雜種栽培種、純系栽培種等)。栽培種是已經(jīng)產(chǎn)生或有意挑選并通過栽培維持的植物種的生理小種或品種。下文說明了用于培育本發(fā)明的植物的選擇的、非限制性的方法。對任何雜交的后代使用標(biāo)記輔助的選擇(mas)可以提高育種計劃?？梢岳斫猓罕景l(fā)明核酸標(biāo)記可以在mas(育種)計劃中使用。進一步可以理解：可以在育種計劃中使用任何商業(yè)和非商業(yè)的栽培種。例如，如發(fā)芽活力、植物生長活力、應(yīng)激抗性、抗病性、分枝、開花、結(jié)實、種子的大小、種子密度、直立性(standability)和脫粒性(threshability)等各種因素通常指導(dǎo)選擇。對于高度遺傳的性狀，在單一位置評估優(yōu)良的單株植物的選擇是有效的，然而，對于具有低遺傳性的性狀，選擇應(yīng)該基于通過相關(guān)植物的科的反復(fù)評估獲得的平均值。流行的選擇方法通常包括系譜選擇、修改的系譜選擇、混合選擇(massselection)和輪回選擇。在優(yōu)選的一方面，采取回交或輪回育種計劃。育種系可以進行測試，且可以與代表商業(yè)靶區(qū)域的環(huán)境中合適的標(biāo)準(zhǔn)比較兩代或更多代。最好的品系是新的商業(yè)栽培種的候選品系；那些仍然為性狀缺陷的品系可用作親本，以產(chǎn)生新的群體用于進一步選擇。系譜育種和輪回選擇育種方法可用于從育種群體中開發(fā)栽培種。育種計劃將來自兩個或多個栽培種或各種廣泛的來源的理想性狀組合為育種池，從育種池中通過自交和所需的表型的選擇開發(fā)栽培種?？梢栽u估新栽培種以確定哪些具有商業(yè)潛力?；亟挥N已被用來將簡單遺傳的、高度遺傳的性狀的基因轉(zhuǎn)移到作為輪回親本的需要的純合栽培種或自交系中。待轉(zhuǎn)移的性狀的來源稱為供體親本。在初始雜交后，選擇具有供體親本的表型的個體，并與輪回親本反復(fù)雜交(回交)。產(chǎn)生的植物預(yù)計具有輪回親本(例如，栽培種)的大部分屬性，此外，還有從供體親本轉(zhuǎn)移來的理想的性狀。嚴格意義上說，單種子遺傳程序是指種植分離群體，每株植物收獲一個種子的樣品，并使用這一個種子樣品種植下一代。當(dāng)群體已從f2提高到理想的近交水平時，作為該品系的來源的植物均回溯到不同的f2個體。由于一些種子不能發(fā)芽或一些植物不能產(chǎn)生至少一個種子，種群中的植物數(shù)量每一代都在下降。結(jié)果，當(dāng)完成了世代進步時，并非全部原先在群體中取樣的f2植物都有后代代表。對于通常用于不同性狀和農(nóng)作物的其它育種方法的描述可在以下幾種參考書中找到(allard,principlesofplantbreeding,johnwiley&sons,ny,u.ofca,davis,ca,50-981960；simmonds,principlesofcropimprovement,longman,inc.,ny,369-3991979；sneep和hendriksen,plantbreedingperspectives,wageningen(編),centerforagriculturalpublishinganddocumentation1979；fehr,in:soybeans:improvement,productionanduses,2ndedition,manograph.,16:2491987；fehr,“principlesofvarietydevelopment,”theoryandtechnique,(vol.1)和cropspeciessoybean(vol.2),iowastateuniv.,macmillanpub.co.,ny,360-3761987)。如本文所用，“核酸分子”，無論是自然產(chǎn)生的分子還是在需要時以其它方式“基本上純化的”分子，指的是從基本上全部其它通常與其天然狀態(tài)相關(guān)的分子中分離的分子。更優(yōu)選地，基本上純化的分子是制劑中存在的主要的種類?；旧霞兓姆肿涌梢源笥?0％、優(yōu)選75％、更優(yōu)選90％且最優(yōu)選95％地不含天然混合物中存在的其它分子(不包括溶劑)的分子。術(shù)語“基本上純化的”并非意在包括其天然狀態(tài)存在的分子。本發(fā)明的材料優(yōu)選是“生物活性的”，無論是在結(jié)構(gòu)屬性方面，如核酸與另一種核酸分子雜交的能力，還是在蛋白質(zhì)被抗體結(jié)合(或與另一種分子競爭這種結(jié)合)的能力方面。或者，這種屬性可以是催化性的，因此涉及該材料介導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)或應(yīng)答的能力。本發(fā)明的材料也可以是重組的。如本文所用，術(shù)語重組是指通過核酸分子的人工操作間接產(chǎn)生的任何材料(例如，dna、肽等)。本發(fā)明的材料可以用便于檢測該材料的試劑標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記(prober等人,science238:336-340(1987)；albarella等人,歐洲專利144914)、化學(xué)標(biāo)記(sheldon等人,美國專利4,582,789；albarella等人,美國專利4,563,417)、修飾的堿基(miyoshi等人,歐洲專利119448)?，F(xiàn)已一般性地描述了本發(fā)明，通過參考以下的由舉例的方式提供的，并且除非另外指定，不限制本發(fā)明的實施例，會更容易理解本發(fā)明。