本發(fā)明屬于植物蛋白和植物抗除草劑領(lǐng)域，涉及使植物具有除草劑抗性的水稻als突變型蛋白、基因及其應(yīng)用；具體而言，本發(fā)明涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(als)突變蛋白，該蛋白能賦予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的特性。本發(fā)明公開了該蛋白的序列，以及它們?cè)谥参锟钩輨╊I(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雜草是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的不利因素。與傳統(tǒng)依靠栽培措施、人工除草和機(jī)械除草等方法相比，化學(xué)除草劑的使用是一種高效的、簡(jiǎn)便的和經(jīng)濟(jì)的治理雜草方法。

乙酰乳酸合成酶(als)(也稱乙酰羥酸合成酶，ahas；ec4.1.3.18)抑制劑類除草劑以als作為靶標(biāo)而導(dǎo)致雜草死亡，主要包括磺酰脲類(sulfonylureas,su)、咪唑啉酮類(imidazolinones,imi)、三唑嘧啶類(triazolopyrimidines,tp)、嘧啶氧(硫)苯甲酸類[pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,ptb；pyrimidinyl-carboxyherbicides；pcs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮類(sulfonylamino-carbonyltriazolinones,sct)等13類化合物。乙酰乳酸合成酶，存在于植物生長(zhǎng)過程中，它能以高度專一性和極高的催化效率催化丙酮酸為乙酰乳酸，從而導(dǎo)致支鏈氨基酸的生物合成。als抑制劑是除草劑通過抑制als而破壞植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成。而亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸是植物體內(nèi)3種必需的支鏈氨基酸。als是催化纈氨酸和異亮氨酸生物合成過程中第一步反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵酶，亮氨酸的合成過程則較復(fù)雜，其中從丙酮酸到α-酮異戊酸的合成過程與纈氨酸完全一致，然后才形成亮氨酸，所以，這3種氨基酸的生物合成開始階段均需als催化。als也是植物支鏈氨基酸生物合成過程中3個(gè)調(diào)節(jié)酶之一，其活性受產(chǎn)物纈氨酸和異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)。als抑制劑會(huì)使植物體內(nèi)als活力降低，導(dǎo)致這3種支鏈氨基酸合成受阻，影響蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)一步抑制細(xì)胞分裂，導(dǎo)致植物組織失綠、黃化，植株生長(zhǎng)受抑，最后逐漸死亡。

als抑制劑類除草劑具有選擇性強(qiáng)、殺草譜廣、低毒高效等特點(diǎn)，目前已大面積推廣使用。但這些除草劑對(duì)一般不具有抗(耐)除草劑特性的農(nóng)作物本身也產(chǎn)生藥害，極大限制了其使用時(shí)間和使用空間，如需要在農(nóng)作物播種前一段時(shí)間使用除草劑才能避免農(nóng)作物遭受藥害。培育抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用范圍。

成熟的als蛋白大約由670個(gè)氨基酸組成，其序列在不同物種間高度保守。als蛋白在gly95、ala96、ala122、pro171、pro196、pro197、ala205、asp376、trp537、trp548、trp552、trp557、trp563、trp574、ser621、ser627、ser638、ser653、gly654、val669等氨基酸位點(diǎn)(以模式植物擬南芥的als氨基酸位置計(jì)算)發(fā)生突變可以產(chǎn)生als抑制劑類除草劑抗性，這在多種農(nóng)作物(包括玉米、水稻、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物擬南芥和上百種雜草中均有報(bào)道。

其中，水稻已知的抗als抑制劑突變位點(diǎn)包括gly95、ala96、ala122、trp548、ser627、ser653和gly654。als突變體抗除草劑水平與als氨基酸突變的位置有關(guān)，還與突變后的氨基酸種類及突變氨基酸的數(shù)目有關(guān)。

目前，als抑制劑類除草劑的作用機(jī)理尚未確定，很難提前預(yù)測(cè)als蛋白其它氨基酸位點(diǎn)的突變是否會(huì)產(chǎn)生除草劑抗性，只能依賴于科研人員長(zhǎng)期、艱苦的實(shí)踐探索，并憑借一些運(yùn)氣才可能發(fā)現(xiàn)als蛋白新的除草劑抗性位點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供使植物具有除草劑抗性的蛋白。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了編碼該蛋白的核酸以及表達(dá)盒、載體和細(xì)胞等。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應(yīng)用。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了判斷植物是否采用本發(fā)明方法獲得的鑒定方法。

