本申請系關(guān)于一種植酸酶，尤指一種提升耐熱性的植酸酶。

現(xiàn)有技術(shù)

植酸(phyticacid)又稱為肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，為植物中儲存磷的主要形式，在種子中含量尤其豐富，而種子如谷類及豆類是動物飼料的主要原料。雖然種子中的植酸可成為飼養(yǎng)動物所需磷的重要來源，但只有反芻動物才能代謝植酸以利用其中的磷；對于非反芻動物，不能被消化代謝的植酸反而被視為抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，是因為植酸帶有豐富的負(fù)電，易與帶有正電的離子，如鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、銅離子、鐵離子螯合，再與蛋白質(zhì)及淀粉形成復(fù)合物，阻礙消化酵素代謝，影響營養(yǎng)物質(zhì)及金屬離子的消化吸收。此類無法代謝植酸的非反芻動物須在飲食中添加無機(jī)磷或添加植酸酶。但添加無機(jī)磷的方式不僅成本高，動物排泄物中未被代謝的植酸也會造成水質(zhì)污染，破壞生態(tài)平衡。經(jīng)由植酸酶在飼料中的添加，則可增加動物對飼料中磷的可利用性達(dá)到60％，降低磷酸的抗?fàn)I養(yǎng)現(xiàn)象，除了提高營養(yǎng)吸收，也能降低磷的排出達(dá)50％。

植酸酶是能夠從植酸中水解出磷酸根的酵素泛稱，在動物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在，植酸酶能夠?qū)⒅菜嵘系牧鶄€磷酸根依序水解出來，不同植酸酶的水解最終程度不一，水解機(jī)制也不同，若依此做為分類，植酸酶可分為組氨酸酸性磷酸酶(histidineacidphophatase)、紫色酸性磷酸酶(purpleacidphosphatase)、β螺旋槳植酸酶(β-propellerphytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteinephytase)，其中組氨酸酸性磷酸酶因為其最適ph值及作用條件較適合用于飼料添加，因此被廣泛的研究。組氨酸酸性磷酸酶催化機(jī)制是藉由酸堿反應(yīng)，將連接肌醇環(huán)及磷酸根的磷酸單脂鍵進(jìn)行水解作用，釋放出磷酸根；水解步驟分為兩個階段，首先組氨酸酸性磷酸酶會利用活性區(qū)的組氨酸攻擊植酸中的一個磷酸單脂鍵，形成磷酸-組氨酸中間體，再由活性區(qū)的天冬氨酸利用一個水分子提供質(zhì)子給磷酸-組氨酸中間體中磷酸根的氧離子，釋放出一個磷酸根。

盡管植酸酶于飼料添加在動物飼養(yǎng)已顯示增加生產(chǎn)力，且使用500-1000單位活性的植酸酶可代替1克的的無機(jī)磷添加及減少30-50％磷的排出，但在工業(yè)上如何使占有飼料市場60％的植酸酶能具有經(jīng)濟(jì)效益，為酵素改造持續(xù)的目標(biāo)及需求。植酸酶在飼料工業(yè)的制程及應(yīng)用上，必須具有在ph2-6.5高活性，抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性，產(chǎn)品制粒時的耐熱性，提高酵素作用時的活性才能降低生產(chǎn)成本。

酵素改造的策略可分為兩種，一是利用定向進(jìn)化，一是利用理論性的設(shè)計。定向進(jìn)化包括兩個步驟，一是制造具有豐富多樣性的突變基因庫，其次再從基因庫中篩選具有特定優(yōu)化特性的突變株。突變基因庫的制造方法常用的有易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(error-pronepcr)及dna重組反應(yīng)(dnashuffling)，但龐大的突變基因庫需要有大量篩選的方法，否則對于篩選上是相當(dāng)耗費人力及時間的。近年來，隨著可利用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及序列增加，還有計算機(jī)計算軟件技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)中與底物結(jié)合、活性區(qū)域、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的氨基酸可被識別出，因此以此理論基礎(chǔ)建立的突變基因庫能更有效地篩選出優(yōu)化的酵素特性。

