本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2010年3月5日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080020173.x(pct/jp2010/053666)，發(fā)明名稱為“用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法”。

本發(fā)明涉及通過抑制t細(xì)胞的程序性死亡-1配體1(programmeddeath-1ligand1，pd-l1)和/或程序性死亡-1配體2(programmeddeath-1ligand2，pd-l2)的表達(dá)來增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，等等。

發(fā)明背景

經(jīng)由b7：cd28共刺激分子家族的信號(hào)強(qiáng)烈地參與t細(xì)胞反應(yīng)的活化、抑制和調(diào)節(jié)。已知屬于b7：cd28共刺激分子家族的pd-1(程序性死亡1)分子與pd-l1和pd-l2反應(yīng)，并負(fù)調(diào)控t細(xì)胞反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)1)。首先，據(jù)認(rèn)為在t細(xì)胞上表達(dá)的pd-1與在抗原呈遞細(xì)胞或癌細(xì)胞上表達(dá)的pd-l1，或者在抗原呈遞細(xì)胞上的pd-l2反應(yīng)以抑制t細(xì)胞的活化。

另一方面，已知pd-l1也表達(dá)于t細(xì)胞上。最近，證實(shí)了以下可能性，即pd-l1不僅與pd-1也與b7-1(cd80)結(jié)合，并且存在于t細(xì)胞上的pd-l1向所述t細(xì)胞發(fā)送負(fù)信號(hào)(非專利文獻(xiàn)2)。然而，完全未知在免疫反應(yīng)中表達(dá)于t細(xì)胞上的pd-l1所起的生理學(xué)和病理學(xué)作用。關(guān)于pd-l2，目前只知道它只在誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)于得自骨髓的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、b1b細(xì)胞和肥大細(xì)胞上，不清楚它在t細(xì)胞上的表達(dá)。因此，還不完全了解生理性地或強(qiáng)制地表達(dá)于t細(xì)胞上的pd-l2所起的作用。

已證實(shí)如下可能性：來自共刺激分子(其代表為ctla4或pd-1)的免疫應(yīng)答抑制信號(hào)，通過抑制自身反應(yīng)t細(xì)胞在初始階段的引發(fā)或效應(yīng)子功能誘導(dǎo)耐受(免疫耐受)，同時(shí)與來自共刺激分子(其代表為t細(xì)胞受體(tcr)或cd28)的免疫應(yīng)答活化信號(hào)相平衡，從而保護(hù)組織免受自身反應(yīng)t細(xì)胞傷害，并在另一方面調(diào)控傳染免疫或腫瘤免疫。另外，據(jù)認(rèn)為某些腫瘤或病毒利用共刺激分子通過直接或間接的機(jī)制來抑制t細(xì)胞的活化和增殖，以弱化針對(duì)它們的免疫反應(yīng)。此外，據(jù)認(rèn)為歸因于t細(xì)胞功能紊亂的部分疾病中，共刺激分子的異常是引起t細(xì)胞功能紊亂的原因。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：keirm，和另外三人，annu.rev.免疫學(xué)，第26卷,第677-704頁(2008)

非專利文獻(xiàn)2：buttem，和另外四人，immunity，第27卷，第111-122頁(2007)

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，和具有經(jīng)增強(qiáng)功能的t細(xì)胞。

解決所述問題的方法

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過人工調(diào)控t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)來調(diào)控t細(xì)胞免疫應(yīng)答是可能的。具體而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗腫瘤t細(xì)胞中pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的減少增強(qiáng)所述t細(xì)胞的抗腫瘤作用，從而使本發(fā)明得以完成。

更確切地說，本發(fā)明涉及：

[1]用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，包括抑制所述t細(xì)胞的程序性死亡-1配體1(pd-l1)和/或程序性死亡-1配體2(pd-l2)的表達(dá)；

[2][1]的用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，其中所述t細(xì)胞是細(xì)胞毒性t細(xì)胞或調(diào)節(jié)性t細(xì)胞；

[3][2]的用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，其中所述調(diào)節(jié)性t細(xì)胞是輔助性t細(xì)胞、調(diào)控t細(xì)胞(controllingtcell)或th17細(xì)胞；

[4][1]的用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，其中所述功能增強(qiáng)是t細(xì)胞干擾素-γ(ifn-γ)的產(chǎn)生增強(qiáng)；

[5][1]的用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，其中通過針對(duì)pd-l1和/或pd-l2的sirna抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)；

[6]具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞，所述t細(xì)胞在pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)方面受到抑制；

[7][6]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞，其中所述t細(xì)胞是細(xì)胞毒性t細(xì)胞或調(diào)節(jié)性t細(xì)胞；

[8][7]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞，其中所述調(diào)節(jié)性t細(xì)胞是輔助性t細(xì)胞、調(diào)控t細(xì)胞或th17細(xì)胞；

[9][6]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞，其中所述功能增強(qiáng)是t細(xì)胞干擾素-γ(ifn-γ)的產(chǎn)生增強(qiáng)；

[10][6]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞，其中通過針對(duì)pd-l1和/或pd-l2的sirna抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)；和

[11]用于對(duì)[6]-[10]中任一項(xiàng)的具有經(jīng)增強(qiáng)功能的t細(xì)胞顯示敏感性的疾病的治療劑，其包含所述t細(xì)胞作為活性成分。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)

本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞，等等。該t細(xì)胞增強(qiáng)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答，并可用于有效的癌癥免疫療法，或可用于傳染病或自身免疫性疾病的治療或預(yù)防。

附圖簡(jiǎn)述

[圖1]圖1是分析cd8陽性t細(xì)胞的pd-l1表達(dá)的圖。

[圖2]圖2是分析cd8陽性t細(xì)胞的pd-l1表達(dá)的圖。

[圖3]圖3是分析cd8陽性t細(xì)胞的pd-l2表達(dá)的圖。

[圖4]圖4是顯示cd8陽性t細(xì)胞的干擾素γ(ifn-γ)濃度的圖。

[圖5]圖5是顯示cd4陽性t細(xì)胞的ifn-γ濃度的圖。

[圖6]圖6是分析lcl的pd-l1表達(dá)的圖。

[圖7]圖7是分析lcl的pd-l2表達(dá)的圖。

[圖8]圖8是顯示cd8陽性四聚體-陽性t細(xì)胞的比例的圖。

優(yōu)選實(shí)施方案詳述

本文中，“t細(xì)胞的經(jīng)增強(qiáng)的功能”意為改良所述t細(xì)胞的效應(yīng)子功能。所述t細(xì)胞的經(jīng)增強(qiáng)的功能(其不限制本發(fā)明)，包括在所述t細(xì)胞的增殖速率上的提高、在細(xì)胞因子產(chǎn)量上的增加、或細(xì)胞毒性的改良。此外，所述t細(xì)胞的經(jīng)增強(qiáng)的功能包括在受抑制狀態(tài)例如無反應(yīng)性(無應(yīng)答性)狀態(tài)或休眠狀態(tài)下所述t細(xì)胞的耐受性的消除和抑制，更確切地說，所述t細(xì)胞從所述受抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變到所述t細(xì)胞對(duì)來自外界的刺激作出反應(yīng)的狀態(tài)。