本發(fā)明人通過長(zhǎng)期、艱苦的研究，對(duì)秈稻揚(yáng)州恢復(fù)系的ems突變植株進(jìn)行長(zhǎng)期、不斷地篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列als突變蛋白，包括前文所述的某些已知als突變蛋白和新als突變蛋白，其對(duì)als抑制劑類除草劑不敏感，從而使得植物具有als抑制劑類除草劑抗性。本發(fā)明在植物育種中的應(yīng)用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農(nóng)作物，還開發(fā)了這些蛋白及其編碼基因在轉(zhuǎn)基因或者非轉(zhuǎn)基因如水稻等作物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了使得植物具有除草劑抗性的als蛋白，其在氨基酸序列的第627位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於０罚?或在氨基酸序列的第628位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?。目前還沒有報(bào)道表明，在來自水稻品種揚(yáng)州恢復(fù)系als蛋白的ser627和gly628位點(diǎn)同時(shí)突變的突變株和在gly628位點(diǎn)突變的突變株。

優(yōu)選本發(fā)明的第一方面的蛋白帶有ser627和gly628位點(diǎn)同時(shí)突變的突變株和在gly628位點(diǎn)突變的突變株，除了本發(fā)明具有的實(shí)施方式所述的突變植株篩選或擴(kuò)增方法之外，在蛋白質(zhì)序列已知的情形下，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力通過改變已知蛋白質(zhì)的編碼基因序列并將其導(dǎo)入載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，這些方法均為常規(guī)手段。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的具有除草劑抗性的als蛋白的氨基酸序列如seqidno:2或seqidno:6所示。該蛋白經(jīng)過證實(shí)對(duì)咪唑啉酮類除草劑不敏感的乙酰乳酸合成酶。

本發(fā)明的第二方面提供了核酸，其編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，核酸可以是dna、rna，其中優(yōu)選為dna。在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規(guī)的密碼子對(duì)應(yīng)關(guān)系和宿主表達(dá)頻率，運(yùn)用pcr方法、dna重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力獲得并優(yōu)化編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核酸。優(yōu)選本發(fā)明第二方面的核酸的核苷酸序列如seqidno：1或seqidno:5所示。具體的，本發(fā)明的dna序列，是在野生型水稻品種揚(yáng)州恢復(fù)系的als基因序列的第1880位核苷酸由g變成核苷酸a，和/或第1883位核苷酸由g變成核苷酸a。

此外，本發(fā)明還獲得了僅包含有ser627位點(diǎn)突變的抗除草劑突變體2和僅包含有g(shù)ly628位點(diǎn)突變的抗除草劑突變體3，通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，含有ser627和gly628位點(diǎn)突變的突變體比僅含有ser627位點(diǎn)的突變體2或僅含有g(shù)ly628位點(diǎn)突變的抗除草劑突變體3的抗除草劑抗性要強(qiáng)。其中，僅含有ser627位點(diǎn)突變的抗除草劑突變體2的als核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸如seqidno.4所示。僅含有g(shù)ly628位點(diǎn)突變的抗除草劑突變體3的als核苷酸序列如seqidno.5所示，氨基酸如seqidno.6所示。

此外，本發(fā)明突變前的野生型水稻為秈型常規(guī)水稻種子揚(yáng)州恢復(fù)系，該als抑制劑類除草劑敏感的野生型揚(yáng)州恢復(fù)系水稻als的核苷酸序列如seqidno.7所示，氨基酸如seqidno.8所示。

本發(fā)明的第三方面的內(nèi)容包括表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞，其含有上述的第二方面的核酸。

本發(fā)明第四方面內(nèi)容還包括上述的具有除草劑抗性的als蛋白、核酸、表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞在綠色植物抗除草劑方面的應(yīng)用。

其中，上述綠色植物為水稻、煙草、擬南芥、棉花等。

本發(fā)明第五方面的內(nèi)容還包括獲得具有除草劑抗性的植物的方法，包括如下步驟：

1)使植物包含本發(fā)明所述的核酸；或

2)使植物表達(dá)所述的蛋白。

其中，上述的方法，包括轉(zhuǎn)基因、雜交、回交或無性繁殖步驟。

本發(fā)明第六方面的內(nèi)容包括鑒定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸的植物、表達(dá)所述的蛋白的植物或所述的方法獲得的植物，具體包括以下步驟：

