本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種適合在作物中表達(dá)的中性植酸酶基因、表達(dá)盒及其在提高作物有機磷利用效率方面的用途。

背景技術(shù)：

磷是作物生長最重要的大量元素之一，為實現(xiàn)作物高產(chǎn)，通常要使用大量的磷肥，但磷肥施入土壤后，很快被土壤顆粒吸附并形成難溶的磷酸鹽，大大減低了磷肥的有效性。近些年，隨著秸稈還田措施的實施和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，大量的有機磷施用到土壤當(dāng)中，提高了土壤有機磷的含量。自然條件下，作物能分泌一些有機酸和少量磷酸酯酶（主要是植酸酶），降低根際ph，分解一些難溶的磷酸鹽和有機磷，但效率較低。

土壤中總有機磷含量的20-50%為植酸磷，為提高作物對植酸磷的利用能力，人們通過在作物中過量表達(dá)或組織特異性表達(dá)外源植酸酶基因，已取得了較好的進(jìn)展。比如，專利號為zl200510105543.0的中國專利報道，在玉米和油菜中過表達(dá)來自于黑曲霉的植酸酶基因提高了這兩種作物對培養(yǎng)基中有機磷的利用效果；hong等人在甘薯中過表達(dá)來自于大腸桿菌的appa基因，不但提高了對土壤有機磷的利用率，還提高了甘薯的產(chǎn)量；申請?zhí)枮?00910036465.1的中國發(fā)明專利報道說，在大豆中過表達(dá)來自擬南芥的紫色酸性磷酸酶基因提高了大豆獲取沙培中植酸磷的能力，進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)基因大豆的生物量和磷吸收量。目前在作物中表達(dá)的微生物來源的植酸酶基因，其最適ph幾乎都偏酸性，一般在2.5-6.0，植物來源的植酸酶最適ph范圍較窄，一般在4.8-6.0，兩種來源的植酸酶ph都偏酸性，因此，這些轉(zhuǎn)植酸酶基因的作物比較適合在偏酸性的土壤上種植。

我國的土壤類型眾多，總的趨勢是南方的土壤多偏酸性，中部的土壤偏中性，而北方的土壤多偏堿性，如何提高中堿性土壤上作物對植酸磷的利用效率還是一個值得研究的問題。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，申請?zhí)枮?01110171735.7的中國發(fā)明專利公開了一種來自芽孢桿菌的中性植酸酶phyh，其最適ph為7.0，在ph6.0-8.0范圍內(nèi)有80%以上相對酶活性，該基因比較適合在中性土壤上種植的作物應(yīng)用，只是直接在作物中表達(dá)來自芽孢桿菌的中性植酸酶基因，表達(dá)效率會比較差，由于原核生物和高等植物的密碼子使用效率有一些差別，會導(dǎo)致基因的表達(dá)水平比較低，進(jìn)而影響其作用效果，因此，如何提高上述中性植酸酶基因在作物中的表達(dá)效率是本發(fā)明所要解決的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種適合在作物中表達(dá)的中性植酸酶基因、表達(dá)盒及其在作物高效利用中性ph條件下植酸磷能力方面的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種適合在作物中表達(dá)的中性植酸酶基因，具有如seqidno.1所示的dna序列。

進(jìn)一步地，還可以將序列表中seqidno.1所示的dna序列經(jīng)過一個或幾個堿基的替換和/或缺失和/或添加但其作用效果并未明顯改變的dna序列。

進(jìn)一步地，所述中性植酸酶基因，是由芽孢桿菌的中性植酸酶基因phyh經(jīng)高等植物優(yōu)選密碼子優(yōu)化而來。

本發(fā)明還提供一種融合表達(dá)基因，在權(quán)利要求1所述的中性植酸酶基因的5′端連接一段用于胞外分泌的信號肽編碼序列和gcc三個堿基，gcc三個堿基連接在信號肽編碼序列的3′端。