本發(fā)明中，“無反應(yīng)性”包括免疫細(xì)胞對(duì)刺激(例如，通過活化受體或細(xì)胞因子的刺激)的無應(yīng)答性。無反應(yīng)性可因例如暴露于免疫抑制劑或暴露于高劑量的抗原而發(fā)生。這種無反應(yīng)性通常是抗原特異性的，和甚至在完成暴露于所耐受的抗原之后仍持續(xù)。例如，t細(xì)胞中的無反應(yīng)性的特點(diǎn)在于不產(chǎn)生細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素(il)-2)。t細(xì)胞的無反應(yīng)性發(fā)生在當(dāng)t細(xì)胞暴露于抗原時(shí)缺乏第二個(gè)信號(hào)(共刺激信號(hào))的情況下接收到第一個(gè)信號(hào)(經(jīng)由tcr或cd-3的信號(hào))的時(shí)候。

本文中，“pd-l1”意指pd-1的配體1，它是表達(dá)于所謂的抗原呈遞細(xì)胞(例如活化的單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞)上的共刺激分子，也被稱作b7-h1。genbank檢索號(hào)af233516顯示了人pd-l1的核苷酸序列，nm021893顯示了小鼠pd-l1核苷酸序列(freeman等人.(2000)j.exp.med.192：1027)。

本文中，“pd-l2”意指pd-1的配體2，也被稱作b7-dc。genbank檢索號(hào)nm_025239顯示了人pd-l2的核苷酸序列，nm_021896顯示了小鼠pd-l2的核苷酸序列(natureimmunology,2001,第2卷,第3期,第261-267頁)。

本文中，“t細(xì)胞”也被稱作t淋巴細(xì)胞，意指在參與免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞中的得自胸腺的細(xì)胞。t細(xì)胞包括cd8陽性t細(xì)胞(細(xì)胞毒性t細(xì)胞：ctl)、cd4陽性t細(xì)胞(輔助性t細(xì)胞)、抑制性t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(例如調(diào)控t細(xì)胞)、效應(yīng)細(xì)胞、幼稚t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、表達(dá)tcrα和β鏈的αβt細(xì)胞、和表達(dá)tcrγ和δ鏈的γδt細(xì)胞中的任一種。t細(xì)胞包括t細(xì)胞的前體細(xì)胞，其中定向分化為t細(xì)胞。除體液(例如血液(外周血、臍帶血等)和骨髓液)之外，“包含t細(xì)胞的細(xì)胞群體”的實(shí)例還包括，已從體液中收集、分離、純化或誘導(dǎo)的包含外周血單核細(xì)胞(pbmc)、造血細(xì)胞、造血干細(xì)胞、臍帶血單核細(xì)胞等的細(xì)胞群體。此外，可將包含t細(xì)胞和得自造血細(xì)胞的多種細(xì)胞群體用于本發(fā)明。這些細(xì)胞可能已通過細(xì)胞因子(例如il-2)在體內(nèi)或離體活化。像這些細(xì)胞一樣，可使用任何從活體收集的細(xì)胞或通過離體培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，例如，通過本發(fā)明的方法按原狀獲得的或通過冷凍保藏獲得的t細(xì)胞群體。

本文中，“癌癥”意指惡性腫瘤，是指顯示異常增殖表型或異常細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞，其具有顯示自動(dòng)增殖從而造成不可控的細(xì)胞增殖的特征。“腫瘤細(xì)胞”包括“惡性腫瘤細(xì)胞”或“良性腫瘤細(xì)胞”，也被稱作“得自瘤的細(xì)胞”。

本文中，“表達(dá)”意指通過自核酸(例如基因、多核苷酸、和寡核苷酸)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mrna，或通過自mrna的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽。“表達(dá)的抑制”是指與無抑制的情況相比轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物以顯著量減少。本文中表達(dá)的抑制表示，例如轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物的量減少30％或更多，優(yōu)選50％或更多，更優(yōu)選70％或更多，進(jìn)一步優(yōu)選90％或更多。

(1)本發(fā)明的用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法和具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞。

本發(fā)明用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法是包括抑制所述t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的步驟的方法。另外，本發(fā)明的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞是通過本發(fā)明用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法獲得的細(xì)胞。本發(fā)明的增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法有可能改善t細(xì)胞的效應(yīng)子功能，包括t細(xì)胞增殖速率的提高，細(xì)胞因子產(chǎn)量的增加或細(xì)胞毒性的改良。此外，消除或抑制t細(xì)胞的受抑制狀態(tài)例如無反應(yīng)性狀態(tài)或休眠狀態(tài)，改善t細(xì)胞對(duì)來自外界的刺激的敏感性。本發(fā)明如此獲得的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞可用于治療或預(yù)防癌癥、傳染病或自身免疫性疾病中。

在本發(fā)明的方法中，可離體或體內(nèi)實(shí)施抑制t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的步驟。

其中離體實(shí)施所述步驟的本發(fā)明方法包括下述步驟：(a)制備t細(xì)胞或包含t細(xì)胞的細(xì)胞群體，和(b)抑制步驟(a)中獲得的t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)，以制備具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞。所述方法可應(yīng)用于包括過繼免疫療法在內(nèi)的細(xì)胞免疫療法，并且是有用的。步驟(a)可為從活體中分離t細(xì)胞或包含t細(xì)胞的細(xì)胞群體的步驟，或制備已確立的t細(xì)胞或包含t細(xì)胞的細(xì)胞群體的步驟。此外，本發(fā)明的方法可包括從細(xì)胞群體中將包含t細(xì)胞的細(xì)胞群體分離出以制備細(xì)胞亞群的步驟和/或培養(yǎng)和刺激所述細(xì)胞群體的步驟。這些步驟可在步驟(a)和步驟(b)之前、之后的任意階段或與步驟(a)和步驟(b)同時(shí)進(jìn)行。在其中離體進(jìn)行抑制t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的步驟的本發(fā)明方法中，可通過適當(dāng)?shù)姆绞?例如，細(xì)胞亞群的制備，或所述細(xì)胞群體的培養(yǎng)或刺激)調(diào)控所述方法所適用的細(xì)胞的量和種類。因此，可減少有害事件(例如自身免疫，其為當(dāng)將抑制pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的物質(zhì)或抑制信號(hào)傳送的物質(zhì)施用于活體時(shí)所關(guān)注的)，因此它是非常有用的。