1)測(cè)定所述植物是否包含所述的核酸；或，

2)測(cè)定所述植物是否表達(dá)所述的蛋白。

有益效果：

1)本發(fā)明通過對(duì)突變株的als酶活測(cè)定結(jié)果來看，揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1的als活性比揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2的als活性高30％，比揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的als活性高31％。

2)本發(fā)明通過田間噴施als抑制劑類除草劑“百壟通”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有本發(fā)明的具有除草劑抗性的als蛋白的水稻3-4葉幼苗在施用3ml百壟通/l水(9倍推薦使用濃度)后，植株仍然正常生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)實(shí)，而野生型水稻3-4葉幼苗在施用1ml百壟通/3l水(1倍推薦使用濃度)30天后表現(xiàn)為整株死亡。

附圖說明

圖1百壟通除草劑篩選獲得的抗性水稻突變體1；

圖2pcr擴(kuò)增als基因結(jié)果圖；第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道為揚(yáng)州恢復(fù)系野生型水稻dna，第3泳道為抗除草劑突變體1的dna，第4泳道為抗除草劑突變體2的dna，第5泳道為抗除草劑突變體3的dna；目的片段長(zhǎng)度2091bp；

圖3百壟通除草劑對(duì)野生型和抗除草劑水稻抗除草劑突變體1、抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3的als酶活性抑制的吸光值測(cè)定；

圖4抗除草劑突變體1的als基因的過量表達(dá)載體bamhi/saci雙酶切驗(yàn)證圖；第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；第2泳道為未經(jīng)酶切的重組載體，第3泳道為重組載體經(jīng)bamhi/saci雙酶切后產(chǎn)生的基因片段和質(zhì)粒片段dna，基因片段大小符合預(yù)期，證明載體構(gòu)建成功；

圖5突變型als基因水稻pcr檢測(cè)圖；總共有8個(gè)泳道，第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；第2泳道為非轉(zhuǎn)基因野生型dna，作為陰性對(duì)照，第3泳道為質(zhì)粒dna，作為陽性對(duì)照，第4泳道為轉(zhuǎn)化抗除草劑突變體1als基因的轉(zhuǎn)基因植株dna，第5泳道為轉(zhuǎn)化抗除草劑突變體2als基因的轉(zhuǎn)基因植株dna，第6泳道為轉(zhuǎn)化抗除草劑突變體3als基因的轉(zhuǎn)基因植株dna。

圖6百壟通除草劑對(duì)野生型水稻和含有抗除草劑突變體1als基因的轉(zhuǎn)基因水稻、含有抗除草劑突變體2als基因的轉(zhuǎn)基因水稻和含有抗除草劑突變體3als基因的轉(zhuǎn)基因水稻的als酶活性抑制的吸光值測(cè)定；

圖7百壟通除草劑對(duì)野生型煙草和含有抗除草劑突變體1als基因的轉(zhuǎn)基因煙草、含有抗除草劑突變體2als基因的轉(zhuǎn)基因煙草和含有抗除草劑突變體3als基因的轉(zhuǎn)基因水稻的als酶活性抑制的吸光值測(cè)定；

圖8百壟通除草劑對(duì)雜交后代中的雜合植株、抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3的als酶活性抑制的吸光值測(cè)定。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：水稻抗咪唑啉酮類除草劑突變體獲取過程(百壟通)

將秈型常規(guī)水稻種子揚(yáng)州恢復(fù)系(購自江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái))(此為m0，用清水浸泡2小時(shí))150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(ems)室溫下浸泡6-9小時(shí)，期間每1小時(shí)搖動(dòng)一次種子；棄去ems溶液，自來水翻動(dòng)浸泡種子5次，每次5分鐘，然后用自來水沖洗種子過夜，次日進(jìn)行田間播種，并進(jìn)行常規(guī)肥水管理(此為m1)。植株成熟后，種子混收、晾干，過冬保存。次年播種田間。待水稻(此為m2)幼苗長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，噴施為3ml百壟通/l水(“百壟通”是德國巴斯夫公司生產(chǎn)一種水劑型咪唑啉酮類除草劑，推薦最低使用濃度為1ml百壟通/1.5～3l水)，30天后還呈正常綠色植株即為抗咪唑啉酮類除草劑的水稻突變體(圖1)。共計(jì)獲得抗除草劑的m2單株211株，這些抗性單株進(jìn)行常規(guī)肥水管理，有198個(gè)m2單株可正常結(jié)實(shí)，種子成熟后，單株收種、晾干，過冬保存。

