本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻wrky類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼蛋白的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

wrky家族轉(zhuǎn)錄因子首次發(fā)現(xiàn)于1994年，經(jīng)過(guò)逾二十年的研究，其已被證明參與到植物抵御生物及非生物脅迫、發(fā)育、種子休眠與萌發(fā)、衰老等眾多過(guò)程中。絕大多數(shù)wrky家族轉(zhuǎn)錄因子含有wrky和鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。wrky轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其含有的wrky結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)以及鋅指結(jié)構(gòu)域的類(lèi)型和有無(wú)可分為四個(gè)亞家族，其中含有兩個(gè)wrky和兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的為第一亞家族(groupi)，其中鋅指結(jié)構(gòu)特征序列為c2h2的屬于groupia型，鋅指結(jié)構(gòu)特征序列為c2hc的屬于groupib型；含有一個(gè)wrky結(jié)構(gòu)和一個(gè)c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)的屬于groupii亞家族；含有一個(gè)wrky結(jié)構(gòu)和一個(gè)c2hc型鋅指結(jié)構(gòu)的屬于groupiii亞家族；含有一個(gè)wrky結(jié)構(gòu)且鋅指結(jié)構(gòu)特征序列為c2xx的為groupiva型，而僅含有一個(gè)wrky機(jī)構(gòu)且不含鋅指結(jié)構(gòu)的則屬于groupivb型(rossetal.,2007)。wrky轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的w-box順式調(diào)控元件(特征序列ttgacc/t；核心序列tgac)結(jié)合以調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。此外，一個(gè)wrky轉(zhuǎn)錄因子可同時(shí)參與到兩個(gè)甚至更多看似完全獨(dú)立的生理過(guò)程(rushtonetal.,2010)，這更突顯出其重要的生物學(xué)功能。

控制人口過(guò)快增長(zhǎng)與糧食增產(chǎn)是全球亟待解決的重大問(wèn)題。水稻是重要的糧食作物以及單子葉植物的模式植物，以作物矮稈基因的發(fā)現(xiàn)和雜交育種利用為代表的第一次農(nóng)業(yè)綠色革命中，矮桿水稻的應(yīng)用提高了水稻的抗倒伏能力，是保證其高產(chǎn)的重要基礎(chǔ)(jiaoetal.,2010；miuraetal.,2010)。另一方面，植物根系是其水分、養(yǎng)分吸收及支持其定植生長(zhǎng)的重要器官，根系的構(gòu)型在很大程度上決定著植物對(duì)土壤中水分和養(yǎng)分的吸收能力。例如，深扎型(deep)的根系有利于植物對(duì)較深土層中水分的吸收從而提高其抗旱性(ugaetal.,2013)；而淺表分布型(shallow)的根系則較易吸收一些土壤表層富集的養(yǎng)分(如磷等)(migueletal.,2015)。本發(fā)明從水稻中鑒定了一個(gè)wrky轉(zhuǎn)錄因子oswrky72，提出了利用oswrky72進(jìn)行水稻株型和根系構(gòu)型改良的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供水稻wrky轉(zhuǎn)錄因子基因oswrky72及其編碼蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

水稻wrky類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因oswrky72在降低植物株高、增加植物根長(zhǎng)和葉片夾角方面的應(yīng)用，該基因的序列號(hào)為loc_os11g29870(os11g0490900)。

其中，所述的植物優(yōu)選單子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選水稻、玉米或小麥，特別優(yōu)選水稻。

水稻wrky類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因oswrky72的編碼產(chǎn)物，水稻wrky轉(zhuǎn)錄因子蛋白o(hù)swrky72在降低植物株高、增加植物根長(zhǎng)和葉片夾角方面的應(yīng)用。

其中，所述的植物優(yōu)選單子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選水稻、玉米或小麥，特別優(yōu)選水稻。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明利用特異引物研究了oswrky72在水稻中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)oswrky72在地上、地下部均有表達(dá)(圖1)。

2、本發(fā)明構(gòu)建的oswrky72過(guò)量表達(dá)植株的株高顯著降低(圖2)，有利于改善水稻株型，提高其抗倒伏性繼而增產(chǎn)。

3、oswrky72過(guò)量表達(dá)植株的根系長(zhǎng)度顯著增加(圖3)，有利于改善水稻根系構(gòu)型，提高其對(duì)水分、養(yǎng)分的吸收能力。

4、oswrky72過(guò)量表達(dá)植株的葉片夾角增大(圖4)，可應(yīng)用于改變地上部株型，有利于改善植株光合作用能力。

附圖說(shuō)明

圖1rt-qpcr分析oswrky72在抽穗期苗的葉片、葉鞘、莖、根和花序，以及三葉期苗的根部和地上部中的表達(dá)

圖2生育后期oswrky72過(guò)量表達(dá)植株的表型，其株高與野生型植株相比顯著降低

圖3三葉苗期oswrky72過(guò)量表達(dá)植株的初生根(primaryroot)長(zhǎng)度

圖4抽穗期oswrky72過(guò)量表達(dá)植株旗葉與莖稈夾角大小與野生型植株相比顯著增加

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1水稻wrky轉(zhuǎn)錄因子基因oswrky72的分子克隆

