本發(fā)明涉及谷子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及與谷子穗長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測引物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國是谷子的原產(chǎn)地和世界上栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家，產(chǎn)量約占全世界總量的80％。同時，我國也是谷子遺傳資源數(shù)量最多、多樣性最豐富的國家。穗長、株高等是影響谷子產(chǎn)量的重要因子，研究與控制谷子穗長等產(chǎn)量性狀相關(guān)的基因位置及其功能等，對于指導(dǎo)谷子遺傳育種具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是基因組水平上由單個核苷酸堿基的變異引起的dna序列多態(tài)性，其在基因組中數(shù)量多，分布廣泛，遺傳穩(wěn)定性好。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，對不同個體同一基因或基因片段進行直接測序和序列比較，可以確定堿基是否存在變異。因此，snp檢測有利于基因分型，適用于快速和規(guī)?；Y查未知或已知snp與某遺傳性狀的關(guān)系。目前關(guān)于谷子數(shù)量性狀相關(guān)的qtl(quantitativetraitlocus)定位和snp標(biāo)記研究主要集中于ssr標(biāo)記的開發(fā)利用等途經(jīng)，而利用群體自交系基因組測序檢測單核苷酸多態(tài)性(snp)分子標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用研究尚未有報道。因此，開展谷子數(shù)量性狀snp分子標(biāo)記的開發(fā)，并建立輔助選育體系，對于提高谷子產(chǎn)量，節(jié)約育種成本具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種與谷子穗長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測引物和應(yīng)用，可以預(yù)測谷子穗長，為實現(xiàn)谷子穗長性狀的早期鑒定和篩選育種提供分子輔助技術(shù)支持。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種與谷子穗長性狀相關(guān)的snp標(biāo)記，該snp標(biāo)記是pl-02-016，其位于谷子第2號染色體的序列第38395016bp位置，堿基為c/t。進一步地，上述pl-02-016位點所在的序列如seqidno：3所示，上述pl-02-016位點是seqidno：3所示序列自5’端起第148位堿基。進一步地，對上述snp標(biāo)記，利用復(fù)合區(qū)間作圖法，采用5％的總體顯著水平，qtl檢測的lod值為3.7556，表型變異解釋率為3.35％。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測如第一方面的snp標(biāo)記的引物對，包括：上游引物7_2f：5’-gtatgctccacgcccttta-3’(seqidno：1)和下游引物7_2r：5’-ttgcgattaccacttgatt-3’(seqidno：2)。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種用于檢測如第一方面的snp標(biāo)記的試劑盒，包括如第二方面的引物對，以及任選的用于pcr擴增的試劑成分，這些試劑成分可以包括pcr緩沖液、dntps、dna聚合酶等。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種檢測如第一方面的snp標(biāo)記的方法，采用如第二方面的引物對，對待檢測的谷子基因組dna進行pcr擴增，并通過測序擴增產(chǎn)物來分析pl-02-016位點的堿基情況。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供如第二方面的引物對在檢測如第一方面的snp標(biāo)記中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供一種谷子穗長預(yù)測方法，采用如第二方面的引物對，對谷子基因組dna進行pcr擴增，并通過測序擴增產(chǎn)物來分析pl-02-016位點的堿基情況，進而預(yù)測谷子穗長。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供如第一方面的snp標(biāo)記在谷子穗長預(yù)測、或谷子穗長性狀的早期鑒定、或谷子分子輔助育種中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提供如第二方面的引物對在谷子穗長預(yù)測、或谷子穗長性狀的早期鑒定、或谷子分子輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的與谷子穗長性狀相關(guān)的snp標(biāo)記可以用于谷子穗長性狀的分子標(biāo)記輔助育種，通過該snp標(biāo)記可以預(yù)測谷子穗長，為實現(xiàn)谷子穗長性狀的早期鑒定和篩選育種提供分子輔助技術(shù)支持，對于加快谷子品種的遺傳選育和改良進程具有重要的理論和實踐指導(dǎo)意義。本發(fā)明的特異性引物可以對谷子穗長進行良好分型，檢測snp表達的差異。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例中谷子父母本基因組dna電泳膠圖，其中m泳道表示dl2000marker；1泳道表示張谷三號基因組dna；2泳道表示a2基因組dna。圖2為本發(fā)明實施例中谷子父母本基因組pcr產(chǎn)物電泳膠圖，其中a7-2表示以a2dna為模板、7-2為引物的pcr產(chǎn)物，37-2表示以張谷三號dna為模板、7-2為引物的pcr產(chǎn)物，m表示dnamarker的片段大小，從下至上依次為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。