實(shí)施例2：抗咪唑啉酮類除草劑水稻突變體突變位點(diǎn)分析

取上述實(shí)施例1獲得的抗除草劑水稻突變植株選取多個(gè)突變體葉片，分別提取基因組dna，送南京一道生物科技有限公司進(jìn)行基因組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與揚(yáng)州恢復(fù)系野生型als基因比較，發(fā)現(xiàn)上述水稻突變植株中有三組突變植株，即抗除草劑水稻突變體1、抗除草劑水稻突變體2和抗除草劑水稻突變體3，其中，抗除草劑水稻突變體1在als基因上發(fā)生了2個(gè)位點(diǎn)的突變，第1880、1883位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，分別由g變成a、g變成a，導(dǎo)致其相應(yīng)編碼的氨基酸序列的第627、628位點(diǎn)由絲氨酸變?yōu)樘於０?、甘氨酸變?yōu)楣劝彼?，即抗除草劑突變體1的als基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，其編碼的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示；抗除草劑突變體2在als基因的僅在第1880位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，分別由g變成a，導(dǎo)致其相應(yīng)編碼的氨基酸序列的第627位點(diǎn)分別由絲氨酸變?yōu)樘於０?，即抗除草劑突變體2的als基因的核苷酸序列如seqidno.3所示，其編碼的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示；抗除草劑突變體3在als基因的僅在第1883位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，由g變成a，導(dǎo)致其相應(yīng)編碼的氨基酸序列的第628位點(diǎn)分別由甘氨酸變?yōu)楣劝彼?，即抗除草劑突變體3的als基因的核苷酸序列如seqidno.5所示，其編碼的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示。

本發(fā)明的抗除草劑水稻突變體1其分類命名為水稻種子yxl-25(oryzasativaindicagroupyxl-25)，該菌株已于2017年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心(武漢大學(xué)第一附屬小學(xué)對(duì)面)，郵編：430072，保藏編號(hào)為cctccno：p201713。

本發(fā)明的抗除草劑水稻突變體3其分類命名為水稻種子yxl-63(oryzasativaindicagroupyxl-63)，該菌株已于2017年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心(武漢大學(xué)第一附屬小學(xué)對(duì)面)，郵編：430072，保藏編號(hào)為cctccno：p201712。

實(shí)施例3：抗咪唑啉酮類除草劑水稻突變體als基因克隆

取上述抗除草劑水稻突變體1、抗除草劑水稻突變體2和抗除草劑水稻突變體3的葉片，分別提取基因組dna。根據(jù)揚(yáng)州恢復(fù)系野生型als基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增als基因全長(zhǎng)的特異引物為：正向引物f5’-tcgcccaaacccagaaaccc-3’、反向引物r5’-ctctttatgggtcattcaggtc-3’。

采用takaraprimerstarmaxdnapolymerase聚合酶(購自takara公司)擴(kuò)增als基因，其反應(yīng)體系如下：

pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序采用兩步法，退火和延伸合為一起，采用68度。

程序如下：預(yù)變性：98℃3min；35個(gè)循環(huán)：變性98℃10sec；延伸68℃1min；保溫：72℃10min。

取2μlpcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有預(yù)期大小的片段后(圖2)，剩余的pcr產(chǎn)物經(jīng)pcr清潔試劑盒(購自axygen公司)清潔回收后，克隆至pmd19-t載體(購自takara公司)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。每個(gè)轉(zhuǎn)化隨機(jī)挑取12個(gè)大腸桿菌單克隆進(jìn)行pcr檢測(cè)，取pcr結(jié)果呈陽性的6個(gè)單克隆，送南京一道生物科技有限公司測(cè)序，獲得突變als基因序列，該基因片段長(zhǎng)度為2091bp，抗除草劑水稻突變體1als基因片段的測(cè)序結(jié)果如下：

