在基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種新型蛋白重組工程菌及其構(gòu)建方法，以及該融合蛋白的純化。

背景技術(shù)：

基因工程是生物工程的一個重要分支，它和細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和微生物工程共同組成了生物工程。所謂基因工程(geneticengineering)是在分子水平上對基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)。是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——dna大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的dna分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。

基因工程疫苗是使用dna重組生物技術(shù)，把天然的或人工合成的遺傳物質(zhì)定向插入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動物細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，經(jīng)純化后而制得的疫苗。應(yīng)用基因工程技術(shù)能制出不含感染性物質(zhì)的亞單位疫苗、穩(wěn)定的減毒疫苗及能預(yù)防多種疾病的多價疫苗。如把編碼乙型肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因組，制成dna重組乙型肝炎疫苗；把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、單純皰疹病毒基因插入牛痘苗基因組中制成的多價疫苗等。

質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的dna片段(＜10kb)且結(jié)構(gòu)簡單，質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。重組質(zhì)粒是指在基因工程的領(lǐng)域，將目的基因和載體結(jié)合成一個具有自我復(fù)制能力的dna分子，繼而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主菌株或細(xì)胞，篩選出含目的基因的重組子。

腫瘤疫苗是近年研究的熱點(diǎn)之一，其原理是通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，以達(dá)到清除或控制腫瘤的目的。

根據(jù)腫瘤疫苗的具體用途，可分為兩種：一種是預(yù)防性疫苗，如用與某些特殊腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因制備疫苗，接種于具有遺傳易感性的健康人群，進(jìn)而可以控制腫瘤的發(fā)生。另一種是治療性疫苗，它以腫瘤相關(guān)抗原為基礎(chǔ)，主要用于化療后的輔助治療。

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasinghormone，gnrh)又稱為黃體釋放激素(1uteinizinghormone-releasinghormone，lhrh)，序列為cooh-焦谷-組-色-絲-絡(luò)-甘-亮-精-脯-甘-nh2(pyro-glu-his-trp-ser-tyr-glyleu-arg-pro-gly-nh2)，它是神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)相互聯(lián)系的重要信號分子。1971年，shally和guillenmin從豬的下丘腦首先分離純化出促性腺激素釋放激素并由此獲得諾貝爾獎。它由下丘腦特定神經(jīng)元細(xì)胞合成，并以脈沖方式通過垂體門脈循環(huán)分泌到垂體前葉，與垂體細(xì)胞膜上高親和力的gnrh受體(gnrhr)特異地結(jié)合，引發(fā)fsh和lh的合成與釋放，從而促進(jìn)性腺中類固醇激素的合成。通過誘導(dǎo)高滴度的抗gnrh-i抗體來中和機(jī)體內(nèi)的gnrh-i，可抑制其與垂體上i型gnrhr的結(jié)合，導(dǎo)致lh和fsh等促性腺激素釋放水平明顯下降，下調(diào)類固醇類激素的合成，降低對腫瘤細(xì)胞生長的供應(yīng)，對激素依賴性腫瘤有良好的治療效果。同時gnrh可下調(diào)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管再生作用以及調(diào)控或作用于生長因子，如在前列腺癌細(xì)胞中g(shù)nrh-a具有抗egf/tgfa系統(tǒng)作用，降低細(xì)胞分裂；可能涉及細(xì)胞凋亡的誘發(fā)或者抑制細(xì)胞內(nèi)諸如p13/pkb等信號通道。因此gnrh及其受體是腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。

gnrh-i是一種小分子半抗原，免疫原性很弱，單獨(dú)將其作為疫苗很難引起免疫應(yīng)答，因此本實驗室利用輔助t表位來提高gnrh-i的免疫原性。研究表明，麻疹病毒融合蛋白序列中的288-302氨基酸片段是一個典型的t表位(seikgvivrlegvak，下文均簡稱mvp)，可用于人用疫苗而且不會產(chǎn)生明顯的針對該t表位的抗體。有研究表明，含有多拷貝線性連接的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到極大的提高，因而，本實驗室將編碼三段首尾相連的gnrh-i的核苷酸片段克隆入高效表達(dá)載體。還有研究表明，半抗原的二聚體能產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫原性。人igg1鉸鏈區(qū)(hingeregion)寡肽片段226-232/226’-232’(cppcpap/cppcpap)是天然免疫蛋白的樞軸。在天然蛋白中，這個富含脯氨酸的剛性雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)會自發(fā)折疊成一個雙聚脯氨酸-iiα螺旋，人工合成的鉸鏈區(qū)多肽225-232/225’-232’的空間構(gòu)型與天然蛋白中鉸鏈片段的構(gòu)型完全一致，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)在igg1鉸鏈區(qū)的一端或兩端連上非igg1的多肽序列時，仍能形成雙聚脯氨酸-iiα螺旋。因此，我們在編碼gnrh-i重復(fù)序列和mvp的核苷酸序列之間引入該寡肽片段的相應(yīng)核苷酸序列，希望gnrh-i能藉此形成二聚體，增強(qiáng)免疫原性。