圖3為本發(fā)明實施例中母本和父本snp標(biāo)記pl-02-016所在的序列的比對結(jié)果圖，snp標(biāo)記pl-02-016位于第2號染色體，第38395016bp位置，母本堿基為c，父本堿基為t。具體實施方式下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。本發(fā)明實施例提供與谷子穗長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記、引物及其應(yīng)用。本發(fā)明實施例的谷子穗長緊密連鎖snp標(biāo)記pl-02-016，位于谷子第2號染色體的序列第38395016bp位置(參考基因組——yugu基因組上的堿基編號)，堿基為c/t。值得說明的是，本發(fā)明中bin是指bin作圖(binmap)中，利用作圖群體中全部的重組位點信息，獲得構(gòu)成重組事件的最小單位(recombinationbin)。利用得到的bin作為標(biāo)記用于后續(xù)的連鎖圖譜構(gòu)建和qtl定位。在本發(fā)明實施例中，遺傳圖譜(geneticmap或linkagemap)是指以遺傳標(biāo)記間重組率為基礎(chǔ)構(gòu)建的標(biāo)記之間相對位置的線性排列圖?；诟咄恐販y序技術(shù)通過對作圖群體親本和子代群體進行測序，將一定數(shù)量的連續(xù)snp作為判斷子代重組位點的依據(jù)，得到每個子代的全基因組物理重組圖譜。利用作圖群體中全部的重組位點信息，獲得構(gòu)成重組事件的最小單位(recombinationbin)和bin圖(binmap)，并利用得到的bin作為標(biāo)記用于后續(xù)的連鎖圖譜構(gòu)建和qtl定位。本發(fā)明實施例提供谷子父本“張谷三號”和母本“a2”材料(用谷子不育系1066a與谷子光溫敏不育系821雜交后，經(jīng)多代選育而成)、二者雜交的f1代材料及自交13代的f2群體441份材料。將各份材料在河北張家口種植，并記錄和整理穗長等性狀數(shù)據(jù)。將各份材料進行簡并基因組重測序后，比對參考基因組拼接完成，獲得snp標(biāo)記。通過分析穗長性狀數(shù)據(jù)，獲得與之相關(guān)的snp標(biāo)記，并通過克隆測序驗證該snp標(biāo)記。以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果，應(yīng)當(dāng)理解，實施例僅是示例性的，用于說明本發(fā)明的可行性以及得到的結(jié)果，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。實施例1：高通量測序和snp標(biāo)記信息分析本實施例利用谷子父本“張雜谷3號”和母本“a2”材料、二者雜交獲得的f1代材料及f1代自交13代后得到的f2群體441份材料，即重組自交系(recombinantinbredlines，rils)。將各份材料在河北張家口種植，并記錄和整理穗長等性狀數(shù)據(jù)。將各份材料進行簡并基因組重測序后，比對參考基因組拼接完成，獲得snp標(biāo)記。通過分析穗長性狀數(shù)據(jù)，獲得與之相關(guān)的snp標(biāo)記，并通過克隆測序驗證該snp標(biāo)記。本實施例利用radseq方法，提取每個樣本個體(其中441個rils、2個親本、1個f1個體)的基因組dna并進行dna質(zhì)量檢測，對合格的dna進行酶切，電泳回收dna片段，并加上接頭進行簇(cluster)制備，最后上機測序。本實施例的具體步驟如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成勻漿轉(zhuǎn)入15ml的離心管中，然后往研缽中加入1ml1.5×ctab沖洗，再轉(zhuǎn)入離心管中?；靹蚝笥?5℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×ctab配方(1l)如下表1：表1成分用量ctab15g1mol/ltris.cl(ph為8.0)75ml0.5mol/ledta30mlnacl61.4g加去離子水定容至1l，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)樯罹G色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混合靜止5min；于-20℃放置30min沉淀dna。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1ml75％乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管干燥dna，加入50μlte溶解dna。(5)檢測dna的濃度，并用水調(diào)整為20ng/μl。(6)采用psti酶進行酶切，打斷基因組dna，反應(yīng)體系如下表2：表2(7)進行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下表3：表3(8)每個樣品各取1μl反應(yīng)產(chǎn)物，加入一個新的離心管中，總體積12μl。每12個樣品一組。(9)用3％回收膠電泳1h，eb染色后切取300-700bp大小片段。用qiaquickkit進行膠純化回收，回收產(chǎn)物溶于30μleb溶液。(10)進行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)體系如下表4：表4pcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行10個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。(11)磁珠純化，完成建庫。具體純化方法為：首先，pcr后加入1.2倍體積磁珠，靜置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500μl70％乙醇洗滌兩次。干熱儀上蒸干后，加入15μleb溶液溶解5min。最后，磁力架上吸附，轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管中。(12)檢測達到上機標(biāo)準(zhǔn)后上機測序。結(jié)果：對444個樣本(其中441個rils、2個親本、1個f1個體)進行酶切建庫測序，得到75.99gb原始數(shù)據(jù)，平均每個個體171.54mb。