實施例實施例1：srkn抗性標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)通過篩查srkn抗性和敏感性大豆品系中的連鎖群(lg)o中位于rmi基因座側(cè)翼的核酸序列，確定了srkn抗性qtlrmi的snp標(biāo)記。圖1總結(jié)了標(biāo)記、它們的染色體位置、抗性和敏感性等位基因和每個標(biāo)記的snp的位置。圖1也提供了用于檢測snp的引物和探針。實施例2:srkn抗性snp標(biāo)記在可公開獲得的種質(zhì)中的驗證根據(jù)植物根上存在的蟲癭或卵群的數(shù)目對大豆植物進行基因型分型和打分(表1)。蟲癭或卵群的數(shù)目越大，植物越敏感。然后計算平均蟲癭指數(shù)，并給予植物抗性、中度抗性、中度敏感或敏感的srkn等級(表2)。為了檢測本發(fā)明的srkn抗性標(biāo)記的應(yīng)用和可預(yù)測性，對16個可公開獲得的具有報道的srkn抗性和敏感性反應(yīng)的大豆品系進行基因型分型(表3)。使用snp標(biāo)記ns0094902、ns0097935、ns0135583和ns0102683發(fā)現(xiàn)已知抗性和敏感性品種的單元型是一致的。發(fā)現(xiàn)這4種snp標(biāo)記可以預(yù)測可公開獲得的大豆種質(zhì)中的srkn抗性。表4提供了這4種snp標(biāo)記的進一步的驗證。對14個具有報道的srkn抗性反應(yīng)的公開項進行基因型分型。另外，使用palmetto作為srkn抗性對照，并且使用srkn敏感的品系作為陰性對照。通過使用這4種snp標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)12個品種的單元型與抗性對照一致。一個品種，即g93-9223，只在一個標(biāo)記ns0102683處具有不同的等位基因狀態(tài)。兩個品種，即musen和ls97-1610，具有對應(yīng)于敏感類型的基因型。srkn反應(yīng)是基于報道的反應(yīng)而不是該實施例中的基因型分型。但是，snp標(biāo)記可預(yù)測大多數(shù)品系的srkn反應(yīng)，并且可用于預(yù)測大豆srkn反應(yīng)。以palmetto作為srkn抗性對照，以敏感的品系作為陰性對照，對5個具有報道的srkn敏感性的公開項進行基因型分型(表5)。發(fā)現(xiàn)這5個公開項的單元型與敏感性對照一致。發(fā)現(xiàn)4種snp標(biāo)記，即ns0094902、ns0097935、ns0135583和ns0102683，可預(yù)測公開大豆品種中的srknqtl(rmi)。表1.在srkn表型分析中使用的蟲癭指數(shù)(taylor和sasser,1978).表2.srkn病等級量表。等級是抗性(r)、中度抗性(mr)、中度敏感(ms)和敏感(s)。srkn等級蟲癭指數(shù)r平均蟲癭指數(shù)<3.2mr平均蟲癭指數(shù)3.2至<3.5ms平均蟲癭指數(shù)3.5至<4.0s平均蟲癭指數(shù)4.0+表3.用于檢測lg-o上rmiqtl的存在或不存在和相應(yīng)的srkn病表型應(yīng)答的srkn抗性snp標(biāo)記的驗證。品種cns、s-100、palmetto和bragg用作抗性(r)和敏感(s)組，用來評價snp標(biāo)記在區(qū)別歷史r和s大豆品系中的抗性與敏感性中的效用。項srknns0094902ns0097935ns0135583ns0102683cnssttatcaattatccttaas-100sttatcaattatccttaapalmettor***********ggccaabraggr***********ggccaaleesttatcaattatccttaadyersttatcaattatccttaapickett71sttatcaattatccttaahutchesonsttatcaattatccttaaforrestr***********ggccaabraxtonr***********ggccaahartwigr***********ggccaamanokinr***********ggccaadillonr***********ggccaac6738r***********ggccaacookr***********ggccaabenningr***********ggccaa表4.用于檢測lg-o上rmiqtl的存在或不存在和相應(yīng)的srkn病表型應(yīng)答的srkn抗性snp標(biāo)記的驗證，palmetto作為srkn抗性的對照，srkn敏感的品系作為陰性對照。項srknns0094902ns0097935ns0135583ns0102683palmettor***********ggccaa敏感型sttatcaattatccttaaaccomacr***********ggccaaboggsr***********ggccaabryanr***********ggccaadelsoy5710r***********ggccaag93-9106r***********ggccaag93-9223r***********ggccagls94-3207r***********ggccaals97-1610rttatcaattatccttaals97-3004r***********ggccaamusenrttatcaattatccttaas96-2692r***********ggccaasanteer***********ggccaastonewallr***********ggccaanks75-55r***********ggccaa表5.