本發(fā)明屬于細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：人體的粘膜是指口腔、鼻腔、腸管、陰道、腸道等與外界相通的體腔內(nèi)襯，是人體吸收、消化和交換營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所,具有防御、消化、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌等功能，構(gòu)成機體抵抗創(chuàng)傷和病原體入侵的第一道免疫屏障，一旦受損就會引起相應(yīng)的功能障礙，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致死亡。鼻粘膜是呼吸道粘膜的第一道防線，是空氣調(diào)節(jié)和粘液纖毛清除、濾過作用的基礎(chǔ)。手術(shù)或其他損傷導(dǎo)致的鼻粘膜漸進性的功能衰退所導(dǎo)致的空鼻綜合癥(emptynosesyndrome，ens)，就是由于鼻粘膜功能障礙，吸入鼻腔的氣體未經(jīng)過加溫，加濕等作用，直接進入肺部，使得氣流不能進行正常的氣體交換，肺泡通氣及換氣減少，不能維持正常肺容積，胸內(nèi)負(fù)壓降低，體循環(huán)和肺循環(huán)的動脈氧合的發(fā)生減少從而直接影響肺功能，造成呼吸困難、甚至窒息以及精神異常等復(fù)雜癥狀，影響正常的工作與生活。因此，對空鼻綜合癥患者的鼻粘膜進行修復(fù)十分重要。現(xiàn)有治療技術(shù)中一般采用一些鼻腔用凝膠或噴霧對受損的鼻粘膜處進行治療和修復(fù)，雖然可以在一定程度上緩解鼻粘膜受損的狀況，但效果有限，并不能很好地治療鼻粘膜受損的狀況，恢復(fù)鼻粘膜的相關(guān)功能，緩解空鼻綜合癥患者的癥狀。如果能采用鼻粘膜樣上皮細(xì)胞對患者鼻黏膜處進行修復(fù)，將能最大程度的修復(fù)患者鼻粘膜受損處以及恢復(fù)鼻粘膜的相關(guān)功能?，F(xiàn)有技術(shù)中也有一些對鼻粘膜干細(xì)胞進行分離培養(yǎng)技術(shù)，如cn201410228728.x公開了一種人類嗅粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，可以分離人類嗅粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞并進行培養(yǎng)，但該方法采用嗅粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞為原代細(xì)胞，存在嗅粘膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源少、采集時會對鼻粘膜產(chǎn)生損傷等問題，存在實際應(yīng)用上的諸多困難。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，所述方法包括：將自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加入細(xì)胞誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化得到鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基40-60g、所述胎牛血清4-6g、所述egf6-10μg、所述fgf10-20μg、所述氫化可的松溶液5-10ml、所述谷氨酰胺0.15-0.3g、所述青霉素1-2×105u、所述鏈霉素0.1-0.2g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松5-10mg。egf：表皮細(xì)胞生長因子，又名人寡肽-1，是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個氨基組成的活性多肽，能夠促進細(xì)胞的增殖分化，從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞。fgf：成纖維細(xì)胞生長因子，能夠促進內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖。本發(fā)明采用自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化成鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，用于鼻粘膜受損患者進行鼻粘膜下細(xì)胞移植，可以對受損的鼻粘膜進行有效修復(fù)，恢復(fù)鼻粘膜生理功能、增加鼻腔容積和鼻腔阻力，阻斷ens慢性功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展，有效緩解病人的不適癥狀。進一步的，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖1-3g、所述煙酰胺0.2-0.5g、所述胰島素0.05-0.1g。在細(xì)胞誘導(dǎo)液中加入阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，可以進一步提高脂肪干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞的分化效果。進一步的，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述羧甲基纖維素鈉0.5-1.5g、所述山梨酸鉀0.05-0.08g、所述甘氨酸0.02-0.06g。在細(xì)胞誘導(dǎo)液中加入羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸可以提高細(xì)胞誘導(dǎo)液防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制細(xì)菌滋生，保障細(xì)胞誘導(dǎo)液的使用安全，提高分化方法中誘導(dǎo)分化過程的安全性。進一步的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：在溫度為37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％、飽和濕度的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12-16天。進一步的，所述方法還包括：對自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化之前還包括分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞。進一步的，所述分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞包括：無菌收集含有間充質(zhì)干細(xì)胞的自體組織，用pbs緩沖液沖洗1-3min，再用眼科剪剪成1-2mm3大小的組織碎塊，將組織碎塊加入組織分解液中，水浴震蕩，37℃、220r/min振蕩30-45min，觀察到脂肪逐漸變?yōu)槿槊訝詈笾萌腚x心機，2000r/min離心5min，棄上層清液，即可獲得自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選的，所述組織分解液為含1％膠原酶i型的pbs緩沖。