本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域，涉及一種新型人鼠同源性非編碼rnaensmust00000139055以及在制備診斷肺纖維化疾病檢測試劑藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺纖維化（pulmonaryfibrosis，pf）是一種漸進(jìn)性疾病，由急、慢性肺間質(zhì)疾病演化而來，是多種間質(zhì)性肺病終末期的共同狀態(tài)及病理表現(xiàn)。隨著我國各類原因?qū)е碌姆卫w維化患病率不斷上升，肺纖維化已成為我國呼吸系統(tǒng)主要疾病之一，其晚期及急性加重狀態(tài)在急危重癥中的比例不斷升高，且與不良預(yù)后密切相關(guān)。

目前臨床診斷肺纖維化疾病主要包括以下幾種手段：一、影像學(xué)檢查：胸部高分辨ct（hrct）檢查，能細(xì)致的顯示肺部病變的位置、程度及性質(zhì)，對某些類型的肺纖維化如特發(fā)性肺纖維化等的診斷具有指導(dǎo)意義。二、肺功能檢查：肺功能檢查亦是診斷肺纖維化不可缺少的檢查項(xiàng)目，有助于了解肺通氣與彌散功能等情況，尤其是動態(tài)肺功能演變更能反映疾病的發(fā)展和預(yù)后。三、外科手術(shù)活檢：可根據(jù)肺活檢病理做出明確的疾病診斷。但目前的診斷手段和策略都很難做到早期診斷，往往在疾病進(jìn)展到一定程度以后，患者才因?yàn)榘Y狀逐漸明顯而得到確診和治療。呼吸困難是肺纖維化最常見癥狀。輕度肺纖維化時(shí)，呼吸困難常在劇烈活動時(shí)出現(xiàn)，因此常常被忽視或誤診為其他疾病。當(dāng)肺纖維化進(jìn)展時(shí)，在靜息時(shí)也發(fā)生呼吸困難，嚴(yán)重的肺纖維化患者可出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難。肺組織纖維化的嚴(yán)重后果，導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變，功能喪失。當(dāng)大量沒有氣體交換功能的纖維化組織代替肺泡，導(dǎo)致氧不能進(jìn)入血液?；颊吆粑粫?，缺氧、酸中毒、喪失勞動力，嚴(yán)重者最后可致死亡。由于肺纖維化后期所帶來的嚴(yán)重后果，因此，及早的對其進(jìn)行診斷具有重要意義，早期診斷，從而做到早期預(yù)防和早期治療以期待獲得更好的治療效果。但在早期階段，由于現(xiàn)有技術(shù)的限制，常被漏診甚至誤診為其他疾病，容易延誤最佳的治療時(shí)期，成為目前臨床上呼吸系統(tǒng)疾病的難點(diǎn)之一。

近年來表觀遺傳學(xué)成為多種疾病研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)，且逐漸成為肺纖維化研究的一個(gè)重要方向。表觀遺傳學(xué)是指在基因組dna序列不變的情況下，通過改變dna甲基化、組蛋白修飾、染色體結(jié)構(gòu)參與基因表達(dá)調(diào)控的一種可逆、可遺傳的遺傳信息。目前已知，人體基因組中的98%不編碼蛋白質(zhì)的基因組dna大多可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼rna(non-codingrna，ncrna)。而這些ncrna即介導(dǎo)和參與了表觀遺傳學(xué)的機(jī)制。根據(jù)成熟轉(zhuǎn)錄本大小的不同，ncrna可分為小分子ncrna(如sirna、mirna、pirna等)，中等長度ncrna(70-200nt)和長ncrna(longncrna，lncrna，≥200nt)。目前，ncrna領(lǐng)域研究較多的是小分子ncrna，而對lncrna的研究還處于起步階段。長鏈非編碼rna（longnon-codingrna，lncrna）是一類長度大于200nt、自身不編碼蛋白、且物種間相對保守的rna，已知其可參與x染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種重要生物過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過構(gòu)建小鼠肺纖維化模型，應(yīng)用lncrnamicroassay技術(shù)（mouselncrnamicroarrayv2.0,arraystar.inc，探針覆蓋31,423條lncrna、25,376條編碼基因），開展小鼠正常肺組織、纖維化肺組織之間差異lncrna的篩選，通過序列分析，共得到纖維化肺組織相對正常肺組織高表達(dá)5倍以上的lncrna有513條、低表達(dá)5倍以上的lncrna有204條。對芯片檢測到的具有人鼠同源性的，差異表達(dá)基因、同時(shí)又被預(yù)測為差異lncrna可能調(diào)控靶標(biāo)的編碼基因，進(jìn)行g(shù)o和pathway生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一條lncrna-ensmust00000139055，其核酸序列如seqidno.1所示。經(jīng)定量pcr檢測結(jié)果表明此lncrna在肺纖維化組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)。構(gòu)建lncrna的質(zhì)粒過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染人肺泡上皮細(xì)胞a549，結(jié)果表明其明顯促進(jìn)了肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition,emt）過程，表現(xiàn)為：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞中成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma、n-cadherin表達(dá)增加；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin、epcam、krt-5表達(dá)下降；細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物：mmp-2、mmp-9表達(dá)增加。使用該lncrna、的質(zhì)粒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞（hbec）所獲得的結(jié)果與a549細(xì)胞系的結(jié)果一致。

