本發(fā)明屬于免疫治療領(lǐng)域，涉及cik細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種提高cik細(xì)胞培養(yǎng)效果的血液抗凝和保存方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞過繼免疫治療是腫瘤生物治療的重要方法之一，在多種免疫活性因子的作用下，通過體外培養(yǎng)可以消除腫瘤患者體內(nèi)的免疫抑制因素，有效活化和擴(kuò)增免疫活性細(xì)胞，回輸體內(nèi)后可直接殺傷或誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。過繼免疫治療有很多優(yōu)越性，其免疫細(xì)胞在體外處理，可繞過體內(nèi)免疫障礙的種種機(jī)制，從而選擇性地激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答。另外，在體外培養(yǎng)條件下，對(duì)腫瘤抗原耐受的免疫細(xì)胞可被逆轉(zhuǎn)。目前，基因工程可大量克隆不同細(xì)胞因子及抗原多肽，使體外活化擴(kuò)展大量抗腫瘤免疫細(xì)胞更為方便，避免一些制劑體內(nèi)大量應(yīng)用帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)。因此，過繼免疫治療成為近年來腫瘤免疫治療中的熱點(diǎn)，為晚期患者開辟了新的治療途徑。但作為一種新的治療手段，治療方案及標(biāo)準(zhǔn)尚待進(jìn)一步規(guī)范和統(tǒng)一，應(yīng)用時(shí)機(jī)及途徑等問題尚需進(jìn)一步探討。常用于細(xì)胞免疫治療的細(xì)胞包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dc)、自然殺傷(nk)細(xì)胞等。其中，cik細(xì)胞是一種經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性的nk樣t細(xì)胞，其克服了淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lak)、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(til)等細(xì)胞增殖能力差、對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性低的缺點(diǎn)，能滿足臨床治療的要求。cik細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單，將單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)，有序地添加ifn-γ、抗cd3單克隆抗體、il-1α、il-2進(jìn)行誘導(dǎo)，2～3周以后即可收獲大量具有強(qiáng)細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞。此外，在培養(yǎng)過程中添加其他外源刺激因子，如il-15、il-21、cd137單抗、抗胸腺細(xì)胞球蛋白等，可以增強(qiáng)cik細(xì)胞的擴(kuò)增能力或?qū)δ[瘤的細(xì)胞毒性。單個(gè)核細(xì)胞通常取自自體外周血。雖然研究表明，采血后24h內(nèi)均可收集單個(gè)核細(xì)胞用于cik細(xì)胞培養(yǎng)，但保存時(shí)間越長(zhǎng)，增殖效率越差，超過8h，將會(huì)影響cik細(xì)胞培養(yǎng)16d之后的增殖效率(王宇環(huán)等，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016年第3期)。但是，臨床上，由于人力和設(shè)備緊張，尤其在突發(fā)狀況下，常常不能保證在采血后的8小時(shí)內(nèi)完成單個(gè)核細(xì)胞的收集和培養(yǎng)，一定程度上降低了cik細(xì)胞的培養(yǎng)效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高cik細(xì)胞培養(yǎng)效果的血液抗凝和保存方法，以保證采血后24h內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞收集和cik細(xì)胞培養(yǎng)不會(huì)造成cik細(xì)胞增殖效率明顯降低，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)和醫(yī)務(wù)工作者留有足夠的彈性時(shí)間。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：提高cik細(xì)胞培養(yǎng)效果的血液抗凝和保存方法，收集新鮮外周血加入含有抗凝劑的采血容器中，封口后于4-30℃保存，將外周血加入含有抗凝劑的采血容器后，用添加氬氣的混合空氣將采血容器中的剩余空氣置換后再封口；混合空氣中，空氣與氬氣的體積比為100:4-8。優(yōu)選地，保存期間，每1-3小時(shí)輕輕將采血容器往復(fù)顛倒1次，操作后采血容器的狀態(tài)恢復(fù)至初始狀態(tài)。優(yōu)選地，所述采血容器的容積不小于外周血和抗凝劑總體積的1.5倍。