可實(shí)施將細(xì)胞群體與包含t細(xì)胞的細(xì)胞亞群分離的步驟，例如，通過經(jīng)由密度梯度離心的單核細(xì)胞部分的分級(jí)，或通過將t細(xì)胞的表面標(biāo)記用作指標(biāo)的分離方法。所述表面標(biāo)記的實(shí)例包括cd3、cd8和cd4，并且根據(jù)這些表面標(biāo)記的分離方法在本領(lǐng)域中已知。例如，可如下實(shí)施所述步驟：通過將抗cd8抗體已固定在其上的載體(例如珠?；蚺囵B(yǎng)容器)與包含t細(xì)胞的細(xì)胞群體混合，然后回收與所述載體結(jié)合的cd8陽性t細(xì)胞。對(duì)于抗cd8抗體固定于其上的珠粒，例如可適宜地使用cd8microbeads(由miltenyibiotec制造)、dynabeadsm450cd8(由invitrogen制造)，和eligix抗cd8mab包被的鎳顆粒(由biotransplant制造)。這也與將cd4用作指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)相同，例如可適宜地使用cd4microbeads(由miltenyibiotec制造)、dynabeadsm-450cd4(由invitrogen制造)。

可通過選擇適當(dāng)?shù)囊阎囵B(yǎng)條件(這取決于細(xì)胞群體)來實(shí)施培養(yǎng)細(xì)胞群體和包含t細(xì)胞的細(xì)胞亞群的步驟。另外，在刺激細(xì)胞群體的步驟中，可將已知的蛋白質(zhì)和化學(xué)成分等加入培養(yǎng)基以進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可將細(xì)胞因子、趨化因子或其他成分加入培養(yǎng)基。本文中，對(duì)所述細(xì)胞因子沒有特定限制，只要它可對(duì)t細(xì)胞起作用即可，它的實(shí)例包括il-2、ifn-γ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf)-β、il-15、il-7、ifn-α、il-12、cd40l、和il-27。從增強(qiáng)細(xì)胞免疫的角度出發(fā)，特別適宜使用il-2、ifn-γ或il-12，而從改善體內(nèi)轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞存活的角度出發(fā)，適宜地使用il-7、il-15或il-21。另外，對(duì)所述趨化因子沒有特定限制，只要它對(duì)t細(xì)胞起作用和顯示遷移活性即可，其實(shí)例包括rantes、ccl21、mip1α、mip1β、ccl19、cxcl12、ip-10和mig?？赏ㄟ^針對(duì)存在于t細(xì)胞表面上的分子例如，cd3、cd28或cd44的配體和/或針對(duì)所述分子的抗體的存在來實(shí)施對(duì)細(xì)胞群體的刺激。此外，可通過在細(xì)胞表面與其它淋巴細(xì)胞(例如呈遞靶肽(例如得自癌抗原的肽)的抗原呈遞細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞))接觸來刺激細(xì)胞群體。

當(dāng)在體內(nèi)實(shí)施抑制t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的步驟時(shí)，所述步驟通過向活體施用后述的特異地抑制其表達(dá)的方法來實(shí)施。因此，可使用合適的藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、微粒、微囊體等)。此外，例如，利用將t細(xì)胞的表面標(biāo)記用作指標(biāo)的遞送系統(tǒng)，可特異地抑制t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)。

抑制t細(xì)胞的pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的方法的實(shí)例包括使用核酸例如針對(duì)pd-l1和/或pd-l2的sirna、反義核苷酸、和核酶。

本發(fā)明中使用sirna是為了選擇性地抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)的目的，并基于利用雙鏈rna分子的rna干擾(rnai)，所述雙鏈rna分子具有與轉(zhuǎn)錄自編碼pd-l1和/或pd-l2的基因的mrna的核苷酸序列同源的序列和與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列。本文中“具有與轉(zhuǎn)錄自編碼pd-l1和/或pd-l2的基因的mrna的核苷酸序列同源的序列和與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列”不僅指每個(gè)序列均與所述mrna的核苷酸序列同源或互補(bǔ)的事實(shí)，而且還包括每個(gè)序列在使得發(fā)揮所需功能的這樣的范圍內(nèi)大致同源或互補(bǔ)的事實(shí)。所述雙鏈rna分子被稱作sirna(短干擾rna)。所述sirna可為與轉(zhuǎn)錄自編碼pd-l1和/或pd-l2的基因的mrna的一個(gè)區(qū)域同源/互補(bǔ)的sirna中的一種，或可為包含多個(gè)與不同區(qū)域同源/互補(bǔ)的rna分子的sirna。

本發(fā)明中使用的sirna的鏈長(zhǎng)的實(shí)例從在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制干擾素反應(yīng)的角度出發(fā)包括這樣的鏈長(zhǎng)，其中組成所述sirna的雙鏈體的其中一鏈具有13-29個(gè)堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)，優(yōu)選15-25個(gè)堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)，進(jìn)一步優(yōu)選20-25個(gè)堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)。另外，所述鏈長(zhǎng)的所有核苷酸序列可得自pd-l1和/或pd-l2的mrna的核苷酸序列，或其部分可得自所述核苷酸序列。此外，從在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中rna干擾的有效性的角度出發(fā)，本發(fā)明所用的sirna可為例如具有2-4個(gè)核苷酸突出于3’-末端側(cè)的單鏈區(qū)的雙鏈rna形狀，進(jìn)一步優(yōu)選具有2個(gè)核苷酸突出于3’-末端側(cè)的單鏈區(qū)的雙鏈rna形狀。作為突出的單鏈區(qū)，例示連續(xù)2-4個(gè)核苷酸的脫氧胸苷殘基(tt、ttt或tttt)。

本發(fā)明所用的sirna主要由核糖核苷酸構(gòu)成，其部分可包含不同于核糖核苷酸的核苷酸，例如，脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物，等等。可通過已知的化學(xué)合成方法合成sirna，但不特定限制所述方法?？墒褂眠m當(dāng)?shù)哪０搴怂崦复俚?例如，使用rna聚合酶)制備sirna。本發(fā)明中所用的sirna可呈可在分子中形成雙鏈體的單鏈rna形式，例示具有的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(短發(fā)夾結(jié)構(gòu)：sh結(jié)構(gòu))的單鏈rna，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有sirna部分作為莖和任意序列作為環(huán)。作為所述任意序列，例示1-30個(gè)核苷酸的序列，優(yōu)選使用1-25個(gè)核苷酸的序列，進(jìn)一步優(yōu)選使用5-22個(gè)核苷酸。