進一步的，所述培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞包括：加入適量pbs緩沖液重懸分離后的自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，吹打后接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，4h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔3-4d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長達(dá)到80％融合時加入細(xì)胞消化液將貼壁細(xì)胞消化分離3-5min，按1：3比例進行傳代接種，每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到融合時再次傳代，將傳至第三代的間充質(zhì)干細(xì)胞收集，融于0.9％的氯化鈉溶液中去，呈懸濁液，保存于4℃環(huán)境中；所述細(xì)胞培養(yǎng)液主要是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、d-木糖、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基30-50g、所述胎牛血清1-5g、所述d-木糖0.5-1g、所述青霉素1-2×105u、所述鏈霉素0.1-0.3g。優(yōu)選的，所述細(xì)胞消化液為含0.25％胰酶的pbs緩沖液。進一步的，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有甲殼糖、微晶纖維素和琥珀酸鈉，每l所述注射用水溶解所述甲殼糖2-5g、所述微晶纖維素1-2g、所述琥珀酸鈉0.3-0.8g。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甲殼糖、微晶纖維素和琥珀酸鈉可以進一步提高脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)增殖速度，減少或改變其中任何一個成分，提高培養(yǎng)擴增速度的效果變差。進一步的，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有酒石酸鉀鈉和甲酸鈣，每l所述注射用水溶解所述酒石酸鉀鈉1-2g、所述甲酸鈣0.2-0.8g。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入酒石酸鉀鈉和甲酸鈣可以提高細(xì)胞培養(yǎng)液防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制細(xì)菌滋生，保障細(xì)胞培養(yǎng)液的使用安全，提高分化方法中培養(yǎng)擴增過程的安全性。本發(fā)明還提供一種用于自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化的試劑盒，包括盒體和位于盒體內(nèi)部的若干試劑瓶，若干所述試劑瓶內(nèi)分別盛裝有組織分解液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液和細(xì)胞誘導(dǎo)液，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基40-60g、所述胎牛血清4-6g、所述egf6-10μg、所述fgf10-20μg、所述氫化可的松溶液5-10ml、所述谷氨酰胺0.15-0.3g、所述青霉素1-2×105u、所屬鏈霉素0.1-0.2g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松5-10mg。進一步的，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖1-3g、所述煙酰胺0.2-0.5g、所述胰島素0.05-0.1g。進一步的，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述羧甲基纖維素鈉0.5-1.5g、所述山梨酸鉀0.05-0.08g、所述甘氨酸0.02-0.06g。進一步的，所述細(xì)胞培養(yǎng)液主要是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、d-木糖、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基30-50g、所述胎牛血清1-5g、所述d-木糖0.5-1g、所述青霉素1-2×105u、所述鏈霉素0.1-0.3g。進一步的，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有甲殼糖、微晶纖維素和琥珀酸鈉，每l所述注射用水溶解所述甲殼糖2-5g、所述微晶纖維素1-2g、所述琥珀酸鈉0.3-0.8g。進一步的，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有酒石酸鉀鈉和甲酸鈣，每l所述注射用水溶解所述酒石酸鉀鈉1-2g、所述甲酸鈣0.2-0.8g。進一步的，所述組織分解液為含1％膠原酶i型的pbs緩沖。進一步的，所述細(xì)胞消化液為含0.25％胰酶的pbs緩沖液。本發(fā)明采用自體來源豐富的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞或其他干細(xì)胞經(jīng)過分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化等步驟得到數(shù)量充足的鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，用于鼻粘膜受損患者進行鼻粘膜下細(xì)胞移植，可以對受損的鼻粘膜進行有效修復(fù)，恢復(fù)鼻粘膜生理功能、增加鼻腔容積和鼻腔阻力，阻斷ens慢性功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展，有效緩解病人的不適癥狀；而用于移植的細(xì)胞來源于患者自身組織，具有取材容易、安全可靠、避免免疫反應(yīng)等優(yōu)點。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例3誘導(dǎo)分化前的細(xì)胞形態(tài)圖；圖2為本發(fā)明實施例3誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)圖。具體實施方式實施例1一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，所述方法包括：將自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加入細(xì)胞誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化得到鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基40g、所述胎牛血清4g、所述egf6μg、所述fgf10μg、所述氫化可的松溶液5ml、所述谷氨酰胺0.15g、所述青霉素1×105u、所述鏈霉素0.1g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松5mg。