用于檢測lg-o上rmiqtl的存在或不存在和相應(yīng)的srkn病表型應(yīng)答的srkn抗性snp標(biāo)記的驗證，palmetto作為srkn抗性的對照，srkn敏感的品系作為陰性對照。實施例3:srkn抗性snp標(biāo)記在monsanto專利品系中的驗證使用對srkn病具有已知的抗性和敏感性反應(yīng)的monsanto專利品系驗證了srkn抗性snp標(biāo)記。使用了8個mr/r品種(表6)和17個敏感品種(表7)。病害等級基于如前面表2所述的平均蟲癭指數(shù)得分。在該實施例中，進行表型分型，并且srkn分類基于溫室測試或溫室測試與田間測試的結(jié)合。對8個monsanto專利品種進行了表型分型。基于蟲癭指數(shù)等級，將這些品系分類為抗性/中度抗性。對葉組織進行基因型分型。發(fā)現(xiàn)這8個品種的單元型與抗性對照palmetto一致(表6)。對17個monsanto專利品種進行了表型分型，并且基于蟲癭指數(shù)等級將其評定為敏感的。對葉組織進行基因型分型。發(fā)現(xiàn)這17個品種的單元型與敏感型對照一致(表7)。發(fā)現(xiàn)4種snp標(biāo)記可用于檢測monsanto專利品系中的srkn抗性qtl(rmi)。表6.用于檢測lg-o上rmiqtl的存在或不存在和相應(yīng)的srkn病表型應(yīng)答的srkn抗性snp標(biāo)記的驗證，palmetto作為srkn抗性對照，srkn敏感品系作為陰性對照。項srknns0094902ns0097935ns0135583ns0102683palmettor***********ggccaa敏感型sttatcaattatccttaaag5402r/mr***********ggccaadkb64-51r/mr***********ggccaah5218r/mr***********ggccaah6372r/mr***********ggccagh7440r/mr***********ggccaah5050rrr/mr***********ggccaah6104rrr/mr***********ggccaah7242rrr/mr***********ggccaa表7.用于檢測monsanto項的lg-o上rmiqtl的存在或不存在和相應(yīng)的srkn表型應(yīng)答的srkn抗性snp標(biāo)記的驗證，palmetto作為srkn抗性對照，srkn敏感的品系作為陰性對照。項srknns0094902ns0097935ns0135583ns0102683palmettor***********ggccaa敏感型sttatcaattatccttaamv0009sttatcaattatccttaamv0010sttatcaattatccttaamv0011sttatcaattatccttaamv0012sttatcaattatccttaamv0013sttatcaattatccttaamv0014sttatcaattatccttaamv0015sttatcaattatccttaamv0016sttatcaattatccttaamv0017sttatcaattatccttaamv0018sttatcaattatccttaamv0019sttatcaattatccttaamv0020sttatcaattatccttaamv0021sttatcaattatccttaamv0022sttatcaattatccttaamv0023sttatcaattatccttaamv0024sttatcaattatccttaamv0025sttatcaattatccttaa實施例4:區(qū)別srkn抗性單元型與不同抗性來源的能力srkn抗性的兩個來源是palmetto和pi96354。本發(fā)明的snp標(biāo)記可以用來區(qū)別作為srkn抗性qtl(rmi)的來源的palmetto和pi96354(表8)。該標(biāo)記提供的信息可用于譜系分析。表8.用于區(qū)別srkn抗性的兩個來源——palmetto和pi96354的srkn抗性snp標(biāo)記的驗證。項srknns0094902ns0097935ns0135583ns0102683敏感型sttatcaattatccttaapalmettor***********ggccaapi96354vrttatcaattatccttgg實施例5:用于srkn抗性的另外的snp標(biāo)記通過使用細菌人工染色體(bac)末端和含ssr的基因組dna克隆開發(fā)了與lg-o和lg-g上的srkn抗性qtl連鎖的snp標(biāo)記。在位于lg-o上的主要srkn抗性qtl附近的satt358來源-序列中確定了三種snp。在位于lg-g上的次要srkn抗性qtl附近的satt199來源-序列中確定了三種snp。使用pi96354xbossier雜交產(chǎn)生的94株f2植物進行snp基因型分析。從各個親代基因型和各個在田間生長的f2植物中提取dna。在溫室中評價f2:3系的srkn蟲癭形成(galling)。使用來自lg-o上的satt358來源序列的snp358開發(fā)和優(yōu)化了直接雜交(dh)試驗。設(shè)計了對應(yīng)于pi96354和bossier序列變體中每一個的等位基因特異性寡核苷酸探針，使得該探針在83和91堿基位點處包含兩個多態(tài)性堿基。aso358-ta探針是對pi96354單元型特異性的，aso358-ag探針是對bossier單元型特異性的。對于lg-g上的次要srkn抗性qtl，使用來自lg-g的satt199來源序列的snp199開發(fā)了dh試驗。aso199-aa探針是pi96354單元型特異性的，aso199-tg探針是對bossier單元型特異性的。