ctgcatcgcgtgtcgccctttcgcccaaacccagaaaccctcgccgccgccgccgccgccatcacccaccatggctacgaccgccgcggccgcggccgccaccttgtccgccgccgcgacggccaagaccggccgtaagaaccaccagcgacaccacgtccttcccgctcgaggccgggtgggggcggcggcggtcaggtgctcggcggtgtccccggtcaccccgccgtccccggcgccgccggccacgccgctccggccgtgggggacggccgagccccgcaagggcgcggacatcctcgtggaggcgctggagcggtgcggcgtcagcgacgtgttcgcctacccgggcggcgcgtccatggagatccaccaggcgctgacgcgctccccggtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggcgaggcgttcgcggcgtccgggtacgcgcgcgcgtccggccgcgtcggggtctgcgtcgccacctccggccccggggcaaccaacctcgtgtccgcgctcgccgacgcgctgctcgactccgtcccgatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggcaccgacgccttccaggagacgcccatagtcgaggtcacccgctccatcaccaagcacaattaccttgtccttgatgtggaggacatcccccgcgtcatacaggaagccttcttcctcgcgtcctcgggccgtcctggcccggtgctggtcgacatccccaaggacatccagcagcagatggctgtgccagtctgggacacctcgatgaatctaccggggtacattgcacgcctgcccaagccacccgcgacagaattgcttgagcaggtcttgcgtctggttggcgagtcacggcgcccgattctctatgtcggtggtggctgctctgcatctggtgatgaattgcgccggtttgttgagctgaccggcatcccagttacaaccactctgatgggcctcggcaatttccccagtgatgatccgttgtccctgcgcatgcttgggatgcatggcacggtgtacgcaaattatgcggtggataaggctgacctgttgcttgcatttggcgtgcggtttgatgatcgtgtgacagggaaaattgaggcttttgcaagcagggccaagattgtgcacattgacattgatccagcggagattggaaagaacaagcaaccacatgtgtcaatttgcgcagatgttaagcttgctttacagggcttgaatgctctgctagaccagagcacaacaaagacaagttctgattttagtgcatggcacaatgagttggaccagcagaagagggagtttcctctggggtacaagacttttggtgaagagatcccaccgcaatatgctattcaggtgctggatgagctgacgaaaggggaggcaatcatcgctactggtgttggacagcaccagatgtgggcggcacaatattacacctacaagcggccacggcagtggctgtcttcggctggtctgggcgcaatgggatttgggctgcctgctgcagctggtgcttctgtggctaacccaggtgtcacagttgttgatattgatggggatggtagcttcctcatgaacattcaggagttggcattgatccgcattgagaacctcccggtgaaggtgatggtgttgaacaaccaacatttgggtatggttgtgcaatgggaggataggttttacaaggcaaatagggcgcatacatacttgggcaacccagaatgtgagagcgagatatatccagattttgtgactattgctaaagggttcaatattcctgcagtccgtgtaacaaagaagagtgaagtccgtgccgccatcaagaagatgctcgagaccccagggccatacttgttggatatcatcgtcccacaccaggagcatgtgctgcctatgatcccaaatgagggcgcattcaaggacatgatcctggatggtgatggcaggactatgtattaatctataatctgtatgttggcaaagcaccagcccggcctatgtttgacctgaatgacccataaagagaagggcgacacgcgatgcag

實(shí)施例4：水稻m3突變體抗咪唑啉酮類除草劑(百壟通)

將揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3收獲的種子播種出苗(此為m3)，待m3水稻幼苗長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，噴施3ml百壟通/l水(推薦最低使用濃度為1ml百壟通/3l水，相當(dāng)于9倍濃度)。噴施除草劑15天后，抗性苗m3呈正常綠色、能繼續(xù)長(zhǎng)高至20-30cm，而非抗性苗葉片失去綠色甚至部分枯黃，植株不長(zhǎng)高，只有5-9cm。30天后，m3抗性株均呈正常綠色植株，而噴施同樣濃度除草劑的野生型水稻都已全部枯死，表明突變水稻至少抗9倍濃度的百壟通除草劑。我們又對(duì)揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3噴施4ml百壟通/l水(相當(dāng)于12倍濃度)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)抗除草劑突變體1還是呈現(xiàn)正常綠色，而抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3部分植株已經(jīng)枯黃。表明含有同時(shí)含有ser627位點(diǎn)和gly628位點(diǎn)突變的抗除草劑突變體1的抗除草劑能力比抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3都要好。