在比較耐熱性蛋白質(zhì)和適溫性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究，可觀察酵素結(jié)構(gòu)與耐熱性的關(guān)系，耐熱性蛋白質(zhì)有較多的氨基酸側(cè)鏈和側(cè)鏈間氫鍵及鹽橋的鍵結(jié)。另外，藉由一連串于t4溶解酵素(t4lysozyme)做的突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與特性分析，發(fā)現(xiàn)增加疏水核心的穩(wěn)定性、加強(qiáng)局部氫鍵及鹽橋的連結(jié)、使用雙硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)等可增加蛋白質(zhì)耐熱性。越來越多的研究運用計算機(jī)軟件仿真計算以提高蛋白質(zhì)的耐熱性，突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可藉由計算機(jī)軟件分析建立起一套參數(shù)，再將參數(shù)運用在增加其他目標(biāo)蛋白質(zhì)的耐熱性，縮小篩選穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的改造點及鍵結(jié)的范圍。

因此，本申請欲藉由改造基因以增加植酸酶之雙硫鍵鍵接，藉此提升植酸酶對于溫度的耐受性，以有效增加植酸酶在工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本申請之目的在于改造現(xiàn)有植酸酶，利用結(jié)構(gòu)分析及定點突變技術(shù)，增加植酸酶之雙硫鍵鍵接，以有效提升植酸酶之耐熱性，進(jìn)而增加植酸酶之工業(yè)應(yīng)用價值。

為達(dá)上述目的，本申請之一較廣義實施態(tài)樣為提供一種植酸酶，其氨基酸序列系為將序列編號2進(jìn)行突變組合a至d其中之一之序列，其中突變組合a系將序列編號2第143個氨基酸和第262個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)，突變組合b系將序列編號2第259個氨基酸和第312個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)，突變組合c系將序列編號2第205個氨基酸和第257個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)，以及突變組合d系將序列編號2第264個氨基酸和第309個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。編碼該序列編號2之基因系從大腸桿菌(escherichiacoli)所分離出來并經(jīng)優(yōu)化的appa基因，且該植酸酶系為組氨酸酸性磷酸酶。

在一實施例中，該植酸酶之氨基酸序列如序列編號24所示。

在一實施例中，該植酸酶之氨基酸序列如序列編號26所示。

在一實施例中，該植酸酶之氨基酸序列如序列編號28所示。

在一實施例中，該植酸酶之氨基酸序列如序列編號30所示。

本申請之另一較廣義實施方案為提供一種植酸酶，其氨基酸序列系為將序列編號2進(jìn)行突變組合a以及合并突變組合b及d其中之一之序列，其中突變組合a系將序列編號2第143個氨基酸和第262個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)，突變組合b系將序列編號2第259個氨基酸和第312個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)，以及突變組合d系將序列編號2第264個氨基酸和第309個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

在一實施例中，該植酸酶之氨基酸序列如序列編號32所示。

在一實施例中，該植酸酶之氨基酸序列如序列編號34所示。

附圖說明

圖1顯示植酸酶appa的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖2顯示植酸酶appa的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)及改造點的位置。

圖3顯示定點突變所用的引子。

圖4顯示改造后之a(chǎn)ppa-a植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖5顯示改造后之a(chǎn)ppa-b植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖6顯示改造后之a(chǎn)ppa-c植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖7顯示改造后之a(chǎn)ppa-d植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖8顯示改造后之a(chǎn)ppa-a+b植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖9顯示改造后之a(chǎn)ppa-a+d植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖10顯示appa與appa加上不同雙硫鍵突變組合的耐熱分析測試。