可基于需要抑制其表達(dá)的基因序列適宜地設(shè)計(jì)sirna序列。已報(bào)道許多sirna設(shè)計(jì)算法(參見，例如，wo2004/0455543、和wo2004/048566)，也可使用市售的軟件。另外，有許多根據(jù)需要抑制其表達(dá)的基因序列的信息設(shè)計(jì)sirna、合成并提供所述sirna的公司。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于需要抑制其表達(dá)的基因序列容易地獲得sirna。作為本發(fā)明中使用的sirna，可使用任一種，只要它是選擇性地抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)的sirna即可。例如，在非具體限制的情況下，可將包含核苷酸序列seqidno：1或seqidno：9的sirna用于pd-l1，可將包含核苷酸序列seqidno：2或seqidno：11的sirna用于pd-l2。

在本發(fā)明中，可將反義核苷酸用于抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)。將所述反義核苷酸用于抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如，通過直接干擾pd-l1和/或pd-l2的mrna分子的翻譯，通過rna降解酶h降解mrna，通過干擾mrna的5’加帽，通過掩蔽5’帽，通過防止翻譯因子與mrna結(jié)合，或通過抑制mrna的多腺苷化。通過反義核苷酸和pd-l1和/或pd-l2的mrna之間的雜交抑制蛋白質(zhì)表達(dá)。為了降低作為反義核苷酸的靶標(biāo)的mrna的穩(wěn)定性或降解所述mrna，選擇在所述mrna上的特定靶定位點(diǎn)。當(dāng)鑒定出一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)時(shí)，設(shè)計(jì)出具有與所述靶位點(diǎn)充分互補(bǔ)(更確切地說，其在生理?xiàng)l件下充分雜交并具有足夠的特異性)的核苷酸序列的核苷酸。

作為本發(fā)明的方法中使用的反義核苷酸，例如，例示具有鏈長(zhǎng)為8-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選10-80個(gè)核苷酸，更優(yōu)選14-35個(gè)核苷酸的核苷酸。

在本發(fā)明中，可將核酸(例如用于抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)的sirna和反義核苷酸)直接導(dǎo)入細(xì)胞，或可將經(jīng)設(shè)計(jì)使得在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄所述sirna或所述反義核苷酸的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)直接導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可適宜地使用用于導(dǎo)入核酸的試劑例如transit-tko(由mirus制造)和人t細(xì)胞nucleofectorkit(amaxa)。另一方面，當(dāng)使用其中轉(zhuǎn)錄rna分子的核酸構(gòu)建體時(shí)，可使用功能性連接于啟動(dòng)子下游的核酸構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子在t細(xì)胞中在可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄編碼sirna或反義核苷酸的核酸的情況下能夠發(fā)揮功能，但該核酸構(gòu)建體不具體限制本發(fā)明。另外，為了實(shí)現(xiàn)基因的有效轉(zhuǎn)錄，與啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)協(xié)作的其它調(diào)控序列(例如，增強(qiáng)子序列或終止子序列)可存在于所述核酸構(gòu)建體中。另外，為了通過同源重組將待導(dǎo)入t細(xì)胞染色體的對(duì)象插入的目的，例如可將基因安排在包含核苷酸序列的側(cè)翼序列之間，每個(gè)所述核苷酸序列與染色體中基因的所需靶插入位點(diǎn)的兩側(cè)核苷酸序列具有同源性。

在所述核酸構(gòu)建體中所用的啟動(dòng)子不受具體限制，只要它可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用即可，其實(shí)例包括rna聚合酶ii啟動(dòng)子、rna聚合酶iii啟動(dòng)子和人工可調(diào)控的啟動(dòng)子。rna聚合酶ii啟動(dòng)子的實(shí)例包括cmv啟動(dòng)子。另外，基于rna聚合酶iii的啟動(dòng)子的實(shí)例包括trna啟動(dòng)子、u6snrna啟動(dòng)子和組蛋白h1啟動(dòng)子。作為可用四環(huán)素人工調(diào)控的啟動(dòng)子，例示可用四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子，其實(shí)例包括四環(huán)素調(diào)控的u6啟動(dòng)子和tr啟動(dòng)子。另外，所述啟動(dòng)子和cre-loxp系統(tǒng)的組合使得有可能更嚴(yán)格地控制轉(zhuǎn)錄。

可構(gòu)建用于轉(zhuǎn)錄sirna的核酸構(gòu)建體以使可抑制目標(biāo)基因功能的雙鏈rna的有義鏈和反義鏈通過下述系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄：(a)串聯(lián)型，其中編碼有義rna的核酸和編碼反義rna的核酸分別連接在兩個(gè)不同的啟動(dòng)子的下游，并將這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位安排在正向方向，分別轉(zhuǎn)錄所述有義rna和所述反義rna，(b)以下類型，其中將編碼有義rna的核酸和編碼反義rna的核酸呈正向方向分別安排在一個(gè)啟動(dòng)子的下游，并轉(zhuǎn)錄具有莖-環(huán)型(或短發(fā)夾型)的rna，其中直接連接或用環(huán)連接所述有義rna和所述反義rna，或(c)反向型，其中將啟動(dòng)子分別安排在編碼有義鏈和反義鏈的核酸(分別具有兩條鏈)的兩端側(cè)，并用不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄兩條rna鏈。本發(fā)明中，可根據(jù)使用條件(例如，細(xì)胞種類、有義序列或反義序列的種類等)使用串聯(lián)型、莖-環(huán)型或反向型。

可將本發(fā)明使用的核酸構(gòu)建體摻入適當(dāng)?shù)妮d體(例如，質(zhì)粒載體或病毒載體)以在細(xì)胞中更穩(wěn)定地發(fā)揮效果。此外，可將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體摻入細(xì)胞的染色體dna上。所述質(zhì)粒載體的實(shí)例包括但不具體限于，pigenetrna質(zhì)粒(商標(biāo)名，由igene制造)、silentgene(由promega制造)和psechygro載體(由ambion制造)。為了將所述質(zhì)粒載體導(dǎo)入細(xì)胞中，可使用利用載體(例如脂質(zhì)體或配體-聚賴氨酸)的方法、磷酸鈣法、電穿孔法、基因槍法，等等。

不具體限制病毒載體，通常使用在基因?qū)敕椒ㄖ惺褂玫囊阎《据d體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體、假型載體)、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、猿猴病毒載體、痘苗病毒載體或仙臺(tái)病毒載體。特別優(yōu)選地，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或慢病毒載體。作為病毒載體，優(yōu)選其中復(fù)制能力缺陷以致其不能在被感染細(xì)胞中自主復(fù)制的病毒載體。另外，在基因?qū)霑r(shí)，也可使用提高基因?qū)胄实奈镔|(zhì)例如retronectin(注冊(cè)商標(biāo),由takarabioinc.制造)。市售腺病毒載體的實(shí)例包括knockoutadenoviralrnai系統(tǒng)(由clonetech制造)，市售逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例分別包括psinsi載體(由takarabioinc.制造)和psiren-retroq載體(由clonetech制造)。在病毒載體的情況下，可利用病毒感染細(xì)胞的能力將其導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。