就像大多數(shù)多肽疫苗一樣，gnrh的重組多肽需要加入佐劑，才能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答。本實驗將與dnak多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域有著高度親和力的多肽片段nrllltg融合在先前所構(gòu)建的gnrh-i多肽疫苗融合蛋白的c-端。

鼠源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(mousegranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，mgm-csf)屬于造血因子家族，與人源gm-csf有56％的同源性?？乖岢适菣C(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的第一步，樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，dc)是體內(nèi)專職的、作用最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presentingcells，apcs)，而gm-csf是對樹突細(xì)胞調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，它不僅可以誘導(dǎo)dc細(xì)胞的成熟、分化，而且在免疫治療過程中可增強(qiáng)主要和次要的抗體反應(yīng)，以促進(jìn)dc等apc的分化、成熟和活化以及上調(diào)cd86的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和adcc(抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用)效應(yīng)等活性，促進(jìn)th、tc、nk在腫瘤部位浸潤，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。gm-csf強(qiáng)烈激活特異免疫反應(yīng)這一突出作用可用于腫瘤治療。大量的動物實驗和臨床研究證實粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子可在腫瘤主動免疫治療作為佐劑使用，同時具有安全、無毒、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。

由于單獨(dú)用mgm-csf或gnrh免疫原性相對較低，且從多個位點(diǎn)共同作用于腫瘤已經(jīng)成為趨勢。本發(fā)明將mgm-csf基因同gnrh基因連接起來，組建pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，將其作為疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生主動免疫，打破免疫耐受，產(chǎn)生針對mgm-csf和gnrh特異性肽段的抗體，從而抑制腫瘤的生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一種表達(dá)重組mgm-csf和gnrh融合蛋白的基因工程菌。

本發(fā)明的一個目的是提供該重組菌的制備方法，方法簡便，易于操作。

本發(fā)明的另一個目的是公開該重組蛋白的純化方法。

在本發(fā)明的第一個方面，該大腸桿菌菌株命名為escherichiacolibl21/pet28a-mggn：pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg，菌株已提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國、武漢、武漢大學(xué)。保藏日期：2017年1月10日，保藏編號為cctccno：m2017022，分類命名為escherichiacolibl21/pet28a-mggn：pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg，其細(xì)胞中含有重組質(zhì)粒pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg，質(zhì)粒中含有seqidno.1所示的mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg基因序列。

在本發(fā)明的第二個方面，提供了該重組質(zhì)粒的制備方法，其技術(shù)路線詳述如下：

1.重組質(zhì)粒pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建

根據(jù)本實驗室已有的關(guān)于重組質(zhì)粒pet-28a-vegf-m2-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg和pet-28a-mgm-csf-x10-βhcgctp37的序列信息，利用引物設(shè)計軟件primer5和oligo7來設(shè)計引物p1、p2。上游引物p1中引入ncoi，下游引物p2中引入bamhi酶切位點(diǎn)以及dptggs連接肽序列。采用pcr技術(shù)從pet-28a-mgm-csf-x10-βhcgctp37質(zhì)粒中克隆得到基因mgm-csf。通過酶切、酶連反應(yīng)和轉(zhuǎn)化技術(shù)將pcr的產(chǎn)物mgm-csf插入pet-28a質(zhì)粒載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，得到重組轉(zhuǎn)化子pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.colibl21獲得需要的重組基因的工程菌。

2.融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組工程菌進(jìn)行活化，接種至含硫酸卡那霉素的lb培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，按1：100轉(zhuǎn)接于新鮮lb培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至od600值為0.5-0.8時，加入乳糖(終濃度5mm)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，6h后離心收取菌體沉淀，進(jìn)行15％sds-page分析，觀察目的蛋白條帶位置和表達(dá)量。