具體實施方式

體現(xiàn)本申請?zhí)卣髋c優(yōu)點的一些典型實施例將在后段的說明中詳細(xì)敘述。應(yīng)理解的是本申請能夠在不同的實施方案上具有各種的變化，其皆不脫離本申請的范圍，且其中的說明及圖式在本質(zhì)上系當(dāng)作說明之用，而非用以限制本申請。

本申請中的植酸酶基因(ecappa)是從大腸桿菌(escherichiacoli)所篩選出來的，其所表現(xiàn)的蛋白酶為組氨酸酸性磷酸酶。ecappa有許多符合工業(yè)應(yīng)用的特質(zhì)如：高活性、高度底物專一性、最適作用ph范圍、以及在工業(yè)生產(chǎn)菌株畢赤酵母(pichiapastoris)中表達(dá)量高等。為提高飼料制粒后的植酸酶活性，需提高ecappa的耐熱性，以提高ecappa的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值。由于ecappa已解出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此ecappa是相當(dāng)好做為進(jìn)一步酵素改良的目標(biāo)。

本申請利用雙硫鍵來提升蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，及降低高溫造成的不可逆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)延展，成功的提升ecappa的耐熱性。雙硫鍵選定的位置為技術(shù)關(guān)鍵，本申請使用理智設(shè)計(rationaldesign)篩選出雙硫鍵的突變位點來提升ecappa的耐熱性?；陔p硫鍵的形成不影響整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提，選擇雙硫鍵的突變點為ecappa的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相近處，以氨基酸側(cè)鏈和側(cè)鏈間β-碳原子距離內(nèi)做篩選參數(shù)；且在較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)表面添加雙硫鍵，以增加雙硫鍵帶來的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定效果；去除篩選出的二級結(jié)構(gòu)本身轉(zhuǎn)彎處的無效雙硫鍵，得到的雙硫鍵組合再以實驗方式加以篩選其提升耐熱性的功效。

以下將詳述本申請改造植酸酶之方法及其所得到之改良植酸酶。

本申請系運用定點突變(site-directedmutagenesis)技術(shù)進(jìn)行突變改造，并使用工業(yè)生產(chǎn)菌株畢赤酵母系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。首先，將ecappa序列合成優(yōu)化為畢赤酵母易表達(dá)的序列appa，其核苷酸序列以及氨基酸序列如第1圖所示，其中，appa表達(dá)序列包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號1標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號2標(biāo)示)。利用ecori與noti限制酶切位，構(gòu)筑到ppiczαa載體中，接著進(jìn)行定點突變。

第2圖顯示植酸酶appa的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)及改造點的位置，其中，植酸酶appa蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(pdb:1dkq)及肌醇六磷酸(inositolhexaphosphate)以灰色顯示，雙硫鍵突變組合的位置a(143-262)、b(259-312)、c(205-257)、d(264-309)以黑色標(biāo)示。如前所述，本申請系以氨基酸側(cè)鏈和側(cè)鏈間β-碳原子距離內(nèi)做篩選參數(shù)在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)表面挑選出的位點，去除在二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)彎處的雙硫鍵突變點，此方法篩選出增加耐熱的雙硫鍵突變appa-a、appa-b、appa-c、appa-d，其中，雙硫鍵突變appa-a系將第143個氨基酸和第262個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)以形成雙硫鍵，雙硫鍵突變appa-b系將第259個氨基酸和第312個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)以形成雙硫鍵，雙硫鍵突變appa-c系將第205個氨基酸和第257個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)以形成雙硫鍵，雙硫鍵突變appa-d系將第264個氨基酸和第309個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)以形成雙硫鍵。前述四組雙硫鍵突變位點其氨基酸側(cè)鏈和側(cè)鏈間β-碳原子距離分別為(因第312個氨基酸為無氨基酸側(cè)鏈的甘胺酸，此為甘胺酸的α-碳原子和第259個氨基酸側(cè)鏈的β-碳原子間的距離)、