本發(fā)明的方法中，在t細(xì)胞上實(shí)施抑制pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的方法。更確切地說，在步驟(b)中，例如，可使用輔助性t細(xì)胞、抑制性t細(xì)胞、調(diào)控t細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)、幼稚t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、表達(dá)tcrα和β鏈的αβt細(xì)胞或表達(dá)tcrγ和δ鏈的γδt細(xì)胞，或包括這些細(xì)胞的細(xì)胞群體、血液(外周血、臍帶血等)或骨髓液。這些t細(xì)胞可得自哺乳動(dòng)物，或可得自人或非人哺乳動(dòng)物。

可通過定量測(cè)定pd-l1和/或pd-l2蛋白，或定量測(cè)定轉(zhuǎn)錄自pd-l1和/或pd-l2基因的rna來確證對(duì)pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的抑制。

可在每一步驟的之前和之后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用下述方法評(píng)價(jià)本發(fā)明方法中t細(xì)胞的功能增強(qiáng)：細(xì)胞因子測(cè)定法、抗原特異性細(xì)胞測(cè)定法(四聚體測(cè)定法)、增殖測(cè)定法、溶細(xì)胞性細(xì)胞測(cè)定法或者使用重組腫瘤相關(guān)抗原或免疫原性片段或抗原衍生肽的體內(nèi)遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試。用于測(cè)量免疫應(yīng)答的增加的其它方法的實(shí)例包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試、使用肽主要組織相容性基因復(fù)合體四聚體的流式細(xì)胞術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法、細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)、直接細(xì)胞毒性測(cè)定法、通過定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)細(xì)胞因子mrna的測(cè)定法、或當(dāng)前用于測(cè)量t細(xì)胞反應(yīng)的測(cè)定法(例如有限稀釋法)。

與其中不抑制pd-l1和/或pd-l2表達(dá)的對(duì)照t細(xì)胞相比，本發(fā)明的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞在t細(xì)胞功能方面增強(qiáng)了。與對(duì)照t細(xì)胞相比，本發(fā)明的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞在例如ifn-γ的產(chǎn)量上增加了。與對(duì)照t細(xì)胞相比，本發(fā)明的t細(xì)胞在ifn-γ產(chǎn)量方面增加達(dá)10％或更多，優(yōu)選20％或更多，更優(yōu)選30％或更多。

本發(fā)明一方面的實(shí)例除包括對(duì)pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)的抑制之外，還包括增強(qiáng)進(jìn)一步t細(xì)胞功能的方法。例如，將編碼識(shí)別所需抗原的tcr的基因?qū)雝細(xì)胞，使得有可能獲得被賦予針對(duì)所述抗原的特異性和其效應(yīng)子功能經(jīng)改善的t細(xì)胞。所述抗原的實(shí)例包括但不具體限于：腫瘤抗原、微生物和病毒衍生抗原。關(guān)于針對(duì)多種抗原的tcr，已知其氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的基因的核苷酸序列，基于載體信息和載體向t細(xì)胞的導(dǎo)入構(gòu)建用于tcr表達(dá)的載體，使得有可能制備發(fā)揮抗原特異性作用的t細(xì)胞。因此，同時(shí)將用于抑制pd-l1和/或pd-l2的表達(dá)的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入t細(xì)胞，或?qū)⑺鰳?gòu)建體摻入用于tcr表達(dá)的載體中，使得有可能增強(qiáng)抗原特異性t細(xì)胞的效應(yīng)子功能。

當(dāng)將包含α和β鏈的tcr在t細(xì)胞中人工表達(dá)時(shí)，得自所述t細(xì)胞自身擁有的內(nèi)源tcr基因的α和β鏈之間的錯(cuò)配等，可阻礙所需抗原特異性的賦予。例如，完成導(dǎo)入的tcr基因的密碼子轉(zhuǎn)換，或利用sirna敲減內(nèi)源tcr基因(其在wo2008/153029中公開)，使得有可能制備獲得了高抗原特異性的t細(xì)胞。也可利用本發(fā)明的用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法制備這樣的t細(xì)胞。

(2)使用本發(fā)明具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞的治療方法或預(yù)防方法

本發(fā)明的治療方法或預(yù)防方法具有的特征為給活體施用通過(1)中的本發(fā)明用于增強(qiáng)功能的方法制備的t細(xì)胞。更確切地說，本發(fā)明的治療方法或預(yù)防方法包括下述步驟：(c)給活體施用步驟(b)中獲得的功能增強(qiáng)的t細(xì)胞。不特定限制本發(fā)明功能增強(qiáng)的t細(xì)胞所施予的疾病，只要它是對(duì)所述t細(xì)胞顯示敏感性的疾病即可，其實(shí)例包括癌癥(白血病、實(shí)體瘤，等等)、肝炎、流感、傳染病，其起因是病毒例如hiv、細(xì)菌或真菌，例如結(jié)核病、mrsa、vre、深部真菌病。另外，也可將本發(fā)明的細(xì)胞用于骨髓移植、或輻射后傳染病的預(yù)防、或?yàn)榫徑鈴?fù)發(fā)性白血病的供體淋巴細(xì)胞輸注。此外，所述細(xì)胞增強(qiáng)調(diào)控t細(xì)胞的功能，并可用于預(yù)防或治療自身免疫性疾病中。

在本發(fā)明的方法中，可皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)(包括通過留置導(dǎo)管進(jìn)行的方法)、瘤內(nèi)、給受試者施用功能增強(qiáng)的t細(xì)胞或?qū)⑵涫┯玫絺魅肓馨凸芾铩?/p>

在本發(fā)明的治療方法或預(yù)防方法中，待施用的功能增強(qiáng)的t細(xì)胞可為活體自身的細(xì)胞，或可為交叉衍生的細(xì)胞。

在首次施用本發(fā)明的功能增強(qiáng)的t細(xì)胞之前，或在治療起始后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，可使用抗原特異性細(xì)胞測(cè)定法、增值測(cè)定法、溶細(xì)胞性細(xì)胞測(cè)定法、或使用重組腫瘤相關(guān)抗原或免疫原性片段或抗原衍生肽的體內(nèi)遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試，在活體中評(píng)價(jià)本發(fā)明實(shí)施中所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。用于測(cè)量免疫應(yīng)答的增加的其它方法的實(shí)例包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試、使用肽主要組織相容性基因復(fù)合體四聚體的流式細(xì)胞術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法、細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)、直接細(xì)胞毒性測(cè)定法、通過定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)細(xì)胞因子mrna的測(cè)量，或當(dāng)前用于測(cè)量t細(xì)胞反應(yīng)的測(cè)定法(例如有限稀釋法)。此外，可通過活體具有的腫瘤質(zhì)量、直徑或惡性程度，受試者的感染病毒量或感染細(xì)菌量，或者受試者的存活率或存活期，來評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明的方法中，待施予活體的功能增強(qiáng)的t細(xì)胞量的實(shí)例包括但不具體限于，每成年人每天優(yōu)選1×10⁶至1×10¹²個(gè)細(xì)胞/天，更優(yōu)選1×10⁷至5×10¹¹個(gè)細(xì)胞/天，進(jìn)一步優(yōu)選1×10⁸至2×10¹¹個(gè)細(xì)胞/天。