通過測定12個srkn抗性和12個srkn敏感性大豆品系，將snp358和snp199的效果與各自的ssr標(biāo)記satt358和satt199進行比較。通過多路測定進行基因型分型，其中反應(yīng)特異性微球體以不同頻率發(fā)熒光。表9提供了該試驗的結(jié)果。對于pi96354等位基因(抗性)特異性aso358-ta探針，與bossier等位基因(敏感的)特異性aso358-ag探針相比，12個在satt358處攜帶200-bp等位基因的srkn抗性品系中的11個具有大約高10x的陽性信號。對于bossier-特異性aso358-ag探針，所有在satt358處攜帶192-bp等位基因的srkn敏感品系都具有陽性信號。敏感的大豆品系fc33243在snp358處具有獨特的單元型(aa)。因此，snp358在24個大豆品系中具有三種snp單元型，即ta、ag和aa。圖2提供了snp標(biāo)記和抗性單元型。表9.在srkn抗性和敏感性大豆品系中連鎖群-o(lg-o)和lg-g上的簡單序列重復(fù)(ssr)標(biāo)記與單核苷酸多態(tài)性(snp)標(biāo)記之間的比較1mfi＝平均熒光強度實施例6.用于檢測具有srkn抗性基因座的大豆植物的寡核苷酸雜交探針通過基于雜交的snp檢測方法，寡核苷酸也可用于檢測與本文所公開的srkn抗性相關(guān)的多態(tài)性或?qū)ζ溥M行分型。本發(fā)明提供了能夠與包含多態(tài)性的分離的核酸序列雜交的寡核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠設(shè)計具有經(jīng)實驗確定的嚴格性的試驗，以區(qū)別本文提出的多態(tài)性的等位基因狀態(tài)。示例性的試驗包括southern印跡法、northern印跡法、微陣列、原位雜交和其它基于雜交的多態(tài)性檢測方法。表10提供了示例性的用于基于雜交的snp檢測的寡核苷酸?？梢杂梅派湫詷?biāo)記、熒光團或其它化學(xué)發(fā)光手段可檢測地標(biāo)記這些寡核苷酸，以有助于使用本領(lǐng)域已知的方法檢測與源自一種或多種大豆植物的基因組或擴增核酸的樣品的雜交。表10.寡核苷酸雜交探針實施例7.用于通過單堿基延伸方法檢測具有srkn抗性基因座的大豆植物的寡核苷酸探針通過基于單堿基延伸(sbe)的snp檢測方法，寡核苷酸也可用于檢測與本文所公開的srkn抗性相關(guān)的多態(tài)性或?qū)ζ溥M行分型。表11提供了示例性的用于基于sbe的snp檢測的寡核苷酸。sbe方法基于與鄰近多態(tài)性的序列雜交的核苷酸引物的延伸，以在引物延伸時摻入可檢測的核苷酸殘基。也預(yù)期sbe方法可以使用3種合成的寡核苷酸。其中兩種寡核苷酸作為pcr引物發(fā)揮作用，并與位于包含待測多態(tài)性的區(qū)域兩翼的基因座的序列互補。在圖1的標(biāo)注為“正向引物seqid”和“反向引物seqid”的欄中提供了可用于對本發(fā)明公開的多態(tài)性進行分型的示例性的pcr引物。在包含多態(tài)性的區(qū)域擴增之后，將pcr產(chǎn)物與延伸引物雜交，該延伸引物與鄰近該多態(tài)性的擴增的dna退火。然后提供dna聚合酶和兩種差別標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸。如果模板上存在該多態(tài)性，可以在單堿基鏈延伸中將一個標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸添加到引物中。然后通過確定兩種差別標(biāo)記中的哪一個添加到延伸引物中推斷存在的等位基因。純合的樣品將導(dǎo)致兩種標(biāo)記的堿基中只有一種被摻入，因此兩種標(biāo)記中只有一種被檢測到。雜合的樣品存在兩個等位基因，因此將直接摻入兩種標(biāo)記(進入延伸引物的不同的分子)，因此這兩種標(biāo)記都被檢測到。表11.用于單堿基延伸(sbe)分析的探針(延伸引物)標(biāo)記標(biāo)記seqidsnp位置探針(sbe)探針seqidns00979352346tgtcacaagagaaaagt42ns00979352346attacatacattaagat43ns01355833730cacattattagatgaac44ns01355833730gaatgtatgtacataca45已經(jīng)說明和描述了本發(fā)明的原理，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白，在不背離這些原理的情況下，可以在排列和細節(jié)上修改本發(fā)明。我們要求保護在所附的權(quán)利要求書的精神和范圍之內(nèi)的所有修改。本說明書中提到的所有出版物和公布的專利文件都引入本文作為參考，如同每一單獨出版物或?qū)＠暾埦唧w且單獨地引入作為參考。序列表<110>narvel,jamesconcibido,vergelcerny,liesatamulonis,johnphancock,floyddougherty,richardboerma,henryrogerha,bo-keun<120>用于選擇南方根結(jié)線蟲抗性大豆植物的方法和組合物<130>46-21(53775)<140><141><150>us61/055519<151>2008-05-23<150>us60/9638736<151>2007-08-07<160>45<210>1<211>532<212>dna<213>大豆<400>1gctcaatcaagtacacccatcatccttcttctcttcacgcctagcactcaaatttgtagc60gcatgctataactattaactaaccctctgtcccttcttgcaacaattgcaacctccttcc120ttccactcttttcccatcatcattccacacctacctttctctctcccccatgttttaact180ttcttcaacactcactgacttttccactatctcttccttcttccattcacatcattttct240cttccttcttcctccccctttttgttgttgttgttgttgtttatttatcaattatcacca300tgcccctcaaacaattcaaccaaagcttgcaactttgacaaccctttggcctcttcttct360tgttccccttaatgggtctctctccaattcccctcacaaagcctatctattctgatgtct420gaatttcactttggttttcatatgttcccaaaggctacacctttgcgggtgtagaagtgg480ataatttcagagtttttgggacaccccattttgaagaaagtgtgtgtgtgtg532<210>2<211>703<212>dna<213>大豆<220><221>不確定<222>(693)..(693)<223>n=a,t,c或g<220><221>不確定<222>(1)..(703)<223>所有n位置不確定<400>2attagatggtagttgaagcaatctgcctttgaactcttcttctggctcagcatgcatgct60tgtgttcatactattactatatccacctctctttatgtctcattctatttcgtaagtatt120tgatattgaattttggataatgattatttgctgcaatagccactttgagcttagggagaa180cttttctattctttgatggctgcaataactgcatatggcattttaatatagtttgataat240aatgtaagagatgggggacctggacggctggacccggtaatggcaaagacaatttctttt300agaaaaaattaattaggacatttcgttttgtcacaagagaaaagtgaatcttaatgtatg360taatagataatgccacaagaaaaaattaaaaaactagaaaaactaaggccttctatcggt420cagttgacctcaaaatacgtactcgagtactgtacattcggatgttggaggtataaatta480aaagtcatttttaatttatatttatcattagtgttgagataaaattgaattattcaactt540gagaaaatgattgataattcagttggattgcccctttgacttgtatgcttgcgtatattg600gtatgaaatcaaatatgccaaatattatcatcattgaaataaccttttgatattgatagg660gtacttaattatttcaagaattgttgtgtgctngttaatcctt703<210>3<211>792<212>dna<213>大豆<400>3tttccttgaaggtttacttcaacgtggtttggaaagatttgctacattcgccaaaagcta60cacctaaatttttattatgattgtcctgatttttatagcagggctacatttctaaaagtg120aacatacctgattattttcatggcgatctcattctgtctgaacattgattgaattactgt180tatcatgccaatttttggttgcatgaatggttatcccattttgaagtgttaattaattat240gtataactctgatagacggtcttaatgcaaaatgaacacatccgacataatgttaaaggt300ctgttcttaaatccgcaatcctaaatttgtaacgctgctttgagcacttcagaaatgatt360ggatttggatcctagcaagtaaaatttgccaaaccatctcgaaacttaagctccagagtc420ctatgcggagtatatagatacatgtcctaaaatgagtatatgtaattgctaacagataat480ggaatagaagctaagagattccatttattgacgcacaagaatctgacatgaatgtggcag540tcatagtaaaaattgactatagtacaaaataataatgtaacgacaacacatatttacacc600accatcctccaacccaggctacgtacatcaaccgaccacgtaaaaaaatgatggcagctt660tttccaatgtctaaactgaagcaaccgaaaacagtgtgtataatcccaacaacacattat720tagatgaaccgtgtatgtacatacattcagttgcttgcactgccttccaacaagctcctc780aagctacaaaga792<210>4<211>835<212>dna<213>大豆<220><221>不確定<222>(692)..(692)<223>n=a,t,c或g<220><221>不確定<222>(1)..