實施例2一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，所述方法包括：將自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加入細(xì)胞誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化得到鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基60g、所述胎牛血清6g、所述egf10μg、所述fgf20μg、所述氫化可的松溶液10ml、所述谷氨酰胺0.3g、所述青霉素2×105u、所述鏈霉素0.2g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松10mg。實施例3一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，所述方法包括：將自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加入細(xì)胞誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化得到鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基50g、所述胎牛血清5g、所述egf8μg、所述fgf15μg、所述氫化可的松溶液8ml、所述谷氨酰胺0.2g、所述青霉素1.5×105u、所述鏈霉素0.15g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松8mg。實施例4一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例1不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖1g、所述煙酰胺0.2g、所述胰島素0.05g。實施例5一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例2不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖3g、所述煙酰胺0.5g、所述胰島素0.1g。實施例6一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖2g、所述煙酰胺0.3g、所述胰島素0.08g。實施例7一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例1不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述羧甲基纖維素鈉0.5g、所述山梨酸鉀0.05g、所述甘氨酸0.02g。實施例8一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例5不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述羧甲基纖維素鈉1.5g、所述山梨酸鉀0.08g、所述甘氨酸0.06g。實施例9一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述羧甲基纖維素鈉1g、所述山梨酸鉀0.06g、所述甘氨酸0.04g。實施例10一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例8不同的是：所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：在溫度為37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％、飽和濕度的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12天。實施例11一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：在溫度為37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％、飽和濕度的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)14天。實施例12一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例10不同的是，所述方法還包括：對自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化之前還包括分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞，所述分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞包括：無菌收集含有間充質(zhì)干細(xì)胞的自體組織，用pbs緩沖液沖洗1min，再用眼科剪剪成1mm3大小的組織碎塊，將組織碎塊加入組織分解液中，水浴震蕩，37℃、220r/min振蕩30min，觀察到脂肪逐漸變?yōu)槿槊訝詈笾萌腚x心機，2000r/min離心5min，棄上層清液，即可獲得自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。實施例13一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是，所述方法還包括：對自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化之前還包括分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞，所述分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞包括：無菌收集含有間充質(zhì)干細(xì)胞的自體組織，用pbs緩沖液沖洗2min，再用眼科剪剪成1.5mm3大小的組織碎塊，將組織碎塊加入組織分解液中，水浴震蕩，37℃、220r/min振蕩40min，觀察到脂肪逐漸變?yōu)槿槊訝詈笾萌腚x心機，2000r/min離心5min，棄上層清液，即可獲得自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。