將測序序列比對到參考基因組(即yugu基因組，可以從下列網(wǎng)址獲取yugu基因組的序列：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝setaria+italica+(foxtail+millet))上，平均比對率86.326％，平均覆蓋率8.226％，平均測序深度3.655x。通過測序和信息分析，獲得親本間有多態(tài)性的33771個snp標(biāo)記。根據(jù)窗口滑動的方法，選取若干個snp為一個窗口，每次滑動一個snp確定每個窗口的基因型以及每個個體的交換位點。最后生成bin基因型。根據(jù)bin基因型數(shù)據(jù)，用mstmap軟件構(gòu)建遺傳圖譜，2022個bin定位到9條染色體上，再將遺傳圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到mapchart軟件，整合一張基因組遺傳連鎖圖譜。利用所構(gòu)建的谷子高密度遺傳圖譜，采用復(fù)合區(qū)間作圖分析(cim)，對谷子穗長性狀表型進行qtl分析。qtl檢測采用5％的總體顯著水平，根據(jù)500次排列檢驗結(jié)果，確定穗長性狀表型數(shù)據(jù)qtl分析的臨界lod值，分析得到與穗長相關(guān)的預(yù)測bin區(qū)間和snp位點信息。結(jié)果顯示，與谷子穗長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記pl-02-016，位于遺傳連鎖圖譜第2號染色體237.81厘摩(cm)，第201個bin至第202個bin(chr2_bin201-chr2_bin202)，利用復(fù)合區(qū)間作圖法，采用5％的總體顯著水平，qtl檢測的lod值為3.7556，表型變異解釋率為3.35％，加性效應(yīng)值(additiveeffect，a)為-0.8594。實施例2：snp標(biāo)記驗證根據(jù)預(yù)測的bin區(qū)間和snp位點，比對參考基因組，得到相關(guān)區(qū)域基因序列，選取snp位點前后300bp左右，設(shè)計開發(fā)snp標(biāo)記引物，以父本和母本材料dna為模板進行pcr擴增。選擇引物擴增正常、pcr產(chǎn)物符合預(yù)測大小的擴增產(chǎn)物，回收產(chǎn)物并進行測序，選擇父本和母本材料擴增基因序列有snp位點差異的標(biāo)記引物。預(yù)測的bin標(biāo)記中包含多個snp位點，根據(jù)pcr結(jié)果對這些位點進行篩選。首先，根據(jù)pcr產(chǎn)物回收后的測序結(jié)果，選擇父本和母本材料擴增基因序列有snp位點差異的標(biāo)記。具體步驟如下：(1)按照實施例1中步驟(1)至(4)，用ctab法分別提取父母本基因組dna。(2)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組dna，谷子父母本基因組dna電泳膠圖如圖1所示。(3)將得到的父母本基因組dna存于-20℃?zhèn)溆谩?4)分別以提取的父本和母本的基因組dna為模板，利用7_2f：5’-gtatgctccacgcccttta-3’(seqidno：1)和7_2r：5’-ttgcgattaccacttgatt-3’(seqidno：2)擴增引物進行pcr擴增。pcr反應(yīng)體系如下表5：表5試劑用量無菌水20.2μl10×緩沖液(含mg2+)2.5μldntps(25mm)0.15μltaq酶(5u/μl)0.15μl正向引物(10μmol/l)0.5μl反向引物(10μmol/l)0.5μl模板1.0μl總體積25μlpcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后于4℃下保存。各pcr擴增產(chǎn)物取部分進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。通過對pcr擴增產(chǎn)物測序可知，引物7_2f和7_2r擴增得到的母本擴增產(chǎn)物的測序序列如序列表中seqidno：3所示，pl-02-016位點是seqidno：3所示序列自5’端起第148位堿基。母本擴增產(chǎn)物和父本擴增產(chǎn)物的測序序列比對結(jié)果如圖3所示，其中標(biāo)灰的堿基表示pl-02-016位點的堿基。然后，根據(jù)樣品穗長數(shù)據(jù)篩選：父本穗長為26cm，母本穗長為19cm，441份樣品中，最小值17cm，最大值47cm，穗長長度最短的50個樣品中，該snp與母本相同的大于70％，穗長長度最長的50個樣品中，與父本snp相同的樣品數(shù)多于80％。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。sequencelisting<110>張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>與谷子穗長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測引物和應(yīng)用<130>16i23502<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>用于檢測pl-02-016的上游引物<400>1gtatgctccacgcccttta19<210>2<211>19<212>dna<213>用于檢測pl-02-016的下游引物<400>2ttgcgattaccacttgatt19<210>3<211>281<212>dna<213>pl-02-016位點所在的序列<220><221>snp位點<222>(148)..(148)<223>n是c或t<400>3ccctttagcagagcgattgcacgaaacaaaagcctcgtatccttcagccattatgacatc60tgcagacaggtcctgcctcgacaatttggtctcctacatacaacgcagaaggcattgata120cagtttggcaaatgaatcacaaaccaanccccatttcacccagttttactatttgcattt180gactgaacaaacgatccaataacatcccaccacagaaccgacaatttgatcagcattaaa240cgagatacactaatttttttctgaaatcaagtggtaatcgc281當(dāng)前第1頁12