(3)用于疾病的包含本發(fā)明功能增強(qiáng)的t細(xì)胞的治療劑

通過(1)中本發(fā)明用于增強(qiáng)功能的方法制備的功能增強(qiáng)的t細(xì)胞和包含所述t細(xì)胞作為活性成分的組合物可用作治療劑，用于對(duì)所述t細(xì)胞敏感的疾病(例如，前述的癌癥、肝炎或傳染病)。

可如下制備本發(fā)明的治療劑，例如通過將通過本發(fā)明方法制備的t細(xì)胞作為活性成分，與例如已知的有機(jī)或無機(jī)的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等(按照制藥領(lǐng)域中已知的方法，其適合于胃腸外施用)混合。另外，其可按照本發(fā)明(2)中的治療方法使用。

實(shí)施例

以下將通過實(shí)施例進(jìn)一步具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明并非僅限于下述實(shí)施例的范圍。

實(shí)施例1在cd8陽性t細(xì)胞中pd-l1的表達(dá)的確證

根據(jù)wo2007/032255，制備hla-a24限制性mage-a4143-151-特異性細(xì)胞毒性cd8陽性t細(xì)胞克隆2-28(miyaharay，和另外13人，clin.cancerres.,第11卷,第5581-5589頁(2005)，在下文中，被稱作cd8陽性t細(xì)胞克隆2-28)和mage-a4143-151肽。將所述cd8陽性t細(xì)胞克隆2-28在37℃下與自身類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(lcl)共培養(yǎng)，所述lcl已用80glyx射線照射并且已經(jīng)用mage-a4143-151肽脈沖，在0天、1天、2天和3天后用抗人pd-l1抗體(bdbioscience制造)將細(xì)胞表面的pd-l1染色，并用流式細(xì)胞術(shù)分析。圖1顯示用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。培養(yǎng)1天后pd-l1的表達(dá)最高。

實(shí)施例2通過rna干擾抑制cd8陽性t細(xì)胞的pd-l1和pd-l2的表達(dá)

將具有seqidno：1所述序列的對(duì)pd-l1特異的sirna、具有seqidno：2所述序列的對(duì)pd-l2特異的sirna或陰性對(duì)照sirna(全部由invitrogen制造)通過電穿孔導(dǎo)入cd8陽性t細(xì)胞克隆2-28。

將其中導(dǎo)入有針對(duì)pd-l1的sirna的細(xì)胞培養(yǎng)3天，然后在37℃下與經(jīng)80glyx射線照射和經(jīng)mage-a4143-151肽脈沖的自身lcl共培養(yǎng)。第二天，用抗人pd-l1抗體將其染色，用流式細(xì)胞儀分析在細(xì)胞表面的pd-l1的表達(dá)。

關(guān)于其中導(dǎo)入有針對(duì)pd-l2的sirna的細(xì)胞，在導(dǎo)入后的2天和3天后，用抗人pd-l2抗體(bdbioscience制造)將所述細(xì)胞染色并用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中的pd-l2的表達(dá)。

分別地在圖2中顯示pd-l1的分析結(jié)果，和在圖3中顯示pd-l2的分析結(jié)果。在其中不導(dǎo)入sirna的細(xì)胞(不經(jīng)處理)和其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照sirna的細(xì)胞(si對(duì)照)中，未見對(duì)pd-l1或pd-l2表達(dá)的抑制。在其中導(dǎo)入有對(duì)pd-l1特異的sirna的細(xì)胞(sipd-l1)和其中導(dǎo)入有對(duì)pd-l2特異的sirna的細(xì)胞(sipd-l2)中，分別發(fā)現(xiàn)對(duì)pd-l1和pd-l2的表達(dá)的抑制。

實(shí)施例3通過rna干擾促進(jìn)表達(dá)pd-l1和pd-l2的cd8陽性t細(xì)胞產(chǎn)生ifn-γ

通過電穿孔將陰性對(duì)照sirna、具有seqidno：3所述序列的對(duì)pd-1特異的sirna(invitrogen制造)、具有seqidno：1所述序列的對(duì)pd-l1特異的sirna或具有seqidno：2所述序列的對(duì)pd-l2特異的sirna，導(dǎo)入cd8陽性t細(xì)胞克隆2-28。在培養(yǎng)3天后，將此細(xì)胞與其中已用mage-a4143-151肽脈沖自身lcl的細(xì)胞以4：1或2：1比例混合，在37℃下共培養(yǎng)所述混合物，在第二天通過elisa方法測(cè)量各培養(yǎng)上清液中的ifn-γ的濃度。

圖4中顯示各細(xì)胞上清液中ifn-γ的濃度。與其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照sirna的細(xì)胞相比，在其中導(dǎo)入有對(duì)pd-1特異的sirna的細(xì)胞(sipd-1)中，在用兩種混合比例的培養(yǎng)時(shí)未見ifn-γ濃度的改變。與其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照sirna的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)pd-1特異的sirna的細(xì)胞相比，分別在其中導(dǎo)入有對(duì)pd-l1特異的sirna的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)pd-l2特異的sirna的細(xì)胞中，明顯見到ifn-γ濃度的增加。

實(shí)施例4通過rna干擾促進(jìn)表達(dá)pd-l1和pd-l2的cd4陽性t細(xì)胞表達(dá)ifn-γ

將陰性對(duì)照sirna、對(duì)pd-1特異的具有seqidno：3所述序列的sirna、對(duì)pd-l1特異的具有seqidno：1所述序列的sirna或?qū)d-l1特異的具有seqidno：2所述序列的sirna，通過電穿孔導(dǎo)入mage-a446-66-特異性cd4陽性t細(xì)胞克隆5，將其培養(yǎng)3天。將此細(xì)胞與其中已用mage-a446-66肽脈沖自身lcl的細(xì)胞以2：1混合，在37℃下培養(yǎng)所述混合物，在第二天通過elisa方法測(cè)量各培養(yǎng)上清液中的ifn-γ濃度。