(835)<223>所有n位置不確定<400>4gagaaactgccttagcaagaaatatggcacggagagcaaactgagctgtatgttgttggg60atggctccaattgccaatcatactctgtaactgaatatgtgaagagaacgaggttgaaaa120tatagaaaaccactttccacgtggcaaatgagcagaggtatagtattcgatcaagcacaa180tcaagaagaagatagcctgaacagaagaagtaactcttattaggagtgtatatgacatga240caactctagccacacttataaatgaaacatgcaataaatcattgcgtcactctaacatat300gtattcaacaaagaaacgtggataagaaatgtttcctaaacatgtcaatgatgaattaca360gtcattctctttcgaagtgctacaaattttaacctccaaattatgaaaaggaaaacaaaa420tcttaatgtttcattccatttggaaaacaaaatgtatcataaatgaaatcatttcaaagg480ttctggacaatttcttggcattataaacaacatgaattttatattagatctctaacatcc540cccctgtacaggccctttgggtttgaaaaagggaatatgctgacctaccatgtgctgaaa600ttcaacatttttttagaatgacagacaacaaggatcaaactctagactacatacttggtc660aaagaacctctaataccacatcaggaaccaancactccataagcttaagctgttagatga720agagatatgaatagttgtacactacgtctctaacaattggcacacttgacctgctttgtt780taccccataaaagtcaaatttgtctgaatgaattaaattctttttaagccctgtt835<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>5tcctccccctttttgttgttg21<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>6tgcaagctttggttgaattgtt22<210>7<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>7aaattaattaggacatttcgttttgtca28<210>8<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>8ctagttttttaattttttcttgtggcatt29<210>9<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>9aaaacagtgtgtataatcccaacaaca27<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>10ggaaggcagtgcaagcaact20<210>11<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>11cattgcgtcactctaacatatgtattca28<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成引物<400>12tgtaattcatcattgacatgtttaggaa28<210>13<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>13tttatcaccatgccc15<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>14ttgttgttgtttatttatc19<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>15caagagaaaagtcaatct18<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>16caagagaaaagtgaatct18<210>17<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>17tacacggttcatcta15<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>18tgtacatacacagttcatc19<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>19caaagaaacgtagataag18<210>20<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>20aaacgtggataagaaa16<210>21<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>21tgttgttgttgtttatcaccatgcccctcaaaca34<210>22<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>22gtcacaagagaaaagtgaatcttaatgtatgtaat35<210>23<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>23acattattagatgaaccgtgtatgtacatacattc35<210>24<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>24ttcaacaaagaaacgtggataagaaatgtttccta35<210>25<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>25ttcaacaaagaaacgtagataagaaatgtttccta35<210>26