本發(fā)明涉及一種來源于嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)的糖苷水解酶家族第10家族的木聚糖酶基因及其編碼酶在畢赤酵母中的異源表達，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

內(nèi)切β-1,4-d-木聚糖酶(endo-β-1,4-d-xylanase,ec3.2.1.8)簡稱木聚糖酶。它是一類以內(nèi)切方式水解木聚糖中的β-1,4糖苷鍵，其水解產(chǎn)物主要是寡糖和少量木糖。在半纖維素類生物資源轉(zhuǎn)化和利用中，木聚糖酶是必不可少的有效生物催化劑。木聚糖酶在食品、飼料、造紙有廣泛的應(yīng)用。然而，自然存在的大多數(shù)木聚糖酶的性質(zhì)往往不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，特別是生產(chǎn)中的高溫、耐堿等極端環(huán)境。因此，耐熱木聚糖酶的研究和開發(fā)具有較高的應(yīng)用價值。

從嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)中分離的木聚糖酶具有較高的比活性和熱穩(wěn)定性，在70℃條件下保溫8h不影響其酶活性；在生物技術(shù)應(yīng)用中展現(xiàn)出較大吸引力。為了進一步改善熱穩(wěn)定性，研究者通過將其編碼基因在大腸桿菌中進行異源表達或者使用定向突變的技術(shù)改善酶的產(chǎn)量和熱穩(wěn)定性。然而，重組酶在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物熱穩(wěn)定性并未提高。

巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)表達系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，與現(xiàn)有的其他表達系統(tǒng)相比，其在表達產(chǎn)物的加工、外分泌、翻譯后修飾以及糖基化等方面有明顯的優(yōu)勢。翻譯后修飾和糖基化往往會影響異源表達酶的結(jié)構(gòu)，進而影響其生物學(xué)功能，是酶工程領(lǐng)域獲得改良酶產(chǎn)品的重要技術(shù)手段之一。密碼子使用偏好與基因表達緊密關(guān)聯(lián)，按照密碼子的偏好性，對外源蛋白編碼基因進行密碼子優(yōu)化可以有效提高外源蛋白的表達量甚至影響蛋白功能。因此，巴斯德畢赤酵母成為耐熱木聚糖酶異源表達的優(yōu)良宿主。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種來源于嗜熱子囊菌的耐熱β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因xyna及其重組酶xyna在畢赤酵母中的異源表達，為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

將源自嗜熱子囊菌的耐熱β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶的基因根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性進行序列優(yōu)化，優(yōu)化后基因命名為xyna，其核苷酸序列為seqidno:1；編碼的蛋白質(zhì)為xyna，其氨基酸序列為seqidno:2；將該優(yōu)化基因在畢赤酵母gs115中進行分泌表達，并對表達產(chǎn)物進行活性測定及酶學(xué)性質(zhì)分析。

所述的xyna是一種來源于嗜熱子囊菌thermoascusaurantiacusnbrc9748的耐熱木聚糖酶基因，密碼子優(yōu)化后的基因序列已提交genbank(登錄號為mf072723)，優(yōu)化后的基因在畢赤酵母中異源表達，其重組蛋白xyna的熱穩(wěn)定性較好，具有適合于工業(yè)應(yīng)用的理想特性。

本發(fā)明保護該種耐熱木聚糖酶，其氨基酸序列為seqidno.2所示。

本發(fā)明還保護該耐熱木聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為seqidno.1所示。

本發(fā)明亦保護該耐熱木聚糖酶編碼基因的重組載體和重組菌株。

本發(fā)明還提供制備該種耐熱木聚糖酶的方法，包括以下步驟：

(1)以權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；

(2)培養(yǎng)所述宿主細胞；

(3)分離純化耐熱木聚糖酶。

其中，步驟(1)和(2)所述的宿主細胞為畢赤酵母gs115細胞。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種源自嗜熱子囊菌的第10家族耐熱木聚糖酶基因及其重組酶在畢赤酵母的異源表達。其相應(yīng)的基因為xyna；重組酶xyna的表觀分子量為75kda；重組酶發(fā)酵粗酶活為40u/ml；分子篩層析后的純酶比活為1053u/ml；xyna的最適反應(yīng)溫度為75℃；在100℃下保溫3h，殘余酶活為86.5％，表明該酶的熱穩(wěn)定性較好。xyna的最適ph為8.0，在ph4.0～10.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定；金屬離子對該酶活性影響較小。本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力及經(jīng)濟價值，也為其它耐熱木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