實(shí)施例5：水稻m3抗除草劑突變體的als酶活測(cè)定

為了驗(yàn)證水稻突變體的除草劑抗性是否由als突變所致，本發(fā)明人進(jìn)行了als酶活性測(cè)定。測(cè)定方法參照singh等的方法(singhb.k.,stidhamm.a.,shanerd.l.assayofacetohydroxyacidsynthase.analyticalbiochemistry,1988,171:173-179.)。具體的，分別取野生型、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的m3植株葉片0.2g，在研缽中用液氮研磨粉碎，加入2ml提取液(100mmk2hpo4，ph7.5、10mm丙酮酸鈉、5mmedta、1mm纈氨酸、1mm亮氨酸、10mm半胱氨酸、0.1mm黃素腺嘌呤二核苷酸、5mm氯化鎂、10％(v/v)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解凍后繼續(xù)研磨1min左右。12000rpm、4℃離心30min，吸取上清液，加入硫酸銨使之達(dá)到50％飽和度，于冰上放置半小時(shí)，12000rpm、4℃離心30min，棄上清，將沉淀溶解于0.2ml反應(yīng)緩沖液(100mmk2hpo4,ph7.0、1mmedta、10mm氯化鎂、100mm丙酮酸鈉、1mm焦磷酸硫胺素、0.1mm黃素腺嘌呤二核苷酸)，分別得各植株的als提取液。

在獲得als提取液中分別加入10μl除草劑“百壟通”(水劑，有效成分240g/l)，混勻，37℃孵育1h，加0.1ml3m硫酸終止反應(yīng)，反應(yīng)混合物在60℃反應(yīng)孵育30分鐘便于脫羧。然后加0.4ml顯色液(0.09g/l1-萘酚和0.009g/l肌酸，用2.5mnaoh溶解)?；旌弦涸?7℃孵育30分鐘進(jìn)行顯色(als催化2個(gè)丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脫羧形成3-羥基丁酮，再與肌酸和1-萘酚形成粉紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在530nm處有最大吸收值)，隨后測(cè)定其530nm的吸光度，als活性用a530吸光值表示，a530吸光值的高低反映als活性的高低。實(shí)驗(yàn)以水為對(duì)照，野生型、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1和揚(yáng)州抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3都各測(cè)5個(gè)單株。

a530吸光值測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)野生型、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的als提取液中沒有als抑制劑百壟通時(shí)，它們的a530吸光值均在1.2-1.4間，表明野生型和突變體的als酶活性無顯著性差異(圖3)；而加入als抑制劑百壟通后，野生型的a530吸光值僅為0.2，揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1的a530吸光值為1.28，揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2的a530吸光值為0.98，揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的a530吸光值為0.97，即野生型的als酶活性僅為對(duì)照的16.4％，而揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3的als酶活性仍有75％以上(圖3)，表明揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的als對(duì)百壟通不敏感，從而賦予了抗性。從抗除草劑的效果來看，揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1的als活性比揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2高30％，比揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3高31％。因此揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1的抗除草劑效果比揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3都要好。

實(shí)施例6：轉(zhuǎn)基因als水稻抗百壟通

設(shè)計(jì)特異引物5’-cgcggatccatccgagccacacatcgcctc-3’和5’-tccccgcggcctacggaaaacaacacac-3’，其5’分別加入bamhi和saci酶切修飾位點(diǎn)。參考實(shí)施例3的方法，通過pcr從上述水稻突變體揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的基因組dna中擴(kuò)增出突變als基因，測(cè)序正確后，用bamhi和saci分別雙酶切突變als基因片段和植物表達(dá)載體pcambia1301質(zhì)粒(購自pcambia公司)，酶切產(chǎn)物用t4-dna酶(購自takara公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。重組質(zhì)粒提取dna，用bamhi和saci雙酶切驗(yàn)證，可以產(chǎn)生大的質(zhì)粒片段和小的基因片段(圖4)，證明已將核苷酸序列如seqidno.1或3或5所示的als基因克隆至植物表達(dá)載體pcambia1301質(zhì)粒(購自pcambia公司)中。將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105，培養(yǎng)菌體。采用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳型水稻日本晴(購自江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái))，獲得轉(zhuǎn)基因植株收種后，后代植株長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，pcr檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株(圖5)。pcr檢測(cè)引物為正向引物35sf5’-atggttagagaggcttacgc-3’，反向引物5r5’-agcaacaggtcagccttatccac-3’，擴(kuò)增片段涵括camv35s啟動(dòng)子和als基因的5’端序列，大小約2kb。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系參考實(shí)施例3，pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序采用兩步法，退火和延伸合為一起，采用68度。擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性：98℃3min；30個(gè)循環(huán)：變性98℃10sec；延伸68℃2min；保溫：72℃10min。經(jīng)pcr鑒定呈陽性后，噴施3ml百壟通/l水(9倍推薦使用濃度)，7天后，參照實(shí)施例6所述方法測(cè)定als酶活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的als酶活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因水稻；30天后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而非轉(zhuǎn)基因日本晴水稻則全部枯死。比較轉(zhuǎn)化揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的als基因的轉(zhuǎn)基因水稻后代植株的als酶活性，發(fā)現(xiàn)含有揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1的als基因的轉(zhuǎn)基因植株als酶活性比含有揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2的als基因的轉(zhuǎn)基因植株的als酶活高32％，比含有揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的als基因的轉(zhuǎn)基因植株的als酶活高34％(圖6)。

