本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一株脫氮副球菌的分離鑒定、培養(yǎng)方法及其在畜禽養(yǎng)殖場廢水處理中的應用。
背景技術：
：隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展，集約化畜禽養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，生產(chǎn)效率提高，經(jīng)濟效益增加，但同時大量畜禽排泄物和廢水的產(chǎn)生，造成畜禽業(yè)發(fā)展與環(huán)境污染之間的矛盾日益凸顯，糞尿廢水過度集中給生態(tài)環(huán)境帶來了極大的壓力。畜禽養(yǎng)殖業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的主導產(chǎn)業(yè)之一，而畜禽養(yǎng)殖污染則成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要原因之一。大量的畜禽養(yǎng)殖廢水成為污染源，如得不到及時處理，必將對環(huán)境造成極大危害，導致生態(tài)環(huán)境惡化，畜禽產(chǎn)品品質(zhì)下降并危及人體健康，養(yǎng)殖廢水治理技術的滯后也將嚴重制約養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。集約化養(yǎng)殖廢水主要來源于動物的排泄物及沖洗用水，具有較高濃度的氨氮和有機物，化學需氧量高，臭味大。有研究表明，豬場廢水中氨氮濃度高達800—2000mg/l，化學需氧量高達5000—20000mg/l。廢水若未得到有效處理直接排入水體容易造成水體富營養(yǎng)化和地下水污染。目前，對這類廢水的處理主要包括物化、生化和自然生態(tài)等，其中生物脫氮工藝簡單，成本低，對環(huán)境負荷小，脫氮更徹底。脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)是異養(yǎng)硝化、好氧反硝化菌菌種之一，能直接把氨態(tài)氮轉化為最終氣態(tài)產(chǎn)物逸出，使同時硝化反硝化生物脫氮技術成為可能。與傳統(tǒng)的自養(yǎng)硝化細菌相比較，異養(yǎng)硝化細菌生長速率快、作用速率高。畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用抗生素來預防和治療動物疾病，但這些抗生素只有很少一部分被動物機體利用，絕大部分通過尿液和糞便排出體外，養(yǎng)殖廢水是抗生素污染的重要來源，環(huán)境中抗生素富集會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成威脅。對抗生素污染的處理方法主要有非生物降解和生物降解2種，微生物降解是生物降解的方式之一。探尋新的抗生素降解微生物菌株可以為未來微生物資源和技術處理環(huán)境中抗生素類污染物提供參考。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有養(yǎng)殖廢水處理技術的不足，提供了一株脫氮副球菌，該菌株在去除氨氮的同時能夠去除養(yǎng)殖廢水中的氟喹諾酮類抗生素。所述的脫氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，分類命名：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1，保藏編號為cctccno：m2017238地址：中國武漢武漢大學。本發(fā)明的另一個目的在于提供了脫氮副球菌tdfq-1的制備方法，方法簡單，發(fā)酵液中有效菌濃度高，適應于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明還有一個目的在于提供了脫氮副球菌tdfq-1的應用，本發(fā)明提供的脫氮副球菌可用于同時去除水中的氨氮及氟喹諾酮類抗生素，特別適用于養(yǎng)殖廢水的處理。為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的獲得：申請人自湖北隨州豬廠污水中，篩選高效的異養(yǎng)硝化細菌，通過大量篩選，生理生化及16s鑒定，最終篩選獲得一株脫氮副球菌菌株，所述的脫氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，分類命名：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1，保藏編號為cctccno：m2017238地址：中國武漢武漢大學。脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的生物學特性如下所述：該菌株在有機和無機培養(yǎng)基中均能生長，在營養(yǎng)瓊脂(na)培養(yǎng)基上繁殖生長形成圓形菌落，菌落大小1-2mm，表面光滑濕潤。該菌鏡檢為革蘭氏陰性，單個、成對或成堆，對數(shù)生長期為球形或近球形，平均大小為1.1×1.3um，靜止期菌體為球形，直徑1um。不水解明膠、淀粉；不利用d-阿拉伯糖、精氨酸；可利用蔗糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇為唯一碳源生長；銨鹽和硝酸鹽都能作為氮源；能用氧或硝酸鹽作為電子受體，硝酸鹽被還原成氧化亞氮和分子態(tài)氮。最適溫度30℃，溫度范圍5-37℃。將其16srrna基因測序，結果在ncbi進行blastn比對，發(fā)現(xiàn)其16srrna與脫氮副球菌(nr114145.1)的序列同源性最高，相似性為99％。脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的制備方法，包括：將脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1種子液按1-10％(v/v)接種量接種于50l發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為30-35l，控制攪拌轉速維持溶氧在15％-18％，28-32℃培養(yǎng)18-22h收集發(fā)酵液。