具體實施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述，以下實施例僅是對本發(fā)明進行說明而非對其加以限定。

實施例1重組質(zhì)粒pgem-t-xyna的構(gòu)建

為實現(xiàn)來源于嗜熱子囊菌的耐熱木聚糖酶基因xyna在畢赤酵母中的高效表達，對基因序列進行畢赤酵母密碼子優(yōu)化，將其命名為xyna。在其基因兩端分別加入ecori和noti限制性酶切位點，經(jīng)人工合成后克隆至pgem-t質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.colixl10-gold感受態(tài)細胞,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pgem-t-xyna。

實施例2重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述得到的重組質(zhì)粒pgem-t-xyna進行ecori和noti雙酶切，割膠回收目的基因xyna，與經(jīng)同樣雙酶切的表達質(zhì)粒pgapzαa連接，轉(zhuǎn)化e.colixl10-gold感受態(tài)細胞，經(jīng)pcr篩選鑒定后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pgapzαa-xyna。將測序正確的重組質(zhì)粒pgapzαa-xyna進行sali線性化處理，再經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入畢赤酵母gs115感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化子涂布于含博萊霉素的ypd平板，經(jīng)pcr篩選出高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子命名為rx8。

實施例3重組木聚糖酶的表達與純化

將rx8接種于5mlypd培養(yǎng)基中，于30℃，250rpm/min振蕩培養(yǎng)12h。以1％的接種量轉(zhuǎn)接于100mlypd培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)96h。發(fā)酵液離心后的上清液為粗酶液，使用分子篩層析的方法純化該酶。

實施例4重組木聚糖酶xyna酶學(xué)屬性測定

1.酶活與分子量

木聚糖酶酶活測定采用dns法。在標準反應(yīng)條件下，一個酶活性單位(u)定義為每分鐘產(chǎn)生1μm還原糖所需的酶量。結(jié)果顯示，dns法測定粗酶液的木聚糖酶活性為40u/ml。使用分子篩層析的方法純化該酶，重組酶的比酶活為1053u/mg。

sds-page分析顯示重組酶的表觀分子量為75kda。

2.酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

取適當重組酶稀釋液于不同溫度下(30～100℃)測定酶活性，以酶活力最高者為100％，獲得重組酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液置于不同溫度下保溫0～4h，參照標準方法測定殘余酶活，未處理酶液的酶活力為100％。當殘余酶活達到85％以上，定義為穩(wěn)定。結(jié)果顯示，該酶的最適反應(yīng)溫度為75℃，在100℃處理3h后，殘余酶活性為86.5％。

3.酶的最適ph與ph穩(wěn)定性

在最適溫度下，測定不同ph值(ph3.0～ph11.0)條件下木聚糖酶的酶活性。以酶活力最高者為100％，繪制ph-相對酶活性曲線，獲得最適ph。將粗酶液在不同的ph值，在75℃中保溫4h，測定殘余酶活性，以未處理酶液的酶活性為100％。當殘余酶活達到85％以上，即定義為穩(wěn)定。結(jié)果顯示，重組木聚糖酶的最適ph為8.0，在ph4.0～10.0的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。

4.金屬離子對酶活性的影響

將酶液與不同金屬離子溶液混合，終濃度為5mm，30℃，保溫1h，參照常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100％。結(jié)果顯示，金屬離子對該酶的活性影響較小。

以上所述實施方式僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。

<110>安徽醫(yī)科大學(xué)

<120>一種耐熱木聚糖酶及其編碼基因

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