進(jìn)一步地，所述的胞外分泌的信號肽編碼序列為胡蘿卜的胞外分泌信號肽編碼序列，具有如seqidno.2所示的序列。

一種中性植酸酶基因的表達(dá)盒，在上述的融合表達(dá)基因的5′端與一個基因啟動子連接，其3′端與一個轉(zhuǎn)錄終止子連接。

進(jìn)一步地，所用的基因啟動子可以是組成型啟動子也可以是根特異啟動子或根優(yōu)先表達(dá)啟動子，優(yōu)選的基因啟動子為根優(yōu)先表達(dá)啟動子，所述的基因啟動子為水稻的rcg2基因啟動子，具有如seqidno.4所示的序列；使用的轉(zhuǎn)錄終止子可來源于nos終止子、35s終止子等，優(yōu)選的為nos終止子，具有如seqidno.5所示的序列。

一種中性植酸酶基因的重組表達(dá)載體，其特征在于，該重組表達(dá)載體含有上述的表達(dá)盒，所述重組表達(dá)載體為puc57-優(yōu)化中性植酸酶基因。

本發(fā)明還提供了一種適合在作物中表達(dá)的中性植酸酶基因的用途，其特征在于利用所述中性植酸酶基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化作物能夠提高作物在中性ph條件下對植酸磷的利用效率。

進(jìn)一步地，用所述中性植酸酶基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化作物，并從中篩選出對植酸磷利用效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因作物。

進(jìn)一步地，所述作物包括雙子葉作物和單子葉作物，優(yōu)選的單子葉作物為小麥。

進(jìn)一步地，轉(zhuǎn)化小麥的方法是，用中性植酸酶基因的表達(dá)盒與含bar基因的質(zhì)粒混合對小麥幼胚或幼胚愈傷組織進(jìn)行基因槍共轉(zhuǎn)化，抗性再生植株經(jīng)pcr檢測和定量pcr檢測，從中篩選出中性植酸酶基因高表達(dá)且植酸磷利用效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因小麥。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

用本發(fā)明的中性植酸酶基因轉(zhuǎn)化小麥，在轉(zhuǎn)基因后代中選擇中性植酸酶基因高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因的受體對照一起發(fā)芽，然后選擇大小一致的幼苗分別移栽到植酸磷為唯一磷源的ph為7.0的ms培養(yǎng)基上，經(jīng)過1周的生長，轉(zhuǎn)基因幼苗比非轉(zhuǎn)基因幼苗鮮重提高了89%，說明本發(fā)明的中性植酸酶基因能夠提高小麥的植酸磷利用效率。

附圖說明

圖1是轉(zhuǎn)t0代轉(zhuǎn)中性植酸酶小麥的pcr檢測圖譜；

圖中m為分子量標(biāo)準(zhǔn)；-ck為未作轉(zhuǎn)化的小麥；1-8為部分t0代轉(zhuǎn)基因植株。分子量較大的擴增片段為bar基因的擴增片段，分子量較小的擴增片段為中性植酸酶基因的擴增片段。

圖2是高表達(dá)中性植酸酶基因的轉(zhuǎn)基因小麥與未轉(zhuǎn)化的對照小麥在植酸磷為唯一磷源的ms培養(yǎng)基上生長情況對比；

圖中a為轉(zhuǎn)中性植酸酶基因小麥；b為未轉(zhuǎn)化的受體小麥；

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

具體實施方式

實施例中所用試劑如無特別說明均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，所用引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

實施例1：適合在作物中表達(dá)的中性植酸酶基因的優(yōu)化

中國發(fā)明專利“一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶phyh及其基因和應(yīng)用”（專利授權(quán)公告號cn102250853b）公開了一種來自芽孢桿菌（bacillussp.hjb17）的中性植酸酶及其基因，該中性植酸酶的最適ph為7.0，在ph6.0-8.0范圍內(nèi)有80%以上相對酶活性，其最適反應(yīng)溫度為35℃，在20-35℃范圍內(nèi)有60%左右的酶活性，并且在0℃還有20%的酶活性，該中性植酸酶由40個氨基酸的信號肽和644個氨基酸的成熟蛋白2部分組成。為在作物中高效表達(dá)該中性植酸酶基因，對該基因的成熟蛋白編碼基因按高等植物偏愛的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的成熟蛋白編碼序列命名為序列表中的seqidno.1，其長度為1815bp,與原序列的相似性僅為72%，gc含量也由原來的55.65%提高到了60.17%。