所述的發(fā)酵罐，其灌裝的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括：蛋白胨5g，酵母膏5g，nacl2g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，feso40.03g，mnso40.01g，cacl20.2g，甘油6.0g，加水定容至1l，調(diào)節(jié)ph7.5。以上所述的方案中，優(yōu)選的，接種量為3％，發(fā)酵罐的裝液量為35l，溶氧為16％，培養(yǎng)溫度為30℃。脫氮副球菌tdfq-1的應用，包括利用本發(fā)明的脫氮副球菌tdfq-1用于處理畜禽廢水，或是用于同時處理含有高氨氮和抗生素的污水。所述的抗生素優(yōu)選諾氟沙星、環(huán)丙沙星或恩諾沙星。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：本發(fā)明提供的脫氮副球菌tdfq-1具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用，在有機和無機培養(yǎng)基中均能生長，異養(yǎng)生長速率大大高于自養(yǎng)生長速率。脫氮副球菌tdfq-1能在含有高濃度有機物和nh3-n的養(yǎng)殖廢水中生長，具有高效硝化和反硝化能力，通過異養(yǎng)硝化作用分解有機物質(zhì)，將銨態(tài)氮轉化為硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，通過好氧反硝化作用將亞硝態(tài)氮還原為氮氣或一氧化二氮。本發(fā)明菌株在進行硝化作用的同時，可以降解養(yǎng)殖廢水中喹諾酮類物質(zhì)，減少畜禽抗生素的過度使用和排放對土壤和地下水的污染，避免抗生素通過食物鏈的積累效果對人體健康產(chǎn)生影響。本發(fā)明的脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1具有易于發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，能夠在含高濃度有機物的廢水中生長繁殖，把養(yǎng)殖廢水中的氨氮轉化為新的菌體細胞及無害的n2，高效去除其中的氨氮、總氮，相比較于物理和化學處理法，其具有投資少能耗低的優(yōu)點。在nb中培養(yǎng)18h，活菌含量達到5.84×109cfu/ml，在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h,活菌含量可以達到8.92×109cfu/ml，活菌數(shù)提高了52.74％。將tdfq-1制劑用于處理養(yǎng)豬場廢水，用該制劑處理豬場養(yǎng)殖廢水，豬場養(yǎng)殖廢水中的氨氮和總氮的含量由tdfq-1處理前的562.08mg/l、645.66mg/l降低到54.21mg/l、85.84mg/l，分別減少90.35％和86.71％。處理雞場養(yǎng)殖廢水，雞場養(yǎng)殖廢水中的氨氮和總氮的含量由tdfq-1處理前的662.37mg/l、695.83mg/l降低到54.36mg/l、69.11mg/l，分別減少91.79％和90.07％。在高效去除養(yǎng)殖場廢水中的氨氮和總氮的同時，tdfq-1還可以降解廢水中的喹諾酮類抗生素。在豬場養(yǎng)殖廢水中，使用tdfq-1制劑的試驗組和不使用該制劑的對照組相比較，，諾氟沙星降解率為93.41％，提高了69.36％；環(huán)丙沙星降解率為96.93％，提高了68.59％；恩諾沙星降解率為93.82％，提高了51.35％。使用tdfq-1的試驗組中3種喹諾酮類抗生素的降解率均達到了90％以上。附圖說明圖1為griess試劑顯色法初篩去氨氮細菌示意圖；其中：e孔為tdfq-1，h孔為對照。圖2為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的16srdna系統(tǒng)發(fā)育進化樹。圖3為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1光學顯微照片(400倍)。圖4為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1生長曲線圖。圖5為總氮測定標準曲線。圖6為氨氮測定標準曲線。圖7為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對豬場養(yǎng)殖廢水中喹諾酮類抗生素降解效果示意圖。具體實施方式本發(fā)明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規(guī)技術；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。本發(fā)明實施例所用培養(yǎng)基如下：液體種子培養(yǎng)集(nb)的配方(1l)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，加水定容至1l；固體種子培養(yǎng)基(na)的配方(1l)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，加水定容至1l。發(fā)酵培養(yǎng)基(1l)：蛋白胨5g，酵母膏5g，nacl2g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，feso40.03g，mnso40.01g，cacl20.2g，甘油6.0g，加水定容至1l，調(diào)節(jié)ph7.5。液體硝化培養(yǎng)基(yw)配方(1l)：(nh4)2so42g，mnso40.01g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，cacl20.2g，feso40.03g，甘油6g，加水定容至1l，調(diào)節(jié)ph7.8。實施例1：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的獲得：從南湖、湖北隨州某豬場、湖北安陸某雞場采集湖水及養(yǎng)殖場廢水，以(nh4)2so4為唯一氮源，在yw液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)能利用氨氮為氮源生長的細菌，30℃，200rpm培養(yǎng)72h，在yw培養(yǎng)基中連續(xù)富集傳代3次，培養(yǎng)液稀釋后涂平板，挑取單菌落接種于yw液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，用griess試劑顯色法篩選硝化能力強的菌株(見圖1)。液體硝化培養(yǎng)基(yw)配方：(nh4)2so42g，mnso40.01g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，cacl20.2g，feso40.03g，甘油6g，ph7.8。菌種16s鑒定對分離獲得的7株菌進行鑒定，利用已發(fā)表的16s通用引物(27f和1492r，引物序列為27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)對7株菌的16srrna基因序列進行擴增和測序，pcr擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序序列在ncbi進行blastn比對，并利用mega軟件中的clusterw構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹(進化樹見圖2)，同源性比對結果顯示這7株菌分別為2株芽孢桿菌、2株脫氮副球菌、1株假單胞菌、1株紅串紅球菌、1株顆粒申氏桿菌，分別命名為芽孢桿菌(bacillussp)xhyb-1、芽孢桿菌(bacillussp)xhyb-2、脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1、脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-2、紅串紅球菌(rhodococcuserythropolis)hchq、假單胞菌(pseudomonassp)jdb、顆粒申氏桿菌(shinellagranuli)klss，其中脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1在顯色法分離篩選過程中變色最明顯，說明其異養(yǎng)硝化能力最強。生理生化鑒定tdfq-1：tdfq-1在營養(yǎng)瓊脂(na)培養(yǎng)基上繁殖生長形成圓形菌落，菌落大小1-2mm，表面光滑濕潤。該菌鏡檢為革蘭氏陰性，單個、成對或成堆，對數(shù)生長期為球形或近球形，平均大小為1.1×1.3um，靜止期菌體為球形，直徑1um。不水解明膠、淀粉；不利用d-阿拉伯糖、精氨酸；可利用蔗糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇為唯一碳源生長；銨鹽和硝酸鹽都能作為氮源；能用氧或硝酸鹽作為電子受體。與《伯杰細菌鑒定手冊》中脫氮副球菌生理生化特性一致，確認該菌為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)。tdfq-1光學顯微照片見圖3。所述的脫氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，分類命名：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1，保藏編號為cctccno：m2017238地址：中國武漢武漢大學。實施例2：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的制備：1)脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的生長曲線將活化好的脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1按1％(v/v)的接種量分別接種于200mlnb和200ml發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣測定od600值，以時間為橫坐標，od600值為縱坐標繪制生長曲線，見圖4。表1脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1生長曲線數(shù)據(jù)生長曲線代表微生物的生長特性，根據(jù)微生物的生長曲線可以明確微生物的生長規(guī)律，測定其到達穩(wěn)定期的時間能夠確定合適的發(fā)酵培養(yǎng)時間，對生產(chǎn)實踐具有一定的指導意義。結果表明，在nb培養(yǎng)基中，tdfq-1從第4h進入對數(shù)生長期，18h到達穩(wěn)定期，4-18h間處于快速生長的對數(shù)生長期；在發(fā)酵培養(yǎng)基中tdfq-1從第4h進入對數(shù)生長期，18h到達穩(wěn)定期，4-18h間處于快速生長的對數(shù)生長期。由tdfq-1的生長曲線可知，本發(fā)明菌株在18h時即可達到穩(wěn)定期，生長周期短，在大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)條件下，可以降低生產(chǎn)成本。2)脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的制備：將脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1種子液按1％(v/v)的接種量接種于200ml發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)18h(達到穩(wěn)定期時間點)，活菌數(shù)達到8.92×109cfu/ml。而tdfq-1在同樣條件下接種于nb培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h時,活菌數(shù)為5.84×109cfu/ml，相比較活菌數(shù)提高了52.74％。將脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1種子液按3％(v/v)接種量接種于50l發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量是為35l，控制攪拌轉速維持溶氧在16％，30℃培養(yǎng)18h收集發(fā)酵液，發(fā)酵液菌量達到9.87×109cfu/ml。