3.融合蛋白的分離純化

收集菌體，每克濕菌體加入10ml菌體裂解緩沖液溶解，菌體超聲裂解，離心收集沉淀。將沉淀用含2m尿素的包涵體洗滌液進(jìn)行洗滌后溶于含6m鹽酸胍的包涵體裂解液中，離心取上清，將上清采用分步稀釋法按照鹽酸胍濃度梯度4m、2m、1.5m、1m進(jìn)行緩慢稀釋復(fù)性，離心棄沉淀，上清液過陰離子交換柱deae-cellulose做進(jìn)一步純化，用濃度梯度為0-1mnacl層析緩沖液梯度洗脫，收集洗脫峰，檢測合并目的蛋白峰組分，蒸餾水充分透析后凍干保存。

附圖說明

圖1重組質(zhì)粒構(gòu)建原理示意圖。

圖20.8％瓊脂糖凝膠電泳中mgm-csf基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

lane1：dnamarker；lane2-9：退火溫度分別為57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃時對應(yīng)的mgm-csfpcr產(chǎn)物

圖30.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg目的基因的結(jié)果圖。

lane1：dnamarker；lane2-7：來自于不同菌落的重組質(zhì)粒pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvppcr產(chǎn)物

圖40.8％瓊脂糖凝膠電泳重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶驗證圖。

lane1：dnamarker；lane2：ncoi、hindiii雙酶切pet-28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp重組質(zhì)粒；lane3：ncoi單酶切pet-28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp重組質(zhì)粒

圖5重組質(zhì)粒pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg的基因正向測序圖。

圖615％sds-page電泳檢測重組菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的誘導(dǎo)曲線圖。

lane1：proteinmarker；lane2：重組菌誘導(dǎo)前的全菌蛋白；lane3～10：重組菌誘導(dǎo)時間分別為1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h后的全菌蛋白

圖715％sds-page菌體裂解物分析圖。

lane1：proteinmarker；lane2：誘導(dǎo)前菌體總蛋白；lane3：乳糖誘導(dǎo)6h后菌體總蛋白；lane4：重組菌超聲破碎后的上清液；lane5：重組菌超聲破碎后的沉淀

圖815％sds-page電泳檢測尿素洗滌濃度篩選圖。

lane1：proteinmarkerlane3，5，7，9：經(jīng)尿素濃度分別為0.5m，1m，1.5m，2m洗滌液洗滌后的沉淀；lane2，4，6，8：經(jīng)尿素濃度分別為0.5m，1m，1.5m，2m洗滌液洗滌后的上清

圖915％sds-page分析mgm-csf/gnrh融合蛋白凍干純化結(jié)果圖。

lane1：proteinmarker；lane2：純化后的mgm-csf/gnrh融合蛋白

具體實施方式

材料

(1)菌株

載體pet-28a-mgm-csf-x10-βhcgctp37，escherichiacolibl21，菌株pet-28a-vegf-m2-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg均為本實驗室保存。

(2)工具酶和試劑

分子克隆工具酶為fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為上海捷瑞生物科技有限公司；產(chǎn)物純化試劑盒以及pcr膠回收試劑盒為上海生工生物科技有限公司的產(chǎn)品。

(3)培養(yǎng)基

lb培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)sambrookj，fristshef，maniatist.molecularcloning；alaboratorymanual2nded.ny：coldspringharborlaboratorypress，1989。

本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、pcr反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、pcr產(chǎn)物的回收、連接酶連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見sambrookj，fristshef，maniatist.molecularcloning；alaboratorymanual2nded.ny：coldspringharborlaboratorypress，1989，pp.16-340。

實施例1pet28a-mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg基因的克隆

根據(jù)本實驗室已構(gòu)建的關(guān)于pet-28a-mgm-csf-x10-βhcgctp37的序列信息，利用引物設(shè)計軟件primer、oligo分別設(shè)計兩對引物p1、p2：

p1：5’-catgccatggcacccacccgct-3’

p2：5′-cgggatccgagccaccagtcgg-3′

上游引物p1中引入酶切位點(diǎn)ncoi，下游p2中引入酶切位點(diǎn)bamhi以及柔性肽dptggs。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pet-28a-mgm-csf-x10-βhcgctp37和質(zhì)粒pet-28a-vegf-m2-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg。利用引物p1、p2克隆mgm-csf基因，pcr反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)參數(shù)見表2。

表1mgm-csfpcr反應(yīng)體系

表2mgm-csfpcr反應(yīng)參數(shù)

0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr產(chǎn)物(參見說明書附圖2)，條帶位置與預(yù)期的404bp一致。

通過切膠回收獲得目的片段mgm-csf，將目的片段和pet-28a-vegf-m2-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg載體質(zhì)粒分別經(jīng)ncoi、bamhi雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系見表3、表4。