實施例14一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例12不同的是：所述培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞包括：加入適量pbs緩沖液重懸分離后的自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，吹打后接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，4h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔3d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長達(dá)到80％融合時加入細(xì)胞消化液將貼壁細(xì)胞消化分離3min，按1：3比例進行傳代接種，每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到融合時再次傳代，將傳至第三代的間充質(zhì)干細(xì)胞收集，融于0.9％的氯化鈉溶液中去，呈懸濁液，保存于4℃環(huán)境中；所述細(xì)胞培養(yǎng)液主要是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、d-木糖、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基30g、所述胎牛血清1g、所述d-木糖0.5g、所述青霉素1×105u、所述鏈霉素0.1g。實施例15一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是，所述方法還包括：對自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化之前還包括分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞包括：加入適量pbs緩沖液重懸分離后的自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，吹打后接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，4h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔3.5d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長達(dá)到80％融合時加入細(xì)胞消化液將貼壁細(xì)胞消化分離4min，按1：3比例進行傳代接種，每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到融合時再次傳代，將傳至第三代的間充質(zhì)干細(xì)胞收集，融于0.9％的氯化鈉溶液中去，呈懸濁液，保存于4℃環(huán)境中；所述細(xì)胞培養(yǎng)液主要是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、d-木糖、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基40g、所述胎牛血清3g、所述d-木糖0.8g、所述青霉素1.5×105u、所述鏈霉素0.2g。實施例16一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例14不同的是：所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有甲殼糖、微晶纖維素和琥珀酸鈉，每l所述注射用水溶解所述甲殼糖2g、所述微晶纖維素1g、所述琥珀酸鈉0.3g。實施例17一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例15不同的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有甲殼糖、微晶纖維素和琥珀酸鈉，每l所述注射用水溶解所述甲殼糖3g、所述微晶纖維素1.5g、所述琥珀酸鈉0.5g。實施例18一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例14不同的是：所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有酒石酸鉀鈉和甲酸鈣，每l所述注射用水溶解所述酒石酸鉀鈉2g、所述甲酸鈣0.8g。實施例19一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例15不同的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有酒石酸鉀鈉和甲酸鈣，每l所述注射用水溶解所述酒石酸鉀鈉1.5g、所述甲酸鈣0.5g。實施例20一種用于自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化的試劑盒，包括盒體和位于盒體內(nèi)部的若干試劑瓶，若干所述試劑瓶內(nèi)分別盛裝有組織分解液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液和細(xì)胞誘導(dǎo)液，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基40g、所述胎牛血清4g、所述egf6μg、所述fgf10μg、所述氫化可的松溶液5ml、所述谷氨酰胺0.15g、所述青霉素1×105u、所屬鏈霉素0.1g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松5mg。實施例21一種用于自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化的試劑盒，與實施例20不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺、胰島素、羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖2g、所述煙酰胺0.3g、所述胰島素0.08g、所述羧甲基纖維素鈉1g、所述山梨酸鉀0.06g、所述甘氨酸0.05g；所述細(xì)胞培養(yǎng)液是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、d-木糖、青霉素、鏈霉素、甲殼糖、微晶纖維素、琥珀酸鈉、酒石酸鉀鈉和甲酸鈣用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基40g、所述胎牛血清3g、所述d-木糖0.8g、所述青霉素1×105u、所述鏈霉素0.2g、所述甲殼糖3g、所述微晶纖維素1.5g、所述琥珀酸鈉0.5g、所述酒石酸鉀鈉1.5g、所述甲酸鈣0.5g；所述組織分解液為含1％膠原酶i型的pbs緩沖；所述細(xì)胞消化液為含0.25％胰酶的pbs緩沖液。對照例1一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，所述方法包括：將自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加入細(xì)胞誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化得到鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、氫化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基50g、所述胎牛血清5g、所述egf8μg、所述氫化可的松溶液8ml、所述谷氨酰胺0.2g、所述青霉素1.5×105u、所述鏈霉素0.15g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松8mg。