定點突變所用的引子如第3圖所示，引子序列分別以序列編號3至22標(biāo)示，其中f為順向引子，r為逆向引子，且突變的位置以底線標(biāo)示。如前所述，雙硫鍵突變appa-a、appa-b、appa-c、appa-d的雙硫鍵突變組合分別為a(143-262)、b(259-312)、c(205-257)、d(264-309)。a1和a2分別為雙硫鍵突變組合a(143-262)中第143個氨基酸的位置和第262個氨基酸的位置突變用引子；b1和b2分別為雙硫鍵突變組合b(259-312)中第259個氨基酸的位置和第312個氨基酸的位置突變用引子；c1和c2分別為雙硫鍵突變組合c(205-257)中第205個氨基酸的位置和第257個氨基酸的位置突變用引子；d1和d2分別為雙硫鍵突變組合d(264-309)中第264個氨基酸的位置和第309個氨基酸的位置突變用引子。另外，本申請亦進(jìn)行appa-a+b及appa-a+d合并雙硫鍵突變的改造，其合并雙硫鍵突變組合分別為a+b(143-262、259-312)及a+d(143-262、264-309)，其中，合并雙硫鍵突變組合a+b突變用引子包括a1、a2+b1、及b2等三組引子，而合并雙硫鍵突變組合a+d突變用引子則包括a1、a2+d1、及d2等三組引子。

定點突變方法為利用突變引子進(jìn)行聚合酶鏈鎖反應(yīng)(polymerasechainreaction,pcr)，接著在pcr反應(yīng)產(chǎn)物中加入限制酶dpni于37℃下作用，將原始模板去除。再把含有突變的質(zhì)體送入大腸桿菌xl1b勝任細(xì)胞中，將菌液涂于含有50μg/mlzeocin抗生素的lb培養(yǎng)基于37℃下進(jìn)行培養(yǎng)一天。再挑選菌落，藉由定序步驟確認(rèn)成功突變基因序列。

第4圖顯示改造后之a(chǎn)ppa-a植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，appa-a植酸酶基因包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號23標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號24標(biāo)示)，且第143個氨基酸和第262個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

第5圖顯示改造后之a(chǎn)ppa-b植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，appa-b植酸酶基因包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號25標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號26標(biāo)示)，且第259個氨基酸和第312個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

第6圖顯示改造后之a(chǎn)ppa-c植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，appa-c植酸酶基因包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號27標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號28標(biāo)示)，且第205個氨基酸和第257個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

第7圖顯示改造后之a(chǎn)ppa-d植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，appa-d植酸酶基因包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號29標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號30標(biāo)示)，且第264個氨基酸和第309個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

第8圖顯示改造后之a(chǎn)ppa-a+b植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，appa-a+b植酸酶基因包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號31標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號32標(biāo)示)，且第143個氨基酸、第259個氨基酸、第262個氨基酸和第312個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

第9圖顯示改造后之a(chǎn)ppa-a+d植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，appa-a+d植酸酶基因包含1236個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號33標(biāo)示)以及410個氨基酸(氨基酸序列以序列編號34標(biāo)示)，且第143個氨基酸、第262個氨基酸、第264個氨基酸和第309個氨基酸突變成半胱氨酸(cysteine)。

將突變成功的appa基因使用限制酶pmei把dna質(zhì)體進(jìn)行線性化之后，藉由電轉(zhuǎn)步驟將dna送入畢赤酵母內(nèi)。接著將菌液涂于含有100μg/mlzeocin抗生素的ypd培養(yǎng)皿于30℃下進(jìn)行培養(yǎng)兩天。挑選菌落并接種到1mlypd于30℃下培養(yǎng)一天后，取最終od600濃度為0.2的體積接種到5mlbmgy培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)至隔天。接著，將培養(yǎng)基換成含有0.5％甲醇的2mlbmmy以誘導(dǎo)蛋白表現(xiàn)，培養(yǎng)于30℃下2～3天后，取菌液進(jìn)行離心并收集上清液，進(jìn)而檢測植酸酶活性及耐熱性。