本發(fā)明的目的之一是提供一種人鼠同源性肺纖維化相關(guān)的長鏈非編碼rna（longnon-codingrna，lncrna），命名為lncrna-ensmust00000139055，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明所提供的lncrna，通過q-rtpcr方法獲得證實(shí)，顯著高表達(dá)于纖維化組織，這一新型的lncrna將進(jìn)一步豐富肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究，也為肺纖維化的早期診斷及預(yù)后檢測提供了新的檢測靶點(diǎn)。

本發(fā)明所提供的人源lncrna的編碼dna序列定位于hoxa3基因的第2個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，轉(zhuǎn)錄方向與hoxa3相反。hoxa3基因位于人類染色體7p15-p14，屬于i型同源盒基因（hox基因）a簇基因的一部分，編碼dna結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，是參與組織纖維化過程的重要因子?？梢酝ㄟ^其特異的“時(shí)空”表達(dá)模式?jīng)Q定細(xì)胞的定向分化與增殖；hoxa3可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的遷移，促進(jìn)血管再生和損傷修復(fù)、hoxa3能抑制nf-κb通路的多個(gè)成員的表達(dá)，特別是能夠通過抑制tnf-α的表達(dá)，抑制慢性損傷的過度炎癥應(yīng)答反應(yīng)，從而對異常損傷修復(fù)及纖維化的發(fā)生發(fā)展具有保護(hù)作用。該lncrna存在人同源序列；在人肺泡上皮細(xì)胞株a549或者人支氣管上皮細(xì)胞hbec中過表達(dá)該lncrna不僅可以抑制其靶基因hoxa3的表達(dá)，還能夠誘導(dǎo)纖維化標(biāo)志性蛋白的表達(dá)改變，該lncrna通過參與調(diào)節(jié)hoxa3，在肺纖維化形成中發(fā)揮的重要作用，為早期肺纖維化的治療提供新分子標(biāo)記與藥物靶點(diǎn)。

本發(fā)明提供的lncrna序列，既可以通過生物學(xué)方法獲得，又可通過化學(xué)合成方法獲得，若通過化學(xué)合成方法制備，只要將其核苷酸序列提供給相關(guān)專業(yè)公司，委托其合成即可。為增強(qiáng)其穩(wěn)定性、生物利用度、組織靶向性等藥學(xué)特征，可對其進(jìn)行硫代修飾或甲氧基修飾等。

本發(fā)明提供的人肺纖維化相關(guān)的lncrna，包括與其90％以上同源的核苷酸序列，或經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列，可用于制備診斷肺纖維化疾病的試劑。

本發(fā)明的目的之二是提供所述lncrna用于制備診斷或輔助診斷肺纖維化的藥物或試劑盒的用途。

本發(fā)明目的之三在于提供了一種用于診斷肺纖維化的芯片試劑盒，其中包括：負(fù)載有所述lncrna序列的檢測芯片。

所述芯片試劑盒還包括用于提取rna、pcr、雜交、顯色等所需的試劑，包括但不限于：抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液、抗體等，以及標(biāo)記rna樣品的標(biāo)記物、以及與所述標(biāo)記物相對應(yīng)的底物。

所述的芯片試劑盒中還可包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷肺纖維化的試劑盒，其中包括：

1）用于擴(kuò)增該lncrna的特異性引物對；

2）標(biāo)準(zhǔn)dna模板或負(fù)載有權(quán)利要求1所述長鏈非編碼rna的檢測芯片；

3）pcr反應(yīng)體系。

優(yōu)選地，所述特異性引物對包括上游引物和下游引物，上游引物序列為seqidno.2，下游引物序列為seqidno.3。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)體系包括dntp、pcr緩沖液和dna聚合酶。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)體系為熒光定量pcr反應(yīng)液，包含熒光染料。

進(jìn)一步地，所述試劑盒的使用方法：上游引物(10μmol/l)1.0μl，下游引物(10μmol/l)1.0μl，肺組織/血液樣本cdna0.3μl，dna聚合酶(5u/μl)0.2μl，ddh2o19μl；反應(yīng)參數(shù)均為：94℃3min(預(yù)變性)；94℃30sec(變性)，64℃30sec(復(fù)性)，72℃60sec(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30次循環(huán)。

本發(fā)明目的之四在于提供一種檢測所述lncrna的方法，包括如下步驟：

1）提取樣品總rna；

2）制備樣品cdna；

3）擴(kuò)增lncrna。

本發(fā)明目的之五在于提供一種檢測肺纖維化的方法，包括如下步驟：

1）提取樣品總rna；

2）制備樣品cdna；

3）定量擴(kuò)增lncrna，并根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行判斷。

檢測所用樣品為全血或肺組織，由于肺組織非常難以獲得，故本發(fā)明所述方法還可通過全血進(jìn)行診斷，且診斷準(zhǔn)確率與采用肺組織相當(dāng)，大大增加了診斷的便捷性、可操作性和可靠性。

本發(fā)明目的之六在于提供所述lncrna作為肺纖維化藥物新靶點(diǎn)的用途。

附圖說明

圖1是定量pcr檢測本發(fā)明所述lncrna在肺纖維化組織以及正常對照組織中的表達(dá)結(jié)果圖。

圖2是對轉(zhuǎn)染lncrna過表達(dá)載體的人肺泡上皮細(xì)胞株a549，轉(zhuǎn)入空載pex-3的細(xì)胞株和不轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞株進(jìn)行定量pcr檢測lncrna表達(dá)結(jié)果圖。

圖3對轉(zhuǎn)染lncrna過表達(dá)載體的人肺泡上皮細(xì)胞株a549和轉(zhuǎn)入空載pex-3的細(xì)胞株在72小時(shí)之后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖像。

圖4是對轉(zhuǎn)染lncrna過表達(dá)載體的人肺泡上皮細(xì)胞株a549和轉(zhuǎn)入空載pex-3的細(xì)胞株進(jìn)行定量pcr檢測成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin、epcam、krt-5；細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物：mmp-2andmmp-9表達(dá)的結(jié)果。

圖5是對轉(zhuǎn)染lncrna過表達(dá)載體的人肺泡上皮細(xì)胞株a549和轉(zhuǎn)入空載pex-3的細(xì)胞株進(jìn)行westernblot檢測預(yù)測靶基因hoxa3以及成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma、n-cadherin；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin、connexin43表達(dá)的結(jié)果圖。

圖6是對轉(zhuǎn)染lncrna過表達(dá)載體的人肺泡上皮細(xì)胞株a549和轉(zhuǎn)入空載pex-3的細(xì)胞株進(jìn)行免疫熒光檢測成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin表達(dá)的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但并不限定于本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接或間接導(dǎo)出的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。下屬實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如sambrook等著的分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)，freshney著的動物細(xì)胞培養(yǎng)：基本技術(shù)指南第五版(johnwiley&sons，inc，2005)中所述的條件及實(shí)驗(yàn)步驟，或按照制造廠商所建議的條件及實(shí)驗(yàn)步驟。若無特別說明，下述實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料，均為常規(guī)材料和化學(xué)試劑。

實(shí)施例1：lncrna序列的克隆與分析

1、試劑

trizol試劑購自美國invitrogen公司；mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶dna聚合酶、dna連接酶、pfu酶、ecori酶、bamhi酶均購自立陶宛fermentas公司；隨機(jī)引物購自美國promega公司；rneasy抽提試劑盒、dna凝膠回收試劑盒、中量抽提試劑盒、quantitectsybrgreenpcr試劑盒均購自德國qiagen公司；mouselncrnamicroarrayv2.0芯片購自上?？党缮锕?；pcr引物由invitrogen公司合成。

2、試劑、菌株、細(xì)胞株和載體

pcr-blunt-topo載體購自美國invitrogen公司；balb/c鼠，spf(specificpathogen-free，無特定病原體)級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

3.1肺纖維化組織總cdna文庫的構(gòu)建

3.1.1小鼠纖維化肺組織及正常肺組織總rna的提取

使用trizol試劑以及根據(jù)rneasy抽提試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟。將收獲的肺組織加入1mltrizol試劑裂解，裂解時(shí)用槍吸打幾次；每50-100mg組織樣品，加入1ml的trizol試劑，用電動勻漿器進(jìn)行勻漿；所加樣品體積不能超過勻漿此樣品所使用的trizol試劑體積的10％；在上述的trizol中加入0.2ml氯仿，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘，4℃下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入新的無rna酶離心管中；加入與上述上層水相等體積的異丙醇，混勻后，4℃條件下靜置20分鐘，然后4℃下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉淀；在上述沉淀中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％的乙醇1ml，顛倒數(shù)次，4℃下12000rpm離心5分鐘，棄上清；再次4℃下12000rpm離心2分鐘；棄上清，室溫下干燥1～2分鐘，加20μl無rna酶水溶解，得到rna提取液，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3.1.2逆轉(zhuǎn)錄(rt)

在500μlep管中加入以下組分：

肺組織提取rna10μl；

隨機(jī)引物(10μmol/l)1μl；

h2o18μl。

混勻后70℃溫育5min，迅速置冰浴中，靜置3min后加樣如下：

rnase抑制劑1μl；

dntp(10mmol/l)1μl；

5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8μl；

mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶1μl；

混勻后42℃溫育1h，70℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，-20℃保存樣品。

3.1.3肺纖維化組織總cdna文庫的構(gòu)建

將本實(shí)施例3.1.2所得單鏈cdna經(jīng)dna聚合酶及pfu酶處理得到平末端雙鏈cdna(操作步驟見dna聚合酶、pfu酶操作手冊)。所得平末端雙鏈cdna連接到pcr-blunt-topo載體上，構(gòu)建肺纖維化組織總cdna文庫。

3.2lncrnamicroarray技術(shù)與分析

使用3.1.1中提取的兩類組織的總的rna，用agilent公司的快速amp標(biāo)記試劑盒標(biāo)記rna，與芯片上的探針雜交；收集芯片的數(shù)據(jù)，用agilentgenespringgxv12.0軟件分析數(shù)據(jù)篩選出絕對信號值大、組間差異倍數(shù)大、組內(nèi)樣本間表達(dá)異質(zhì)性小的lncrna。采用go分析和pathway分析挑選出與肺纖維化過程有著密切關(guān)系的lncrna，即所述lncrna，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

實(shí)施例2q-rtpcr驗(yàn)證所述lncrna在纖維化肺組織和正常組織中的差異表達(dá)

1、以鼠纖維化肺組織及正常肺組織為材料，用trizol試劑分別提取纖維化肺組織及正常肺組織的總rna(方法同實(shí)施例1中的3.1.1)。將纖維化肺組織總rna和正常肺組織總rna各取1μg，用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(方法同實(shí)施例1中的3.1.2)獲纖維化肺組織及正常肺組織的總cdna，合成的纖維化肺組織及正常肺組織的總cdna即為定量pcr反應(yīng)的模板。

2、所述lncrna的特異性引物序列如下：

f:5’–gcaagaagccctgttgtctc-3’；r:5’–cgtcgtctctcttcccactc-3’。

3、pcr的反應(yīng)體系為：

pcr緩沖液(10×)2.5μl；

dntp(2.5mmol/l)1.0μl；

上游引物(10μmol/l)1.0μl；

下游引物(10μmol/l)1.0μl；

肺組織cdna0.3μl；

dna聚合酶(5u/μl)0.2μl；

ddh2o19μl。

反應(yīng)參數(shù)均為：94℃3min(預(yù)變性)；94℃30sec(變性)，64℃30sec(復(fù)性)，72℃60sec(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30次循環(huán)。

rt-pcr擴(kuò)增獲得的序列如序列表中seqidno：1所示。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

纖維化肺組織及正常肺組織lncrna的表達(dá)情況見圖1，可以看出，該lncrna在幾種模型的纖維化肺組織中高表達(dá)而在正常肺組織中低表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該lncrna在纖維化肺組織和正常肺組織表達(dá)水平的值接近一倍，存在明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，通過多次試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明，陽性檢出率可達(dá)100%，因而lncrna在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)功能，可以作為纖維化肺組織診斷的標(biāo)志物，用作纖維化肺組織的篩查。

實(shí)施例3：所述lncrna的過量表達(dá)促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)間充質(zhì)細(xì)胞生長特性

1、試劑

采用常規(guī)的試劑，與實(shí)施例1相同。

2、菌株、細(xì)胞株和載體

lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國invitrogen公司；dmem培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國gibico公司；硝基藍(lán)四唑(nitrobluetetrazolium，nbt)購自美國sigma公司。

人肺泡上皮細(xì)胞株a549購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(atcc)；e.colibl2菌株購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；真核表達(dá)載體pex-3購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

3.1用pcr方法得到該lncrna序列片段

3.1.1oligo設(shè)計(jì)，目的基因上下游引物分別加上ecori和bamhi及保護(hù)堿基，用于載體的亞克隆，oligo序列如下

3.1.2引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成

3.1.3將oligo溶解成50μm，將oligo分別取相同體積至一1.5ml離心管，混合均勻，配成oligomix

3.1.4用配制好的oligomix進(jìn)行第一輪pcr反應(yīng)，

pcr體系如下：

oligomix6μl；

10×pfubuffer(＋mg2＋)5μl；

dntp1μl；

b1294-11μl；

b1294-261μl；

ddh2o36μl；

pfudnapolymerase0.3μl。

循環(huán)條件：

95℃3min(預(yù)變性)；94℃30sec(變性)，55℃30sec(復(fù)性)，72℃30sec(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30次循環(huán)。

3.1.5用b1294-1和b1294-26進(jìn)行第二輪pcr反應(yīng)，模板為第一輪pcr反應(yīng)的產(chǎn)物。

pcr體系如下：

第一輪pcr產(chǎn)物1μl；

10×pfubuffer(＋mg2＋)5μl；

dntp1μl；

b1294-11μl；

b1294-261μl；

ddh2o41μl；

pfudnapolymerase0.3μl。

反應(yīng)條件與第一輪相同。第一輪pcr可得到混有目的基因條帶的非單一條帶pcr產(chǎn)物混合物，再用第一輪的pcr產(chǎn)物為模板，通過第二輪pcr則可獲得單一的目的基因條帶。

3.1.6pcr反應(yīng)完成后，利用agarose電泳并切膠回收該lncrna基因片段。

3.2目的基因lncrna克隆到載體pex-3中

3.2.1用ecori和bamhi對ensmust00000139055基因片段進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時(shí)，酶切體系如下：

10×buffer5μl；

dna15μl；

ecori1μl；

bamhi1μl；

ddh2o28μl。

3.2.2用ecori和bamhi對載體pex-3進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時(shí)，酶切體系如下：

10×buffer5μl；

pex-35μl；

ecori1μl；

bamhi1μl；

ddh2o38μl。

3.2.3電泳，用dna凝膠回收試劑盒回收ensmust00000139055基因片段和載體pex-3。

3.2.4用t4dnaligase連接雙酶切得到的ensmust00000139055基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時(shí)，連接體系如下：

t4dnaligasebuffer2μl；

pex-32μl；

a05rik5μl；

t4dnaligase1μl；

ddh2o10μl。

3.2.5感受態(tài)細(xì)胞的制備：（氯化鈣法）

3.2.5.1從于37℃培養(yǎng)16小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mllb培養(yǎng)基的1l燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)／分)。

3.2.5.2在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。

3.2.5.3于4℃，以4000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，回收細(xì)胞。

3.2.5.4倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

3.2.5.5以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol／lcacl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。

3.2.5.6于4℃，以4000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，回收細(xì)胞。

3.2.5.7倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

3.2.5.8每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/lcacl2(含20%甘油)重懸每份細(xì)胞沉淀。

3.2.5.9將細(xì)胞分裝成小份(100μl/支)，放于-70℃凍存。

（感受態(tài)細(xì)胞制備參考：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版55頁）

3.2.6將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

3.2.6.1從-70℃中取出感受態(tài)細(xì)胞，將裝有感受態(tài)細(xì)胞的離心管冰上放置4分鐘，待感受態(tài)細(xì)胞解凍后，加入10μl連接產(chǎn)物，輕柔混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。

3.2.6.2將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，放置90秒，不要搖動離心管。

3.2.6.3快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3分鐘。

3.2.6.4向每支離心管加入800μllb培養(yǎng)基(不含抗生素)，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床，250轉(zhuǎn)/分鐘，培育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇。

3.2.6.5取200μl培育后的細(xì)胞均勻涂布于含50μg/mlkanamycinlb平板上。

3.2.6.6等平板上液體被吸收后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16小時(shí)。

3.2.7從平板上挑取克隆菌落，小抽質(zhì)粒并做鑒定挑出陽性克隆。

3.2.7.1從培養(yǎng)好的平板上挑取4個(gè)單獨(dú)、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/mlkanamycin)lb培養(yǎng)基的試管中，

3.2.7.2將上述試管置于細(xì)菌搖床中培養(yǎng)，37℃，250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)16小時(shí)。

3.2.7.3將培養(yǎng)好的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化，dp104-02)抽提質(zhì)粒，（質(zhì)粒抽提步驟詳見質(zhì)粒小提試劑盒說明書）。

3.2.7.4將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，每管反應(yīng)體系如下：

10×buffer1μl；

質(zhì)粒1μl；

ecori0.5μl；

bamhi0.5μl；

ddh2o7μl。

3.2.7.5酶切37℃，1小時(shí)后電泳，在目的條帶大小對應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶對應(yīng)的克隆即為陽性克隆。

3.3重組質(zhì)粒測序驗(yàn)證并大量抽提

3.3.1取200μl陽性克隆對應(yīng)的菌液送測序，并將剩余的菌液用甘油保存。

3.3.2將測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對，正解無誤后，用保存的甘油菌液接菌lb培養(yǎng)基，進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提，得到足夠量的重組質(zhì)粒。

3.4構(gòu)建單克隆人肺泡上皮細(xì)胞株a549-lncrna-ensmust00000139055

用含5％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基將人肺泡上皮細(xì)胞株a549培養(yǎng)于5％co2的37℃培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前一天于6孔板中接入1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔，用lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pex3-lncrna-ensmust000001390554μg。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞。同時(shí)以空載體pex-3轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞(見lipofectamine2000說明書)，得到對照細(xì)胞株a549-pex-3。

3.5單克隆人肺泡上皮細(xì)胞株中該lncrna的表達(dá)量檢測

以常規(guī)半定量rt-pcr檢測各單克隆人肺泡上皮細(xì)胞株中該lncrna的表達(dá)量，并以轉(zhuǎn)入空表達(dá)載體pex-3的肺泡上皮細(xì)胞株a549-pex-3作為對照。

50μl半定量pcr反應(yīng)體系，其組分為：

pcr緩沖液(10×)5μl

mgcl2(25mm)5μl

dntp(2.5mmol/l)1.0μl

上游引物(10μmol/l)0.5μl

下游引物(10μmol/l)0.5μl

模板(a549-lncrna-ensmust00000139055或a549-pex-3的cdna)2μl

dna聚合酶(5u/μl)0.4μl

ddh2o35.6μl

所有pcr的反應(yīng)參數(shù)為：94℃3min(預(yù)變性)；94℃30ec(變性)，64℃30sec(復(fù)性)，72℃60sec(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸×ncycles。循環(huán)次數(shù)根據(jù)pcr反應(yīng)的起跳點(diǎn)確定，一般情況下，每次具體的pcr反應(yīng)較起跳點(diǎn)多1-2個(gè)循環(huán)。

圖2是對轉(zhuǎn)染所述lncrna過表達(dá)載體的人肺泡上皮細(xì)胞株a549，轉(zhuǎn)入空載pex-3的細(xì)胞株和不轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞株進(jìn)行定量pcr檢測該lncrna表達(dá)結(jié)果圖。圖2表明，與轉(zhuǎn)染空表達(dá)載體相比，轉(zhuǎn)染該lncrna過表達(dá)載體的ensmust00000139055表達(dá)量達(dá)300倍以上。

3.6所述lncrna過量表達(dá)的人肺泡上皮細(xì)胞株a549細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測

將本實(shí)施例3.4構(gòu)建的單克隆人肺泡上皮細(xì)胞株a549-lncrna-ensmust00000139055和轉(zhuǎn)入空表達(dá)載體pex-3的細(xì)胞株a549分別以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的數(shù)量接入在6孔板中用1ml含5％胎牛血清的dmem培養(yǎng)，培養(yǎng)于5％co2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，相差顯微鏡下檢查細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，見圖3，與轉(zhuǎn)染空表達(dá)載體pex-3的a549細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pex-3-lncrna-ensmust00000139055的a549細(xì)胞過量表達(dá)該lncrna可以顯著促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的形態(tài)學(xué)變化，從多角形、鵝卵石樣上皮細(xì)胞形態(tài)特征轉(zhuǎn)化為細(xì)長、紡錘形等為特征的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，提示增強(qiáng)了a549細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的生長特性。

3.7lncrna-ensmust00000139055過量表達(dá)促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)間充質(zhì)細(xì)胞生長特性

細(xì)胞制備過程同實(shí)施例2中的3.6所述方法，使用westernblot方法檢測過量表達(dá)所述lncrna之后，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)：包括成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin、epcam、krt-5；細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物：mmp-2、mmp-9。如圖4。

圖4表明：過量表達(dá)該lncrna后，明顯促進(jìn)了肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，表現(xiàn)為：誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞中成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma表達(dá)增加；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin、epcam、krt-5表達(dá)下降；細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物：mmp-2、mmp-9表達(dá)增加。這表明該lncrna對肺纖維化的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。

細(xì)胞制備過程同實(shí)施例2中的3.6所述方法，使用westernblot方法檢測過量表達(dá)該lncrna之后，靶基因hoxa3和肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)記物的蛋白表達(dá)量的影響：成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma、n-cadherin；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin，connexin43，如圖5。

圖5表明：過量表達(dá)該lncrna后，明顯促進(jìn)了肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，表現(xiàn)為：誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞中成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、α-sma、n-cadherin表達(dá)增加；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin、connexin43表達(dá)下降；這從蛋白層面進(jìn)一步表明該lncrna對肺纖維化的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。

細(xì)胞制備過程同實(shí)施例2中的3.6所述方法，使用免疫熒光方法檢測過量表達(dá)所述lncrna之后，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)記物的影響：成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin、上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin表達(dá)的結(jié)果圖。如圖6。

圖6表明：過量表達(dá)所述lncrna后，細(xì)胞標(biāo)記物發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為：誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞中成纖維母細(xì)胞標(biāo)記物：vimentin表達(dá)增加；上皮細(xì)胞標(biāo)記物：e-cadherin表達(dá)下降。

實(shí)施例4：lncrna-ensmust00000139055的差異表達(dá)對肺纖維化進(jìn)行篩查的實(shí)施例

4.1試劑、樣本和載體

以人全血標(biāo)本為材料，用trizol試劑提取全血標(biāo)本的總rna(方法同實(shí)施例1中的3.1.1)。將全血樣本總rna取1μg，用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(方法同實(shí)施例1中的3.1.2)獲樣本總cdna，合成的總cdna即為定量pcr反應(yīng)的模板。

4.2lncrnaensmust00000139055的特異性引物序列如下：

f:5’–gcaagaagccctgttgtctc-3’；r:5’–cgtcgtctctcttcccactc-3’。

4.3pcr的反應(yīng)體系為：

pcr緩沖液(10×)2.5μl；

dntp(2.5mmol/l)1.0μl；

上游引物(10μmol/l)1.0μl；

下游引物(10μmol/l)1.0μl；

肺組織cdna0.3μl；

dna聚合酶(5u/μl)0.2μl；

ddh2o19μl。

反應(yīng)參數(shù)均為：94℃3min(預(yù)變性)；94℃30sec(變性)，64℃30sec(復(fù)性)，72℃60sec(延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30次循環(huán)。

rt-pcr擴(kuò)增獲得的序列如序列表中seqidno：1所示。根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行判斷即可，判斷準(zhǔn)確率高達(dá)100%。

實(shí)施例5

lncrna-ensmust00000139055的差異表達(dá)對肺纖維化進(jìn)行篩查的實(shí)施例

另一方面，本發(fā)明還提供了一種通過所述lncrna芯片檢測人全血中該lncrna的方法，包括步驟：

5.1提取分離自人全血樣本的rna樣品，在所述的rna上設(shè)置標(biāo)記物；

5.1.1其中提取rna的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，包括trizol法；更優(yōu)選的，在從人全血樣本中分離出rna樣品后，對rna樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，以富集具有一定長度的rna，所述長度一股在150-250之間。在經(jīng)過上述處理后，利用這些小片段rna進(jìn)行后續(xù)的雜交，這樣可提高芯片捕獲lncrna的準(zhǔn)確性。

5.1.2本領(lǐng)域人員可方便地分離出具有一定片段長度的rna，比如可采用凝膠電泳法來分離。對rna進(jìn)行標(biāo)記也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，其可通過在雜交時(shí)加入與rna特異性結(jié)合的標(biāo)記物的方法實(shí)現(xiàn)，所述標(biāo)記物比如是標(biāo)記基團(tuán)。所述的標(biāo)記基團(tuán)包括但不限于：地高辛分子(dig)、生物素分子(bio)、熒光素及其衍生生物分子(fitc等)、其它熒光分子(如cy3、cy5等)、堿性磷酸酶(ap)、辣根過氧化物酶(hrp)等。這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)。

5.2將5.1的rna與所述的芯片接觸，使所述的rna與固相載體上的寡核苷酸探針發(fā)生雜交反應(yīng)，從而在固相載體上形成“寡核苷酸探針-rna”二元復(fù)合物；

5.2.1將上述的rna與lncrnaa05rik芯片進(jìn)行雜交時(shí)，可以先將lncrna-ensmust00000139055芯片與預(yù)雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交；

5.2.2本發(fā)明所述的rna與lncrna-ensmust00000139055芯片之間的固相雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本領(lǐng)域一股人員依據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣本濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時(shí)間等的最適條件?；蛘咭部梢詤⒄铡斗肿涌寺?shí)驗(yàn)指南》中所述的；

5.3檢測5.2形成的二元復(fù)合物的標(biāo)記物，可根據(jù)標(biāo)記信號在lncrna芯片上的位置、強(qiáng)度等信息獲取待測信息。若擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光基團(tuán)標(biāo)記，也可直接用熒光檢測設(shè)備(如激光共聚焦掃描儀scanarray3000等)獲取待測信息。從而確定人組織中相應(yīng)的lncrna的含量，最后根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行判斷即可，判斷準(zhǔn)確率高達(dá)100%。

序列表

<110>張勁松

<120>一種長鏈非編碼rnaensmust00000139055及其應(yīng)用

<160>3

<210>1

<211>575

<212>rna

<213>homosapiens

<400>1

aggtgcaagagctgaagcgagttgaggaggctgaactgagaacaggatgcaagaagccct60

gttgtctctacaccacaagacgcagaatttgtacattattttttcatttaaagacttgga120

accttcctatattgcagttgatggaggtgctgaggagagctaaatgtgcctcctttatta180

ggcgctattgtgagacctccaccccagagtgggaagagagacgacgcctgcacaaaaccc240

ggcttcgaatccagtaacttcgcgtttcagaacaatcaccaaacaaaaacaagtttgaga300

tacaataagaccctgcctggtctaattgtcaatcggtcttttctaacttttccctccctt360

ctccttttggatgctgtttcctcgtgcaggatctaaaccaagggctatatttacagacca420

gcccgcgattgctgaaaaattagcattttaacgatatcagtagctctggaaaggagagag480

aagggactgttgcctgccatttggtaattgaaatttgatgggtaaactaattatgccatt540

attattaacaaataaattacttattaattccacct575

<210>2

<211>20

<212>rna

<213>人工合成

<400>2

gcaagaagccctgttgtctc20

<210>3

<211>20

<212>rna

<213>人工合成

<400>3

cgtcgtctctcttcccactc20