優(yōu)選地，采血容器的容積與外周血和抗凝劑總體積的最小倍數(shù)p取決于封口后保存時(shí)間t，二者滿足如下公式：p＝k×(t-8)+1.5其中，系數(shù)k取值6.25×10-2；t的取值范圍為8≤t≤24，單位為小時(shí)。優(yōu)選地，所述抗凝劑為肝素鈉或枸櫞酸鈉。優(yōu)選地，所述采血容器為采血管或采血袋。優(yōu)選地，保存溫度優(yōu)選4℃。氬氣在血液保存以提高cik細(xì)胞培養(yǎng)效果方面的應(yīng)用。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的血液抗凝和保存方法可以保證采血后24h內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞收集和cik細(xì)胞培養(yǎng)不會(huì)造成cik細(xì)胞增殖效率無明顯降低，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)和醫(yī)務(wù)工作者留有足夠彈性時(shí)間。附圖說明圖1為各組cik細(xì)胞培養(yǎng)16天相對(duì)于初始細(xì)胞數(shù)的增殖倍數(shù)；圖2為各組cik細(xì)胞培養(yǎng)8天ifn-γ分泌總量比較。具體實(shí)施方式下面就結(jié)合實(shí)施例具體介紹本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實(shí)驗(yàn)過程的描述無法做到非常詳細(xì)，凡是實(shí)驗(yàn)中未詳細(xì)描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。未特別強(qiáng)調(diào)的操作均在常溫常壓下實(shí)施。一、實(shí)驗(yàn)材料提供外周血的健康志愿者經(jīng)傳染病檢測(cè)及血常規(guī)和凝血功能檢測(cè)正常。aim-v型淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，gibco；il-2、il-1α和ifn-γ，上海江萊生物科技有限公司；抗cd3mab，上海研卉生物科技有限公司，人ifn-γelisa試劑盒，上海喬羽生物科技有限公司。肝素鈉采用中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司生產(chǎn)的干份肝素鈉。取40mg用100ml去離子水溶解。取干凈采血管(10ml)若干，每管加入肝素鈉溶液1ml即可抗凝至少5ml血液。添加氬氣的混合空氣制備：將空氣與氬氣按體積比100:6混合，備用。二、實(shí)驗(yàn)方法1、分組及血液樣本采集新鮮對(duì)照組(1個(gè)采血管)：0小時(shí)；常規(guī)保存組(3個(gè)采血管)：8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)；氬氣保存組(3個(gè)采血管)：8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)。常規(guī)無菌抽取新鮮外周血，取靜脈血5ml加入含肝素鈉的采血管內(nèi)，新鮮對(duì)照組緊接著就開始分離單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，常規(guī)保存組和氬氣保存組分別保存8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)(保存溫度4℃)后取1個(gè)采血管中進(jìn)行分離和培養(yǎng)。其中，氬氣保存組采血結(jié)束后用制備好的添加氬氣的混合空氣將采血容器中的剩余空氣置換后再封口。置換方法為：將制備好的混合氣體以30-50ml/min的流速向采血管內(nèi)吹30s，記住將氣流管出口靠近血液液面。保存期間，每2小時(shí)輕輕將采血容器往復(fù)顛倒1次，操作后采血容器的狀態(tài)恢復(fù)至初始狀態(tài)。2、cik的分離和培養(yǎng)外周血經(jīng)ficoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心分離pbmc，接種于t25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用aim-v淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度為4×106/ml。第0天加入1000iu/mlifn-γ，37℃、5％co2孵箱中，飽和濕度條件下培養(yǎng)24h后，加入40ng/ml抗cd3mab、2ng/mlil-1α，以后每2-3d補(bǔ)充1200iu/mlil-2的aim-v無血清培養(yǎng)基，控制細(xì)胞數(shù)在(1.2-1.6)×106/ml。3、cik細(xì)胞增殖倍數(shù)測(cè)定分別在培養(yǎng)的第0、4、8、12、16天，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總量和增殖倍數(shù)。4、cik細(xì)胞分泌ifn-γ總量測(cè)定在培養(yǎng)第8天，取細(xì)胞上清液0.5ml用elisa試劑盒檢測(cè)ifn-γ濃度，并計(jì)算總量。