實(shí)施例7：轉(zhuǎn)基因als煙草抗百壟通

設(shè)計(jì)特異引物5’-cgcggatccatccgagccacacatcgcctc-3’和5’-tccccgcggcctacggaaaacaacacac-3’，其5’分別加入bamhi和saci酶切修飾位點(diǎn)。通過pcr從揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的基因組dna中擴(kuò)增出突變als基因，測(cè)序正確后，參照實(shí)施例7方法將核苷酸序列如seqidno.1或3或5所示的als基因克隆至植物表達(dá)載體pcambia2301質(zhì)粒(購自pcambia公司)中。挑選陽性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105，采用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化本氏煙葉盤，獲得轉(zhuǎn)基因植株收種后，后代植株長(zhǎng)至3-4葉期時(shí)，經(jīng)pcr鑒定呈陽性后，噴施3ml百壟通/l水(9倍推薦使用濃度)，7天后，參照實(shí)施例6所述方法測(cè)定als酶活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的als酶活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草；30天后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而非轉(zhuǎn)基因煙草則全部枯死。比較轉(zhuǎn)化揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1、抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3的als基因的轉(zhuǎn)基因煙草后代植株的als酶活性，發(fā)現(xiàn)含有揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1的als基因的轉(zhuǎn)基因植株als酶活性比含有揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2的als基因的轉(zhuǎn)基因植株的高31％，比含有揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3的als基因的轉(zhuǎn)基因植株的高27％(圖7)。

實(shí)施例8：抗性材料的雜交和鑒定

為了檢測(cè)是否具有2個(gè)突變位點(diǎn)的抗性植株比具有單個(gè)位點(diǎn)突變點(diǎn)的抗性植株的除草耐受能力更強(qiáng)，我們將實(shí)施例2中的單個(gè)位點(diǎn)突變進(jìn)行雜交，選擇僅含有ser627單個(gè)位點(diǎn)突變的揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和僅含有g(shù)ly628單個(gè)位點(diǎn)突變的的揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3在溫室種植，開花期將揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體2和揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體3進(jìn)行雜交。具體方法是將揚(yáng)州恢復(fù)系突變體2人工去雄并套袋，揚(yáng)州恢復(fù)系突變體3植株開花的時(shí)候，將穎殼剪掉，光下放置10分鐘，將父本花粉抖到揚(yáng)州恢復(fù)系突變體2的柱頭上，重復(fù)2次，待種子成熟后收種，即為f1代雜交植株。收獲的f1代雜交中繁殖一代后，收獲f2代群體，在該群體中鑒定同時(shí)攜帶有ser627和gly628位點(diǎn)突變的個(gè)體。用除草劑對(duì)雜合植株以及抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3親本同時(shí)進(jìn)行噴施實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，同時(shí)含有2個(gè)位點(diǎn)突變的植株相對(duì)于只含有單個(gè)位點(diǎn)突變的植株，對(duì)除草劑的抗性明顯提高。我們又對(duì)雜合植株、抗除草劑突變體2和抗除草劑突變體3的als酶活進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)雜合植株的als酶活性比抗除草劑突變體2高31％，比抗除草劑突變體3高25％(圖8)。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附專利要求極其任何等同物給出。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>使植物具有除草劑抗性的水稻als突變型蛋白、基因及其應(yīng)用

<130>sg20170620001

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1935

<212>dna

<213>水稻種子揚(yáng)州恢復(fù)系抗除草劑突變體1als基因

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1935)

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