表3mgm-csf基因雙酶切反應(yīng)體系

表4pet-28a-vegf-m2-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg雙酶切反應(yīng)體系

酶切產(chǎn)物通過pcr產(chǎn)物純化試劑盒純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基因片段與載體基因片段后用e.colidna連接酶4℃連接，用冷cacl2法制備大腸桿菌bl21的感受態(tài)細(xì)胞，將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含硫酸卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，將單菌落接種至lb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，分別通過菌落pcr、單酶切和雙酶切等方法初篩陽性克隆，并送至生工測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)軟件比對后完全正確。(參見說明書附圖3，圖4，圖5)

實施例2mgm-csf-gnrh3-hinge-mvp-nrllltg基因在大腸桿菌中的表達(dá)及培養(yǎng)

重組菌以1％接種量在液體lb培養(yǎng)基試管中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，再以1％的接種量轉(zhuǎn)接搖瓶大批培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后加入終濃度為5mm乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6h后收集菌體，留樣進(jìn)行sds-page分析。融合蛋白在誘導(dǎo)后6h達(dá)到穩(wěn)定的最大表達(dá)量，通過bandscan軟件分析融合蛋白的表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白量的44.6％。(參見說明書附圖6)

實施例3融合蛋白的初步分離純化

挑選高表達(dá)量菌株，接種于lb培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入lb培養(yǎng)基，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)，選取最優(yōu)發(fā)酵條件獲得發(fā)酵菌體。5000r/min離心15min，上清及沉淀均留樣。將沉淀用配制好的菌體裂解液(10ml/g菌體)溶解，超聲裂解菌體。12000r/min離心20min，收集上清及沉淀均留樣標(biāo)記。sds-page電泳結(jié)果顯示目的蛋白主要存在于菌體沉淀中，故可判斷融合蛋白為包涵體表達(dá)。(參見說明書附圖7)

實施例4包涵體純化

取4管10ml裂解后的菌體，4℃、12000r/min離心15min。各管沉淀分別重懸于10ml0.5m、1m、1.5m、2m尿素(含20mmtris-hcl，0.5mmedta，ph8.0)中。4℃磁力攪拌1h后，12000r/min離心10min，上清和沉淀分別取樣，15％sds-page電泳分析上清和沉淀中雜蛋白和目的蛋白的含量。每g包涵體濕重加入10ml洗滌液，rt，磁力攪拌1h使沉淀重新懸浮均勻。12000r/min離心15min，棄上清，保留沉淀。用雙蒸水洗滌，離心取沉淀4℃?zhèn)溆谩０w沉淀1g加入20ml包涵體裂解緩沖液，4℃磁力攪拌過夜，使沉淀重懸浮于鹽酸胍溶液中。12000r/min離心15min，收集上清。(參見說明書附圖8)

實施例5包涵體的復(fù)性

將上步收集的上清采用分步稀釋法按照鹽酸胍濃度梯度4m、2m、1.5m、1m進(jìn)行緩慢稀釋復(fù)性，復(fù)性液中加入氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽至終濃度分別為0.1mmol/l和1mmol/l及5％甘油，4℃快速攪拌，利用恒流泵控制流速以1ml/min將復(fù)性液滴加進(jìn)蛋白變性液中，每稀釋降低一個濃度梯度需靜置或緩慢攪拌6-12小時使蛋白充分復(fù)性，離心取上清，獲得復(fù)性后的目的蛋白。

實施例6deae-52陰離子交換層析

本實驗采用的deae52是弱酸型陰離子交換劑，將deae-52用naoh、hcl和naoh分別處理后用蒸餾水將其洗至中性，再將deae-52裝入層析柱中，層析柱上端進(jìn)液口連接恒流泵，下出口連接核酸蛋白檢測儀，利用離子交換緩沖液(ph8.0，20mmtris·hcl)進(jìn)行層析柱的平衡，平衡完畢后以1ml/min的速度進(jìn)行蛋白溶液的上樣操作，上樣后重復(fù)平衡操作，收集穿透峰，再用nacl(0-1m)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰留樣，進(jìn)行sds-page電泳分析。

實施例6脫鹽凍干

收集蛋白純度較高的洗脫液，裝入截留量為8000-14000da的透析袋中4℃對蒸餾水透析過夜，將透析后的洗脫液在凍干機(jī)中凍干，刮取蛋白干粉冷凍保存并進(jìn)行sds-page電泳分析。(參見說明書附圖9)

除上述事實外，本發(fā)明還可以有其他實施方式，凡采用等同替換或等效變換性的技術(shù)方案，均落于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。