5、統(tǒng)計(jì)分析采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)算數(shù)據(jù)以均值±方差表示，組間比較采用多樣本重復(fù)測(cè)量的方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果常規(guī)保存組、氬氣保存組觀察結(jié)果與新鮮對(duì)照組基本一致，無明顯差別。剛分離出來的cik細(xì)胞呈單個(gè)分布，體積較小并呈圓形，立體感和折光性弱；培養(yǎng)24h后，細(xì)胞均勻分散，擴(kuò)增不明顯，集落小，表面光滑；3d后，集落增多，體積變大，細(xì)胞擴(kuò)增明顯；5d后，集落進(jìn)一步增多變大，立體感變強(qiáng)，細(xì)胞增大且折光性變強(qiáng)；7d后，集落布滿瓶底；10d后，細(xì)胞集落成圓餅形，中間厚，四周薄，立體感強(qiáng)；12d后，集落變大增多，形狀不規(guī)則，單個(gè)細(xì)胞也明顯增多，密集沉積底部，稍微搖動(dòng)即均勻分布在懸液中。2、各組cik細(xì)胞體外增殖效率比較圖1和下表為各組cik細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間后相對(duì)于初始細(xì)胞數(shù)的增殖倍數(shù)。培養(yǎng)4天培養(yǎng)8天培養(yǎng)12天培養(yǎng)16天新鮮對(duì)照組1.93.616.434.8常規(guī)保存組-保存8小時(shí)2.13.514.119.4常規(guī)保存組-保存16小時(shí)1.83.512.817.7常規(guī)保存組-保存24小時(shí)2.13.213.315.4氬氣保存組-保存8小時(shí)1.63.417.535.3氬氣保存組-保存16小時(shí)1.83.616.834.1氬氣保存組-保存24小時(shí)1.83.417.134.3從圖1和上表可以看出，常規(guī)保存8、16和24小時(shí)后的外周血所培養(yǎng)出的cik細(xì)胞增殖能力有明顯降低(培養(yǎng)12天后尤其是16天降低顯著，12天之前與新鮮對(duì)照組無顯著差異)。使用本發(fā)明抗凝和保存方法保存8、16和24小時(shí)后的外周血所培養(yǎng)出的cik細(xì)胞增殖能力未見明顯降低，培養(yǎng)16天內(nèi)的增殖倍數(shù)與新鮮對(duì)照組無顯著差異。該結(jié)果證明，本發(fā)明提供的抗凝和保存方法能夠于24小時(shí)內(nèi)有效維持外周血分離培養(yǎng)cik細(xì)胞的效果，有效維持培養(yǎng)過程中cik細(xì)胞的增殖能力。3、各組cik細(xì)胞ifn-γ分泌量比較圖2和下表為各組cik細(xì)胞培養(yǎng)8天后，細(xì)胞上清液中ifn-γ總量(μg)的比較。從圖2和上表可以看出，氬氣保存組在保存8、16、24小時(shí)內(nèi)，ifn-γ總量與新鮮對(duì)照組無明顯下降，差異不顯著；常規(guī)保存組在保存8、16小時(shí)內(nèi)，ifn-γ總量與新鮮對(duì)照組無明顯下降，差異不顯著，但是，保存24小時(shí)后，ifn-γ總量比新鮮對(duì)照組降低33.8％，下降顯著。已知常規(guī)保存組和氬氣保存組保存8、16、24小時(shí)內(nèi)不影響cik細(xì)胞8天內(nèi)的增殖效率，細(xì)胞總量無明顯差異，如果ifn-γ總量下降明顯，就證明cik細(xì)胞分泌ifn-γ的能力下降。而本發(fā)明方法在保存8、16、24小時(shí)內(nèi)，ifn-γ總量與新鮮對(duì)照組無明顯下降，證明本發(fā)明提供的抗凝和保存方法能夠于24小時(shí)內(nèi)有效維持cik細(xì)胞分泌ifn-γ的能力。本發(fā)明采血容器的容積優(yōu)選不小于外周血和抗凝劑總體積的1.5倍。采血容器的容積與外周血和抗凝劑總體積的最小倍數(shù)p取決于封口后保存時(shí)間t，可以按如下公式推算：p＝k×(t-8)+1.5其中，系數(shù)k取值6.25×10-2；t的取值范圍為8≤t≤24，單位為小時(shí)。本發(fā)明中，抗凝劑也可以使用枸櫞酸鈉；根據(jù)取血量，采血容器也可以使用采血袋。保存溫度優(yōu)選4℃，4-30℃范圍內(nèi)保存也可以；混合空氣中，空氣與氬氣的體積比為100:4-8。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明提供的抗凝和保存方法能夠于24小時(shí)內(nèi)有效維持外周血分離培養(yǎng)cik細(xì)胞的效果，有效維持培養(yǎng)過程中cik細(xì)胞的增殖能力和分泌ifn-γ的能力，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)和醫(yī)務(wù)工作者留有足夠彈性時(shí)間。上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明實(shí)質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，不應(yīng)將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于上述具體的實(shí)施例。當(dāng)前第1頁12