對照例2一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，所述方法包括：將自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞加入細(xì)胞誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化得到鼻粘膜樣上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞誘導(dǎo)液主要是將dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、egf、fgf、氫化可的松溶液、天門冬酰胺、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述dmem干粉培養(yǎng)基50g、所述胎牛血清5g、所述egf8μg、所述fgf15μg、所述氫化可的松溶液8ml、所述天門冬酰胺0.2g、所述青霉素1.5×105u、所述鏈霉素0.15g；所述氫化可的松溶液是將氫化可的松用無水乙醇溶解而成，每l所述無水乙醇溶解所述氫化可的松8mg。對照例3一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有阿拉伯半乳聚糖和胰島素，每l所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖2g、所述胰島素0.08g。對照例4一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有葡聚糖、煙酰胺和胰島素，每l所述注射用水溶解所述葡聚糖2g、所述煙酰胺0.3g、所述胰島素0.08g。對照例5一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有山梨酸鉀和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述山梨酸鉀0.06g、所述甘氨酸0.04g。對照例6一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是：所述細(xì)胞誘導(dǎo)液還含有羧甲基纖維素鈉、苯甲酸鈉和甘氨酸，每l所述注射用水溶解所述羧甲基纖維素鈉1g、所述苯甲酸鈉0.06g、所述甘氨酸0.04g。對照例7一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是，所述方法還包括：對自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化之前還包括分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞包括：加入適量pbs緩沖液重懸分離后的自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，吹打后接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，4h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔3.5d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長達(dá)到80％融合時加入細(xì)胞消化液將貼壁細(xì)胞消化分離4min，按1：3比例進行傳代接種，每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到融合時再次傳代，將傳至第三代的間充質(zhì)干細(xì)胞收集，融于0.9％的氯化鈉溶液中去，呈懸濁液，保存于4℃環(huán)境中；所述細(xì)胞培養(yǎng)液主要是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基40g、所述胎牛血清3g、所述青霉素1.5×105u、所述鏈霉素0.2g。對照例8一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例3不同的是，所述方法還包括：對自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化之前還包括分離獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)擴增間充質(zhì)干細(xì)胞包括：加入適量pbs緩沖液重懸分離后的自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，吹打后接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2、飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，4h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔3.5d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長達(dá)到80％融合時加入細(xì)胞消化液將貼壁細(xì)胞消化分離4min，按1：3比例進行傳代接種，每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到融合時再次傳代，將傳至第三代的間充質(zhì)干細(xì)胞收集，融于0.9％的氯化鈉溶液中去，呈懸濁液，保存于4℃環(huán)境中；所述細(xì)胞培養(yǎng)液主要是將h-dmem干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、半乳糖、青霉素、鏈霉素用注射用水溶解而成，每l所述注射用水溶解所述h-dmem干粉培養(yǎng)基40g、所述胎牛血清3g、所述半乳糖0.8g、所述青霉素1.5×105u、所述鏈霉素0.2g。對照例9一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例15不同的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有微晶纖維素和琥珀酸鈉，每l所述注射用水溶解所述微晶纖維素1.5g、所述琥珀酸鈉0.5g。對照例10一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例15不同的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有甲殼糖、甲基纖維素和琥珀酸鈉，每l所述注射用水溶解所述甲殼糖3g、所述甲基纖維素1.5g、所述琥珀酸鈉0.5g。對照例11一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例15不同的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有酒石酸鉀鈉，每l所述注射用水溶解所述酒石酸鉀鈉1.5g。對照例12一種自體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化方法，與實施例15不同的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)液還含有酒石酸鉀鈉和丙酸鈉，每l所述注射用水溶解所述酒石酸鉀鈉1.5g、所述丙酸鈉0.5g。