植酸酶蛋白的活性測試方式是將4ml的7.5mm肌醇六磷酸鈉與0.2ml酶蛋白(酶蛋白的緩沖液為0.05％tritonx-100、0.05％bsa、及0.25m乙酸鈉，緩沖液為ph5.5)及1.8ml的反應(yīng)緩沖液0.25m乙酸鈉，ph為5.5，在37℃之下作用30分鐘。接著加入4ml的終止顯色液(水:硝酸溶液:10％鉬酸胺:0.2m偏釩酸胺＝4:2:1:1)，在od415波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線是由磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液0-25μmol/ml之間制定。而1unit的定義為每分鐘從濃度5mm植酸鈉溶液中釋放1μmole無機(jī)磷。

植酸酶蛋白的耐熱測試方式，是將不同突變點的上清液依活性稀釋為相同活性后，以聚合酶鏈鎖反應(yīng)機(jī)器進(jìn)行耐熱測試，耐熱條件為85℃反應(yīng)兩分鐘后立即降溫到25℃。耐熱性是以沒有進(jìn)行耐熱測試的上清液活性當(dāng)成100％來計算，以百分比表示。

第10圖顯示appa與appa加上不同雙硫鍵突變組合的耐熱分析測試。由第10圖結(jié)果可知，appa在85℃反應(yīng)2分鐘下，相較于appa的21.7％的活性殘留，appa-a、appa-b、appa-c、appa-d活性殘留可提升為70.9％、68.5％、35.4％、37.4％。又，合并雙硫鍵突變appa-a+b及appa-a+d亦可提高appa在85℃反應(yīng)2分鐘下活性殘留至80.5％及60.6％。換言之，本申請藉由添加雙硫鍵來穩(wěn)定植酸酶appa的結(jié)構(gòu)，使得appa-a、appa-b、appa-c、appa-d、appa-a+b及appa-a+d等突變蛋白在85℃下處理2分鐘后的殘留活性皆高于野生型appa，故本申請改良后的植酸酶具有較高的耐熱性，可有效運用在提升appa制粒時的耐熱性，及降低生產(chǎn)成本，因此具有較大潛力的工業(yè)應(yīng)用價值。

綜上所述，為了增加植酸酶的工業(yè)應(yīng)用價值，本申請使用理智設(shè)計篩選出雙硫鍵的突變位點，以藉由添加雙硫鍵來穩(wěn)定植酸酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提升植酸酶的耐熱性。本申請篩選出四組突變位點，appa-a系于第143個氨基酸和第262個氨基酸之間形成雙硫鍵、appa-b系于第259個氨基酸和第312個氨基酸之間形成雙硫鍵，appa-c系于第205個氨基酸和第257個氨基酸之間形成雙硫鍵，appa-d系于第264個氨基酸和第309個氨基酸之間形成雙硫鍵。另外，本申請亦進(jìn)行合并雙硫鍵突變的改造，包括appa-a+b及appa-a+d。根據(jù)耐熱分析測試結(jié)果可知，appa-a、appa-b、appa-c、appa-d、appa-a+b及appa-a+d等突變蛋白在85℃下處理2分鐘后的殘留活性皆高于野生型appa，故本申請改良后的植酸酶具有較高的耐熱性。換言之，本申請之雙硫鍵選定的技術(shù)不僅有效篩選出耐熱提升的蛋白質(zhì)突變，且有效提高篩選效率，而本申請所篩選到的雙硫鍵突變組合皆明顯提升植酸酶的耐熱性，可有效運用在提升植酸酶制粒時的耐熱性，及降低生產(chǎn)成本，因此具有較大潛力的工業(yè)應(yīng)用價值。

縱使本發(fā)明已由上述實施例詳細(xì)敘述而可由本領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)行各種修飾，然皆不脫如附權(quán)利要求所述的范圍。