圖5中顯示各細(xì)胞上清液中ifn-γ的濃度。在其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照sirna的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)pd-1特異的sirna的細(xì)胞中，未見ifn-γ的表達(dá)。在其中導(dǎo)入有對(duì)pd-l1特異的sirna的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)pd-l2特異的sirna的細(xì)胞中，明顯見到ifn-γ的表達(dá)。

實(shí)施例5針對(duì)抑制pd-l1和pd-l2的表達(dá)選擇sirna

將各自具有seqidno：8或9(sh831、sh832)所述序列的對(duì)pd-l1特異的sirna，或各自具有seqidno：10或11(sh833、sh834)所述序列的對(duì)pd-l2特異的sirna(全部由takarabioinc.制造)或?qū)嵤├?中使用的陰性對(duì)照sirna，通過電穿孔導(dǎo)入lcl，在37℃下將其培養(yǎng)2天，從每個(gè)細(xì)胞中提取出總rna，通過利用quantitectsybrpcrkit(qiagen制造)的實(shí)時(shí)rt-pcr測(cè)量pd-l1和pd-l2的表達(dá)，選擇具有強(qiáng)的表達(dá)抑制能力的sirna。

分別地，seqidnos.：12和13中顯示用于測(cè)量pd-l1表達(dá)的實(shí)時(shí)rt-pcr的引物序列，seqidnos.：14和15中顯示用于測(cè)量pd-l2的表達(dá)的實(shí)時(shí)rt-pcr的引物序列，seqidnos.：16和17中顯示作為表達(dá)的測(cè)量對(duì)象的人gapdh(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的實(shí)時(shí)rt-pcr的引物序列。

圖6中顯示pd-l1的實(shí)時(shí)rt-pcr的結(jié)果，圖7中顯示pd-l2的實(shí)時(shí)rt-pcr的結(jié)果。在所述圖中，縱坐標(biāo)顯示與人gapdh的表達(dá)相關(guān)的pd-l1或pd-l2的表達(dá)的比例。根據(jù)此結(jié)果，選擇了seqidno：9中顯示的sh832作為對(duì)pd-l1特異的sirna，和選擇seqidno：11中顯示的sh834作為對(duì)pd-l2特異的sirna。

實(shí)施例6表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型tcr的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備

根據(jù)wo2008/153029，制備pms-ma2和pms-pb2。這些載體包括基于mscv(鼠干細(xì)胞病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。此外，那些載體包含分別編碼識(shí)別腫瘤抗原mage-a4的tcrα和β鏈的基因，在這些基因中，轉(zhuǎn)換密碼子使得表達(dá)不受后述的用sirna對(duì)tcr的rna干擾抑制(在下文中，其中密碼子經(jīng)轉(zhuǎn)換的基因被稱作密碼子轉(zhuǎn)換型)。

實(shí)施例7表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型tcr和sirna的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備

從實(shí)施例6中制備的pms-ma2中用mlui和bglii切下密碼子轉(zhuǎn)換型tcrα基因，并制備出tcrα-mlui/bglii。將sirna簇pdl1-pdl2-tcrα-tcrβ(seqidno：4中顯示的人工合成基因)用bglii和noti消化，并聯(lián)同tcrα-mlui/bglii克隆至pms-pb2的mlui-noti位點(diǎn)，以制備ms-apb1-sipdl_1/2_sitcr載體(載體1)。所述載體1表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型tcr，并可表達(dá)seqidnos.：9、11、18和19中顯示的針對(duì)pd-l1、pd-l2、tcrα和tcrβ的sirna。在它們之中，針對(duì)tcrα和tcrβ的sirna抑制內(nèi)源野生型tcr的表達(dá)，并不抑制所述密碼子轉(zhuǎn)換型tcr的表達(dá)。

此外，制備seqidno：5中顯示的sirna簇pdl1-pdl2人工合成基因、seqidno：6中顯示的sirna簇pdl1人工合成基因和seqidno：7中顯示的sirna簇pdl2人工合成基因，然后與在載體1中一樣地制備ms-apb1-sipdl_1/2載體(載體2)、ms-apb1-sipdl_1載體(載體3)和ms-apb1-sipdl_2載體(載體4)。表1顯示各個(gè)載體表達(dá)的基因的概況。

[表1]

實(shí)施例8表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型tcr和sirna的逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液的制備

用實(shí)施例7中制備的載體1-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109，和用qiagenplasmidmidikit(qiagen制造)純化質(zhì)粒dna以提供用于轉(zhuǎn)染的dna。

根據(jù)產(chǎn)品方案使用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝試劑盒eco(retroviruspackingkiteco)(takarabioinc.制造)，將用于轉(zhuǎn)染的各種制備的dna轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中以獲得各種同向性病毒上清液。用0.45μm過濾器(milexhv，millipore制造)過濾此上清液，通過使用5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的方法[kawai等人，mol.cell.biol.,第4卷，第1172頁，(1984)]，使此上清液感染pg13細(xì)胞(atcccrl-10686)，回收該細(xì)胞的所得培養(yǎng)上清液，并使用0.45μm過濾器過濾以制備逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液。

實(shí)施例9用共表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型tcr和sirna的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染人外周血單核細(xì)胞

根據(jù)手冊(cè)使用retronectin(注冊(cè)商標(biāo)，takarabioinc.制造)，將分離自人外周血的外周血單核細(xì)胞(pbmc)用實(shí)施例8中制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液感染兩次，以制備共表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型tcr和sirna導(dǎo)入外周血單核細(xì)胞。在第二次病毒感染的3天后，回收所述細(xì)胞，用fastpuredna試劑盒(takarabioinc.)提取基因組，用原病毒拷貝數(shù)檢測(cè)引物組(proviralcopynumberdetectionprimerset)(takarabioinc.制造)和cycleavepcrcore試劑盒(takarabioinc.制造)計(jì)算各細(xì)胞的基因組中的平均原病毒拷貝數(shù)。用包含所述載體1-4的病毒溶液感染的pbmc的原病毒拷貝數(shù)分別為4.6個(gè)拷貝/細(xì)胞、2.2個(gè)拷貝/細(xì)胞、3.2個(gè)拷貝/細(xì)胞和4.5個(gè)拷貝/細(xì)胞。然后，從第二次病毒感染的5天后，回收所述細(xì)胞，用hla-a2402mage-a4四聚體pe(mbl制造)和人cd8-fitcconjugate(becton、dickinson制造)染色，和通過流式細(xì)胞儀確定cd8陽性且四聚體陽性的細(xì)胞的比例。