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方(g/l)：蛋白胨5g，酵母膏5g，nacl2g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，feso40.03g，mnso40.01g，cacl20.2g，甘油6.0，調(diào)節(jié)ph7.5；實施例3：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對yw培養(yǎng)基中氨氮和總氮去除效果將脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1接種于200mlnb液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)18小時，發(fā)酵液液離心去上清，加滅菌單蒸水洗滌2次，加滅菌單蒸水重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度od600值為1.5；重懸種子液按5％的接種量接種于200mlyw培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)54h，每6小時取2ml培養(yǎng)液，用于測定發(fā)酵液中總氮和氨氮的含量?？偟捎眠^硫酸鉀氧化風光光度法，氨氮采用納氏試劑光度法?？偟桶钡獪y定標準曲線：圖5和圖6，結果如表2和表3所示。脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液中總氮和氨氮含量測定。表2脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對培養(yǎng)基中總氮去除率表3脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對培養(yǎng)基中氨氮去除率由表2和表3可知，脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對培養(yǎng)基中總氮的最終去除率為92.41％，氨氮的去除率為94.72％，18h時氨氮、總氮的減少量均大于85％。之后隨著時間的增加，氨氮和總氮的減少量變化不是很大，因此，在實際應用中，脫氮副球菌tdfq-1對養(yǎng)殖廢水的處理時間確定為18h。實施例4：脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對養(yǎng)殖場高有機質(zhì)廢水的處理一、對豬場養(yǎng)殖廢水的處理1.對豬場養(yǎng)殖廢水中氨氮和總氮去除效果采取隨州某豬場的養(yǎng)殖廢水，過濾去除養(yǎng)殖廢水中的顆粒懸浮物，過濾后的污水作為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1脫氮作用的實驗用水。按5％(v/v)的量將12.5ml(活菌數(shù)5×109cfu/ml)的tdfq-1液體制劑加入250ml污水中，室溫下(25℃)處理18h，測定污水中氨氮和總氮的含量變化。表4脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對豬場養(yǎng)殖廢水中氨氮和總氮的去除效果由表4可知，通過脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的處理，豬場養(yǎng)殖廢水中的氨氮和總氮的含量由tdfq-1處理前的562.08mg/l、645.66mg/l降低到54.21mg/l、85.84mg/l，分別減少90.35％和86.71％。2.對豬場養(yǎng)殖廢水中氟喹諾酮類抗生素的降解作用采取隨州某豬場的養(yǎng)殖廢水，過濾去除養(yǎng)殖廢水中的顆粒懸浮物，過濾后的污水作為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1降解喹諾酮類抗生素的實驗用水。按5％(v/v)的量將12.5ml(活菌數(shù)5×109cfu/ml)的tdfq-1液體制劑加入250ml污水中，室溫下(25℃)處理一定時間，測定污水中喹諾酮類(諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星)抗生素含量變化(表5、圖7)。養(yǎng)殖廢水中抗生素濃度的測定采用高效液相色譜法(hplc)。表5脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對豬場養(yǎng)殖廢水中喹諾酮類抗生素的降解作用(單位ng/l)由表5可知，用脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1處理豬場養(yǎng)殖廢水的試驗組和未使用tdfq-1的對照組比較，諾氟沙星降解率從24.05％提高到93.41％，降解率提高了69.36％；環(huán)丙沙星降解率從28.34％提高到96.93％，降解率提高了68.59％；恩諾沙星降解率從42.47％提高到93.82％，提高了51.35％。使用tdfq-1的試驗組中3種喹諾酮類抗生素的降解率均達到了90％以上。二、對雞場養(yǎng)殖廢水中氨氮和總氮去除效果采取安陸某雞場的養(yǎng)殖廢水，過濾去除養(yǎng)殖廢水中的顆粒懸浮物，過濾后的污水作為脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1脫氮作用的實驗用水。按5％(v/v)的量將12.5ml(活菌數(shù)5×109cfu/ml)的tdfq-1液體制劑加入250ml污水中，室溫下(25℃)處理18h，測定污水中氨氮和總氮的含量變化。表6脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1對雞場養(yǎng)殖廢水中氨氮和總氮的去除效果指標處理前處理后去除率(％)氨氮(mg/l)662.3754.3691.79總氮(mg/l)695.8369.1190.07由表6可知，通過脫氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的處理，雞場養(yǎng)殖廢水中的氨氮和總氮的含量由tdfq-1處理前的662.37mg/l、695.83mg/l降低到54.36mg/l、69.11mg/l，分別減少91.79％和90.07％。當前第1頁12