實施例2：中性植酸酶基因克隆載體的構(gòu)建

為使表達(dá)的成熟中性植酸酶能分泌到胞外，需要在成熟中性植酸酶基因的5′端加一段信號肽編碼序列，選用的信號肽編碼序列為來自于胡蘿卜的分泌信號肽編碼序列，長度96bp,其序列為如seqidno.2，為使信號肽能順利切除，在信號肽編碼序列的3′添加了gcc（seqidno.3）3個堿基。用于驅(qū)動中性植酸酶基因表達(dá)的啟動子選用在根中優(yōu)先表達(dá)的水稻rcg2基因(plantmolecularbiology27:237-248,1995)的啟動子，長度1118bp，其序列如seqidno.4所示，用于目的基因轉(zhuǎn)錄終止的終止子選用nos終止子，長度265bp，其序列如seqidno.5所示，為便于用pcr擴增該中性植酸酶基因的整個表達(dá)框以及用內(nèi)切酶從表達(dá)載體上切下整個表達(dá)框，分別在表達(dá)框的兩端各加上一段人工序列，加在啟動子前端的人工序列如seqidno.6所示，加在終止子之后的人工序列如seqidno.7，包括上述各段序列的完整序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司化學(xué)合成，并把整個合成序列連接到克隆載體puc57的ecorv位點得到優(yōu)化中性植酸酶基因的重組表達(dá)載體puc57-優(yōu)化中性植酸酶基因。

實施例3：中性植酸酶基因?qū)π←湹倪z傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)上述優(yōu)化中性植酸酶基因表達(dá)框兩端的人工dna序列合成一對引物，上游引物如seqidno.8所示，下游引物如seqidno.9所示，以重組表達(dá)載體puc57-優(yōu)化中性植酸酶基因為模板進(jìn)行pcr擴增，擴增條件為94℃,3min;94℃,30s;60℃,30s;72℃,4min;30個循環(huán)；72℃，10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，片段大小無誤后再用試劑盒純化。純化后的中性植酸酶基因線性表達(dá)盒送到中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所進(jìn)行基因槍共轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化用的植物篩選標(biāo)記基因為bar基因（含bar基因的質(zhì)粒由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供），中性植酸酶基因的線性表達(dá)盒與含bar質(zhì)粒的用量比為1:1，轉(zhuǎn)化的受體材料為科農(nóng)199的幼胚愈傷（科農(nóng)199由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心培育），轉(zhuǎn)化得到的t0代抗性再生植株用bar基因和優(yōu)化中性植酸酶基因的混合檢測引物進(jìn)行pcr檢測。bar基因的pcr檢測引物為，bar-f：gtctgcaccatcgtcaacc（seqidno.10）和bar-r：gaagtccagctgccagaaac（seqidno.11），擴增片段長度為445bp；優(yōu)化中性植酸酶基因的pcr檢測引物為phy-p3：cgctacggcctgaactgg（seqidno.12）和phy-p4:gcctcgccggtcgtggtagc（seqidno.13），擴增片段長度為404bp。bar基因和優(yōu)化中性植酸酶基因的pcr擴增參數(shù)均為94℃3分鐘，94℃45秒，60℃45秒，72℃1分鐘，33個循環(huán)，72℃7分鐘，圖1給出了部分抗性再生植株的pcr檢測結(jié)果，擴增片段大小與預(yù)期大小相符，說明中性植酸酶基因已整合到小麥的基因組中。

實施例4：轉(zhuǎn)基因小麥對有機磷的利用效果

目的基因pcr檢測呈陽性的t0代植株進(jìn)行自交，t1代繼續(xù)進(jìn)行目的基因的pcr檢測，并對部分純合的t2代株系進(jìn)行目的基因的定量pcr檢測，方法是用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的er301試劑盒提取根和葉的總rna，然后用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的kr106試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cdna,最后用天根的fp205試劑盒進(jìn)行定量pcr檢測,從目的基因表達(dá)量高的株系中收獲種子。為檢測轉(zhuǎn)基因小麥對有機磷的利用效果，把從目的基因表達(dá)量高的株系中收獲的種子與沒有轉(zhuǎn)化的對照種子（科農(nóng)199）發(fā)芽后選生長一致的小苗放在植酸鈉（sigma公司生產(chǎn)）為唯一磷源的ms培養(yǎng)基（kh2po4替換為等摩爾的植酸鈉，ph值7.0）上23℃光下生長1周，然后調(diào)查幼苗的生長情況。試驗設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)10棵苗，調(diào)查時幼苗用自來水沖洗干凈并用吸水紙吸干后稱取每個重復(fù)的幼苗鮮重。圖2為部分轉(zhuǎn)基因幼苗與對照幼苗在植酸磷為唯一磷源的ms培養(yǎng)基上生長1周后的情況，表1為幼苗鮮重的調(diào)查結(jié)果，很明顯轉(zhuǎn)基因苗能更有效的利用培養(yǎng)基中的有機磷，這為轉(zhuǎn)該中性株酸酶基因的作物有效利用中性土壤中的植酸磷奠定了基礎(chǔ)。