圖8中顯示mage-a4四聚體-陽性細(xì)胞的比例。橫坐標(biāo)表示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，縱坐標(biāo)表示mage-a4四聚體-陽性細(xì)胞的比例(％)。如圖8所示，通過各逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的導(dǎo)入確證通過基因?qū)肴送庵苎獑魏思?xì)胞的抗mage-a4tcrα/β復(fù)合蛋白的表達(dá)。另外，針對(duì)由所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)的pd-l1和pd-l2的sirna的表達(dá)并不對(duì)所導(dǎo)入的密碼子轉(zhuǎn)換型tcr的表達(dá)產(chǎn)生很大的影響。此外，針對(duì)tcrα和tcrβ的sirnas通過用sirna抑制野生型內(nèi)源tcr基因的表達(dá)的作用提高了密碼子轉(zhuǎn)換型tcrα/β復(fù)合蛋白表達(dá)的比例。

工業(yè)適用性

本發(fā)明提供了增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法，和具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的t細(xì)胞。此t細(xì)胞增強(qiáng)對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答，并可用于有效的癌癥免疫療法以及傳染病或自身免疫性疾病的治療和預(yù)防。

序列表自由正文

seqidno：1：對(duì)pd-l1特異的sirna

seqidno：2：對(duì)pd-l2特異的sirna

seqidno：3：對(duì)pd-1特異的sirna

seqidno：4：sirna簇pdl1-pdl2-tcrα-tcrβ

seqidno：5：sirna簇pdl1-pdl2

seqidno：6：sirna簇pdl1

seqidno：7：sirna簇pdl2

seqidno：8：針對(duì)pd-l1的sirna(sh831)

seqidno：9：針對(duì)pd-l1的sirna(sh832)

seqidno：10：針對(duì)pd-l2的sirna(sh833)

seqidno：11：針對(duì)pd-l2的sirna(sh834)

seqidno：12：pd-l1的實(shí)時(shí)pcrf-引物

seqidno：13：pd-l1的實(shí)時(shí)pcrr-引物

seqidno：14：pd-l2的實(shí)時(shí)pcrf-引物

seqidno：15：pd-l2的實(shí)時(shí)pcrr-引物

seqidno：16：gapdh的實(shí)時(shí)pcrf-引物

seqidno：17：gapdh的實(shí)時(shí)pcrr-引物

seqidno：18：針對(duì)tcrα的sirna

seqidno：19：針對(duì)tcrβ的sirna

<110>mieuniversity

takarabioinc.

<120>用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法

<130>669642

<150>jp2009-053536

<151>2009-03-06

<160>19

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>25

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>對(duì)pd-l1特異的sirna

<400>1

aaugcguucagcaaaugccaguagg25

<210>2

<211>25

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>對(duì)pd-l2特異的sirna

<400>2

aaaugaaagcaaugaugcaggaggg25

<210>3

<211>25

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>對(duì)pd-1特異的sirna

<400>3

uuacgucuccuccaaauguguauca25

<210>4

<211>657

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>sirna簇pdl1-pdl2-tcrα-tcrβ

<400>4

atcgggcccagatcttatttcaaatttagcaggaaaaaagagaacatcaccttgtaaaac60

tgaagattgtgaccagtcagaataatgtcgactacaagcgaattactcatgctacagtca120

agatgagtaattcgcttgtagtcgcattatggtgacagctgcctcgggaagccaagttgg180

gctttaaagtgcagggcctgctgatgttgagtgctttttgttcggacagtaccaatgcat240

aaactgtgctctgagaagcttatgcattggtactgtcccataagaagttatgtattcatc300

caataattcaagccaagcaagtatataggtgttttaatagtttttgtttgcagtcctctg360

ttgtaaggattctgatgtgtacacagggaagcgagtctgtacacatcagaatccttactg420

gtggcctgctatttccttcaaatgaatgatttttactaattttgtgtacttttattgtgt480

cgatgtagaatctgcctggtctatctgatgtgacagcttctgtagcacccaccatcctct540

atgagattagtgctcctggttgatctcatagaggatggtggtactgctagctgtagaact600

ccagcttcggcctgtcgcccaatcaaactgtcctgttactggcggccgcatcgattc657

<210>5

<211>351

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>sirna簇pdl1-pdl2

<400>5

atcgggcccagatcttatttcaaatttagcaggaaaaaagagaacatcaccttgtaaaac60

tgaagattgtgaccagtcagaataatgtcgactacaagcgaattactcatgctacagtca120

agatgagtaattcgcttgtagtcgcattatggtgacagctgcctcgggaagccaagttgg180

gctttaaagtgcagggcctgctgatgttgagtgctttttgttcggacagtaccaatgcat240

aaactgtgctctgagaagcttatgcattggtactgtcccataagaagttatgtattcatc300

caataattcaagccaagcaagtatataggtgttttaatagcggccgctccc351

<210>6

<211>200

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>sirna簇pdl1

<400>6

atcgggcccagatcttatttcaaatttagcaggaaaaaagagaacatcaccttgtaaaac60

tgaagattgtgaccagtcagaataatgtcgactacaagcgaattactcatgctacagtca120

agatgagtaattcgcttgtagtcgcattatggtgacagctgcctcgggaagccaagttgg180

gctttaaagcggccgcatat200

<210>7

<211>203

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>sirna簇pdl2

<400>7

atcgggcccagatcttatttcaaatttagcaggaaaaaagagaacatcaccttgtaaaac60

tgaagattgtgaccagtcagaataatgtggacagtaccaatgcataaactgtgctctgag120

aagcttatgcattggtactgtcccattatggtgacagctgcctcgggaagccaagttggg180

ctttaaagcggccgcatcgattc203

<210>8

<211>19

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>針對(duì)pd-l1的sirna(sh831)

<400>8

cuaauugucuauugggaaa19

<210>9

<211>19

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>針對(duì)pd-l1的sirna(sh832)

<400>9

cgacuacaagcgaauuacu19

<210>10

<211>19

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>針對(duì)pd-l2的sirna(sh833)

<400>10

ggacgaaggacaguaccaa19

<210>11

<211>19

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>針對(duì)pd-l2的sirna(sh834)

<400>11

ggacaguaccaaugcauaa19

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pd-l1的實(shí)時(shí)pcrf-引物

<400>12

tatggtggtgccgactacaa20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pd-l1的實(shí)時(shí)pcrr-引物

<400>13

tgcttgtccagatgacttcg20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pd-l2的實(shí)時(shí)pcrf-引物

<400>14

gggacgaaggacactaccaa20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pd-l2的實(shí)時(shí)pcrr-引物

<400>15

tttggccaggatacttctgc20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>gapdh的實(shí)時(shí)pcrf-引物

<400>16

gagtcaacggatttggtcgt20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>gapdh的實(shí)時(shí)pcrr-引物

<400>17

gatctcgctcctggaagatg20

<210>18

<211>19

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>針對(duì)tcrα的sirna

<400>18

guaaggauucugaugugua19

<210>19

<211>19

<212>rna

<213>人工的

<220>

<223>針對(duì)tcrβ的sirna

<400>19

ccaccauccucuaugagau19