<211>439<212>dna<213>大豆<400>26gaattttattttgaacgcctttctgaagattcattaacttccattctggcaccagaaatc60attataaatgctatcctttaattcttagctatgcgctttatgtaacaatacgatttctat120tattattattattattattattattattattattattattattattattattattattat180tatattttttcctatttttggaaatatatttctattttcaaaataatatactttttattt240taattatatattttaagtttaattactccgcactctgcttttactaaaatttttaattag300ttctctaaatttttttaagtaagtttggattctagaactttacattaaattcatctaact360caattcacaagcatcctctgaatatatcattatttaaagtattcagtaaaaaaaacaagt420cttatttaaagtactgcca439<210>27<211>378<212>dna<213>大豆<400>27aaataggcaaaacaccgtatgaaaaataggttatcgttattcataatttacttcagacac60tttatatttctgttttctcttaagaaaaaaaaaactaaaacaaaatgtcgacagtagttg120tcaatacagtagcgtatgaataaaggttttctgttgaatataacattattattattatta180ttattattattattattattaatattagactgtaaacgttttaattactactactttttt240actttatgaattttgtgagtaagttgatgatggacccctacttcaatgagattttaacca300ttaagcccacgattgactaaaggaatttataggttcacacttgtgaatgatgtagtcctt360gcctgttaagttttgccc378<210>28<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>28gaattttattttgaacgcctttc23<210>29<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>29gcagagtgcggagtaattaaact23<210>30<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>30aaataggcaaaacaccgtatgaaa24<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>31gggcaaaacttaacaggcaag21<210>32<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>32agcgcatagctaagaattaaagg23<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>33agcgcacagctaagtattaaagg23<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>34taatattagactgtaaacgt20<210>35<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>35tattattaggctgtaaacg19<210>36<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>36gctatcctttaattcttagctatgcgctttatgta35<210>37<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列<400>37ttattattattaatattagactgtaaacgtttt33<210>38<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>38aaaagtgaatcttaat16<210>39<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>39aaaagtcaatcttaat16<210>40<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>40atgaaccgtgtatgta16<210>41<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>41atgaactgtgtatgta16<210>42<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>42tgtcacaagagaaaagt17<210>43<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>43attacatacattaagat17<210>44<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>44cacattattagatgaac17<210>45<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>其它信息：人工序列的說明：合成探針<400>45gaatgtatgtacataca17當(dāng)前第1頁12