1)總rna提取和cdna的合成

選用的水稻為粳稻，品種為日本晴(nipponbare，水稻基因組測(cè)序品種)。將水稻籽粒去除穎殼后于10％h2o2中進(jìn)行表面消毒30min，再用去離子水洗三次后置于底部有孔洞的塑料筐中，并將塑料筐架于桶沿上，加水至沒(méi)過(guò)種子一半后于37℃黑暗條件下浸種。待種子露白(1-2天)繼續(xù)用水培養(yǎng)，當(dāng)水稻幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)改用1/2國(guó)際水稻所營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。待水稻幼苗長(zhǎng)至四葉一心后，對(duì)水稻地上部和根部進(jìn)行混合采樣，加液氮后用研缽裂解組織和細(xì)胞，轉(zhuǎn)入2ml離心管中用trizolreagent(invitrogen,usa)抽提總rna。用瓊脂糖凝膠電泳和nanodrop儀器檢測(cè)所提取總rna的完整性和濃度，繼而用primescriptrtreagent試劑盒(takarabiotechnology,dalian,china)進(jìn)行cdna的合成。

2)oswrky72cdna的擴(kuò)增

以oswrky72的基因號(hào)os11g0490900在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其cdna序列，并根據(jù)該序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增oswrky72cdna的一對(duì)引物，w72-cdna-f:cttcgaattctcaatctctctc(seqidno.1)和w72-cdna-r:agaaccaaaatgtgcaagatc(seqidno.2)。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30s,55℃復(fù)性30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)后72℃7min。最終將pcr產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序獲得了水稻oswrky72的序列。測(cè)序結(jié)果與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列完全一致，表明oswrky72確為一個(gè)編碼wrky家族轉(zhuǎn)錄因子的基因。

實(shí)施例2oswrky72的序列信息與特性分析

本發(fā)明oswrky72的cdna全長(zhǎng)為1174bp，其開(kāi)放閱讀框位于87-815bp處，編碼242個(gè)氨基酸。oswrky72含有1個(gè)wrky結(jié)構(gòu)和1個(gè)c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)(cx4c-x23-hnh)，屬于典型的groupii型wrky轉(zhuǎn)錄因子。

實(shí)施例3oswrky72的表達(dá)研究

根據(jù)實(shí)例1中獲得的oswrky72cdna序列，在其3’非翻譯區(qū)(3’utr)設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行定量rt-pcr(rt-qpcr)分析，引物序列如下：w72-q-f:agatgaggtgcagtgtaagagaaaac(seqidno.3)和w72-q-r:tgaatctcgatcgatcatgcat(seqidno.4)。所使用的內(nèi)參基因?yàn)樗綼ctin基因osactin1(mcelroyetal.,1990)，其擴(kuò)增引物為：act-q-f:caacacccctgctatgtacg(seqidno.5)和act-q-r:catcaccagagtccaacacaa(seqidno.6)。結(jié)果表明，oswrky72的表達(dá)豐度在抽穗期水稻植株的葉片、葉鞘和莖中較高，在根部和穗中則相對(duì)較低；在三葉期幼苗中，oswrky72根部的表達(dá)量與抽穗期水稻根部和穗中相當(dāng)，而其地上部的表達(dá)量?jī)H為根部的1/8到1/7(圖1)。

實(shí)施例4oswrky72過(guò)量表達(dá)水稻植株的獲得

委托生物公司合成2x35scamv啟動(dòng)子序列(seqidno.9)和35s終止子序列(seqidno.10)，在2x35scamv啟動(dòng)子序列上下游分別引入ecori和saci酶切位點(diǎn)，在35s終止子序列上下游分別引入psti和hindiii酶切位點(diǎn)。通過(guò)兩對(duì)酶切位點(diǎn)將獲得的啟動(dòng)子和終止子序列連接到表達(dá)載體pcambia1305，獲得最終的過(guò)量表達(dá)載體pcambia1305-35st。

根據(jù)實(shí)例1得到的oswrky72的cdna全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整開(kāi)放閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)kpni和bamhi，上游引物為w72-orf-f：ggtaccatggagaacttcccgatactc(seqidno.7)，下游引物為w72-orf-r：ggatccctactggaacatgtgggaagc(seqidno.8)，以實(shí)施例1中的cdna模板進(jìn)行pcr，繼而通過(guò)這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將oswrky72的開(kāi)放閱讀框連接到pcambia1305-35st載體中，由此獲得2x35scamvpromoter::oswrky72::35sterminator表達(dá)盒。然后通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因方法將其轉(zhuǎn)入水稻品種日本晴。待獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行一系列分子鑒定后對(duì)其進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，oswrky72過(guò)量表達(dá)植株的株高與野生型植株相比顯著降低，而其根長(zhǎng)和葉片夾角角度則顯著增加(圖2～圖4)。

上述實(shí)施例表明本發(fā)明中克隆的wrky轉(zhuǎn)錄因子基因oswrky72在水稻中可同時(shí)改變地上部和地下部的株型。

本發(fā)明人從單子葉植物水稻(oryzasativa)中克隆了一個(gè)cdna，其編碼groupii型wrky轉(zhuǎn)錄因子oswrky72。rt-qpcr分析表明其在水稻根部、葉片、葉鞘、莖和穗中均有表達(dá)。轉(zhuǎn)基因研究表明，將oswrky72基因轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株在正常條件下的長(zhǎng)勢(shì)與對(duì)照相比其株高降低、根長(zhǎng)和葉片夾角大小則增加。該基因可作為目的基因?qū)胫仓?，改變植株株型，提高植株抗倒伏能力、根系吸收水分和養(yǎng)分能力及光合作用能力，以進(jìn)行植物品種改良。在本發(fā)明的方法中，可利用oswrky72基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可用任何一種啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子、ubiquitin啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子，該表達(dá)載體中必要時(shí)可包括增強(qiáng)子，不論是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。