間充質(zhì)干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞分化效果評價1.細(xì)胞形態(tài)的變化采取脂肪組織，經(jīng)常規(guī)方法進行分離和培養(yǎng)后，取第三代脂肪干細(xì)胞采用實施例3的方法進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化的結(jié)果見圖1和圖2由圖1中誘導(dǎo)分化前的細(xì)胞形態(tài)和圖2中的誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)的對比可知：由成纖維樣或紡錘樣的脂肪干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化，逐漸發(fā)生鵝卵石樣、鋪路石樣細(xì)胞的改變，細(xì)胞呈多邊形單層生長，呈“鵝卵石樣”分布，形態(tài)與典型的鼻粘膜樣上皮細(xì)胞形態(tài)類似，說明采用本發(fā)明提供的誘導(dǎo)分化方法可使脂肪干細(xì)胞分化成鼻粘膜樣上皮細(xì)胞。2.不同分化方法的分化效果比較采取脂肪組織，經(jīng)常規(guī)方法進行分離和培養(yǎng)后，取第三代脂肪干細(xì)胞，分別采用實施例3、實施例6、對照例1-4的方法進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化結(jié)束以后檢測鼻粘膜上皮細(xì)胞特異性蛋白ck-7、ck-14、ck-19的陽性率，結(jié)果見表1。表1ck-7、ck-14、ck-19陽性率評價組別ck-7(％)ck-14(％)ck-19(％)實施例327.7±5.123.9±1.240.2±4.0實施例642.1±4.337.6±2.253.2±3.3對照例115.3±3.513.6±1.922.5±3.8對照例214.8±2.514.9±2.828.5±5.6對照例328.9±2.125.3±2.740.9±2.9對照例428.1±3.527.1±2.142.0±2.5由上述結(jié)果可知，采用實施例3的方法對脂肪干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化與對照例1和對照例2的方法對比，其鼻粘膜上皮細(xì)胞特異性蛋白ck-7、ck-14、ck-19的陽性率均明顯較高，說明采用本發(fā)明提供的分化方法可使脂肪干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞的分化效果更好。采用實施例6的方法對脂肪干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化后其鼻粘膜上皮細(xì)胞特異性蛋白ck-7、ck-14、ck-19的陽性率明顯高于實施例3、對照例3、對照例4的方法，說明在分化方法所用細(xì)胞誘導(dǎo)液中加入阿拉伯半乳聚糖、煙酰胺和胰島素，可以進一步提高脂肪干細(xì)胞向鼻粘膜樣上皮細(xì)胞的分化效果。分化方法安全性評價1.誘導(dǎo)分化過程的安全性評價取實施例3、實施例9、對照例5、對照例6的分化方法中所使用的細(xì)胞誘導(dǎo)液，均在溫度為25℃±2℃，相對濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個月，檢測細(xì)胞誘導(dǎo)液中的細(xì)菌總數(shù)。表2細(xì)胞誘導(dǎo)液中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計實施例3實施例9對照例5對照例6細(xì)菌總數(shù)(cfu/ml)87997543428由上述結(jié)果可知，在細(xì)胞誘導(dǎo)液中加入羧甲基纖維素鈉、山梨酸鉀和甘氨酸可以提高細(xì)胞誘導(dǎo)液防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制細(xì)菌滋生，保障細(xì)胞誘導(dǎo)液的使用安全，提高分化方法中誘導(dǎo)分化過程的安全性。2.培養(yǎng)擴增過程的安全性評價取實施例15、實施例19、對照例11、對照例12的分化方法中所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液，均在溫度為25℃±2℃，相對濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個月，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)菌總數(shù)。表3細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計實施例15實施例19對照例11對照例12細(xì)菌總數(shù)(cfu/ml)79181574605由上述結(jié)果可知，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入酒石酸鉀鈉和甲酸鈣可以提高細(xì)胞培養(yǎng)液防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制細(xì)菌滋生，保障細(xì)胞培養(yǎng)液的使用安全，提高分化方法中培養(yǎng)擴增過程的安全性。培養(yǎng)擴增效果評價采取脂肪組織，按照實施例15、實施例17、對照例7-10的分化方法進行脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，采用臺盼藍(lán)經(jīng)典染色法對細(xì)胞進行計數(shù)，分別統(tǒng)計原代和第3代活脂肪干細(xì)胞的數(shù)量，計算脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)擴增倍數(shù)，結(jié)果見表4。表4脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)擴增效果評價組別實施例15實施例17對照例7對照例8對照例9對照例10培養(yǎng)擴增倍數(shù)3278514971343385由上述結(jié)果可以得出，采用本發(fā)明提供的分化方法培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞的擴增效果明顯優(yōu)于對照例7和對照例8的分化方法，說明本發(fā)明提供的分化方法中的培養(yǎng)擴增過程有利于提高脂肪干細(xì)胞的增殖速度。采用實施例17提供的分化方法培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞的擴增效果明顯優(yōu)于實施例15、對照例9和對照例10的分化方法，說明在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甲殼糖、微晶纖維素和琥珀酸鈉可以進一步提高細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的增殖速度，減少或改變其中任何一個成分，提高培養(yǎng)擴增速度的效果變差。最后應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁12