專利名稱：具毒殺植物線蟲活力的生防真菌Gloeotinia的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毒殺植物寄生線蟲的真菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲在世界上許多國家和地區(qū)發(fā)生和為害，種類多種多樣。在全球范圍內(nèi)，植物寄生線蟲的發(fā)生與危害隨著農(nóng)林業(yè)的發(fā)展和耕作栽培制度的變化日益嚴(yán)重，據(jù) hser統(tǒng)計(jì)，到1990年為止全世界已報道發(fā)現(xiàn)植物寄生線蟲207屬4832種(劉維志，段玉璽.2000.植物病原線蟲學(xué).北京中國農(nóng)業(yè)出版社，pl-2)。據(jù)估計(jì)，植物寄生線蟲造成世界主要農(nóng)作物的年損失率為12.3%，超過1000億美元，而實(shí)際的損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過估計(jì)，理由是許多線蟲造成的危害因沒有剛間可見癥狀或?qū)；蕴卣鞫匆鹱⒁?Sasser，1986)， 此外，世界范圍內(nèi)對線蟲為害的新發(fā)現(xiàn)還在不斷增加，而且一些更新的農(nóng)業(yè)栽培體制使線蟲問題更加突出，再者，線蟲與其它生物相互作用而對植物產(chǎn)生的直接或間接影響還在急劇增加。在我國主要有根結(jié)線蟲、大豆胞囊線蟲、松材線蟲、甘薯莖線蟲等病原線蟲造成嚴(yán)重危害，尤其根結(jié)線蟲是世界農(nóng)業(yè)上為害最大的一類病原線蟲，病害發(fā)生后，一般減產(chǎn)10% 左右，嚴(yán)重的高達(dá) 75% 以上，甚至絕收(Whitehead A. G. , 1998. Plant Nematode Control. ISBN0851991882CAB hternational)。目前，植物寄生線蟲的防治仍以化學(xué)防治為主，但近年來化學(xué)殺線劑的應(yīng)用浪費(fèi)大，污染環(huán)境，高毒高殘留，破壞土壤生物區(qū)系等弊端日益為人們所重視(張克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和細(xì)菌在線蟲生防中的作用及其研究進(jìn)展.殺蟲微生物.3 55-66)，一些有效的化學(xué)殺線劑的應(yīng)用陸續(xù)受到限制，因此對植物寄生線蟲的生物防治研究自然成為熱點(diǎn)問題。早在60年代Olthof等在觀察食線蟲真菌Arthrobotrys oligospora Fres.捕食線蟲的過程中提出了真菌產(chǎn)生殺線蟲代謝物質(zhì)的假說。1984年Thorn等發(fā)現(xiàn)高等擔(dān)子菌 Pleurotus spp.產(chǎn)生毒素毒殺線蟲，1992年Kwork等證實(shí)該毒素為癸烯二酸，至今從高等真菌的次級代謝物中尋找殺線蟲活性物質(zhì)已成為新的研究熱點(diǎn)。如大黃酚chrysophanol 不僅是普遍的植物新陳代謝物而且也廣泛存在灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、多孢木霉(Trichoderma polysporum)、鹿角毛殼菌(Chaetomium elatum)、豌豆深褐斑菌 (Ascochyta pisi)和蓮點(diǎn)霉屬菌(Phoma spp.)中，大黃素emodin分布也廣可從灰綠曲霉許多擔(dān)子菌和地衣等真菌中獲得，它們對根結(jié)線蟲有微弱毒性。生物堿phenoxazone首先從血紅密孑Llif Pycnoporus sanguineus中獲得，后來又從虎皮香杏菌Calocybe gambosa 的發(fā)酵菌絲體中分離出對南方根結(jié)線蟲M. incognita的ED50為50yg/ml。環(huán)縮肽白僵菌素beauvericin可從球孢白僵菌Beauveria bassiana、玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus和鐮刀屬菌Fusarium spp.中分離得到，發(fā)現(xiàn)它對M. incognita有微弱活性。 1997年，Mayer和Merner等從奧爾類臍菇Omphalotus olearius的發(fā)酵液中分離到一高活性環(huán)十二縮肽物質(zhì)omphalotin對根結(jié)線蟲的ED50為0. 75 μ g/ml,比商品殺線蟲劑阿維菌素更具活性而且無抗菌性、不毒害植物，具有商業(yè)利用前景。
真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，因此真菌作為線蟲的生防因子展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景。本發(fā)明正是基于上述理論，以植物寄生線蟲為靶標(biāo)，尋找具有高效殺線蟲活性物質(zhì)生防真菌，為進(jìn)一步研究開發(fā)新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選獲得對植物線蟲具高殺蟲活性的真菌菌株，將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，從中獲取具殺線蟲活性的代謝產(chǎn)物，開發(fā)新的殺線蟲生物農(nóng)藥，其中，所述的植物線蟲是南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita，大豆胞囊線蟲Heterodera glycines 禾口水稻干尖線蟲 Aphelenchoides besseyi。本發(fā)明篩選到的一株具有殺線蟲活性的真菌菌株Snef5是Gloeotinia nematicida,已于2011年1月M日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4549。Snef5是在利用選擇性培養(yǎng)基分離白僵菌過程中發(fā)現(xiàn)的一種與白僵菌相伴生的特殊真菌，該菌株分離于吉林省遼源市采集的被白僵菌侵染的繭蛹上，而且這種真菌對植物線蟲具有良好殺線蟲活性，因此被深入研究其發(fā)酵及其對靶標(biāo)線蟲的毒殺作用。