表1轉(zhuǎn)基因與對照幼苗在有機磷為唯一磷源的ms培養(yǎng)基上生長7天后的鮮重(g)

。

sequencelisting

<110>河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所

<120>一種適合在作物中表達(dá)的中性植酸酶基因、表達(dá)盒及其用途

<130>2017

<160>13

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1815

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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gctcaacaggctgggcaattctcgagactcgtcctgcagccactcgacacggatgctctc180

ctgctcgctgcgatggacatcaacagcaacaccctcttcctgtggagattcagcacgaag240

caaaccccttcgctgcagctgctccaaaggagactcatctccagcagggtggtcgacgat300

ctctgcttctaccactcgaccgagaaccaacagctctcactgttcctgctcggcgggagg360

ggcggggctgaccaactgctcctgcaacagcaacagcaatggctggctcagcctgttgtg420

atcagagagctcaacatcccttacgatagcacggcgtgcgtcgttgaccaaaccgctggc480

gctctctacatcgctgaggctgatcgggccatctggagataccaagctgagccagaggct540

gacgagggcaggtccctggtccaggttaacaagccgttcggccagctccaaggggaggtg600

aaggcgctgcagaccctctccgatggcagcctcctggctctggaggaggctcctgctcgg660

ctcctgcatatcaactcagacggccaactcagatctgctatcgctgtgcctgctctggct720

gaggcttctggcctcgccgtctccatgcaggggaacacggcgaccgcttacatctccacc780

gaggacgctggcgctgtccagcaactggctgtggtcccacaggctaagcctgagagacaa840

cctaaggctcctgttgtgcagctcctgcccacgctccaaaccgagcctgcttcccagaga900

ggcgacgtcatggacgatccagctgtttggcaccatccagctaggcctgagctctccctg960

atcctcggcacggataagagagctgggctcgacgtgtacaacatgcaaggcacccgggtg1020

cagcaactgtcagtcgggaggctcaacaacgtggatgtccgctacggcctgaactggcaa1080

gggtctgctcacgacatcgctgtggcttccctcagagacgataacagcctgcagctcttc1140

gccatcgactcgtcaggcacgctgcataacgcggggaaggtcgctacctcaatgtctgag1200

atctacggcctctgcatgtaccactcggcgcaatcaaacaagcattacgttttcgtgaac1260

gacaaggccggcctcatccagcaatacagaatcgacaccgatggcgaccactggcagggg1320

tctctggttagggctctccaggtgccttcccaacctgagggctgcgttgcggacgatatc1380

agaggcctcctgttcgtgggggaggaggatgctgctatctggagattcgctgctgaggct1440

gaggctaccacgaccggcgaggcgatcatcagagtggacggggagagactggtcgacgat1500

atcgagggcatcaccctcgccgagcacaacgggtcttcctacctcctggtcagctcgcag1560

ggcaacgatagctacctggttttcgacgctgctccaccttacacggagaggccacatttc1620

cgcatcggcaccaaccctctcctgggcatcgacggggctagcgagaccgatggggtcgac1680

gttacgaccaggtcgctcggccctgggttcgagcaaggcgccttcatcgtgcaggacggg1740

cggaacagaatgcctgagcaggggcagaacctcaagctggtcccgtgggccgacatcctc1800

caacaactcaactga1815

<210>2

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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ttggtgtcactcaatttggcttccgaaaccacagct96

<210>3

<211>3

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gcc3

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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gagctgtgatcacactgatgagtcacccgtcgttttcgaacttgcctagtactactccta180

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ctgctttttcacacacgtggatggttccctcgagaaatcttgggcaaatcactttccgaa300

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agagccagagcccgccttccagaaccaacccgcccacc1118

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<212>dna

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