本發(fā)明涉及真菌菌株Snef5或其代謝物具有殺線蟲活性物質(zhì)，可用于植物寄生線蟲的生物防治，特別是根結(jié)線蟲的防治。為了更詳細(xì)地進(jìn)一步闡明而不是為了限制本發(fā)明， 給出了下列實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明還涉及用于防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，是由本發(fā)明的真菌Snef5經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)后提取制備的。本發(fā)明的真菌菌株Snef5通過試管斜面菌種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，然后對發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行殺線蟲活性試驗(yàn)，確定其對線蟲的作用。實(shí)施例1 菌株Snef5的培養(yǎng)Snef5的單菌落接種到試管斜面的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為PSA培養(yǎng)基馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂17g、水1000ml，28°C培養(yǎng)7d，獲得試管斜面菌種。再將試管斜面菌種接種到150mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為含(NH4)2SO4 3. 67g、KCl 0. 96g、FeSO4 0. 02g、K2HPO4 0. 64g、MgSO4 · 5H20 1. 04g、蔗糖 28. 3g、蒸餾水 1000ml, pH 為 7. 2，25°C 28°C下，搖床轉(zhuǎn)速以 150r · mirT1 200r · mirT1、 發(fā)酵16 。培養(yǎng)好的發(fā)酵液用濾紙經(jīng)布氏漏斗抽濾，去除菌絲體，獲得濾液中的殺線蟲活性物質(zhì)。將發(fā)酵濾液配成不同的倍數(shù)進(jìn)行殺線蟲藥效試驗(yàn)。實(shí)施例2 菌株Snef5的殺線蟲活性測定將發(fā)酵濾液在原液的基礎(chǔ)上依次稀釋為2X、5X、10X、20X、50X，分別對大豆胞囊線蟲J2、南方根結(jié)線蟲J2和水稻干尖線蟲進(jìn)行殺線蟲活性試驗(yàn)。在經(jīng)滅菌的特制的貝氏小皿內(nèi)中加入稀釋2X的試驗(yàn)用發(fā)酵液各lmL，以加ImL無菌水作為對照，然后分別向處理和對照中各加入大豆胞囊線蟲、南方根結(jié)線蟲或水稻干尖線蟲約100條，放入25°C培養(yǎng)箱中，24h和4 分別記錄線蟲死亡率，計(jì)算校正死亡率即為殺線蟲藥效。每處理重復(fù)3次。
權(quán)利要求
1.一種具有殺線蟲活性的生防真菌Snef5，其特征在于該菌株為Gloeotinia nematicida,已于2011年1月M日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 4549。
2.權(quán)利要求1所述的菌株Snef5斜面菌種的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂17g，水1000ml，25°C培養(yǎng)7d，獲得試管斜面菌種。
3.權(quán)利要求1所述的菌株Snef5具殺線蟲活性液體發(fā)酵液的制備方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(NH4) 2804 3. 67g，KCl 0. 96g，F(xiàn)eSO4 0. 02g, K2HPO4 0. 64g，MgSO4 · 5H20 1. 04g，蔗糖 28. 3g，蒸餾水 1000ml，25 °C 28 °C，搖床轉(zhuǎn)速 150r · mirT1 200r · mirT1，發(fā)酵16他，培養(yǎng)好的發(fā)酵液用濾紙經(jīng)布氏漏斗抽濾，去除菌絲體，獲得濾液中的殺線蟲活性物質(zhì)。
4.一種殺線蟲制劑，其特征在于包含有效量的權(quán)利要求1所述的真菌或權(quán)利要求3 所述的菌株發(fā)酵濾液作為活性成分。
5.權(quán)利要求1所述的真菌或權(quán)利要求3所述的真菌發(fā)酵濾液在植物寄生線蟲生物防治中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物寄生線蟲為根結(jié)線蟲 Meloidogynespp.、大豆胞囊線蟲 Heterodera glycines 禾口水禾酉干尖線蟲 Aphelenchoides besseyi。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具毒殺植物線蟲作用的真菌的培養(yǎng)方法及其代謝物制備方法，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的真菌菌株Snef5為Gloeotinia nematicida，已于2011年1月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.4549。該真菌菌株Snef5的分類地位是子囊菌門Ascomycota，子囊菌綱Ascomycetes，柔膜菌目Helotiales，絲核菌科Sclerotiniaceae，Gloeotinia屬真菌。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，其代謝產(chǎn)物對植物寄生線蟲中的重要病原線蟲包括根結(jié)線蟲、大豆胞囊線蟲和水稻干尖線蟲具有很高毒力，殺線蟲效果明顯，具良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號A01N63/04GK102250775SQ20111004924
公開日2011年11月23日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者劉彬, 朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 趙迪, 陳立杰 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)