專利名稱：控制大豆胞囊線蟲的生物種衣劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制大豆胞囊線蟲的生物種衣劑。
背景技術(shù)：
大豆胞囊線蟲病(Soybean Cyst Nematode)，又稱大豆黃萎病、火龍秧子，是制約世界大豆生產(chǎn)的首要病害之一。該病害一般使大豆減產(chǎn)10 % 30 %，嚴重地塊可達70 % 90%，甚至造成絕產(chǎn)，比任何一種單一病害所造成的危害都大。該病在大豆主產(chǎn)區(qū)擴展迅速，已成為主要病害之一，從世界范圍來看，大豆胞囊線蟲病的危害和蔓延有日益加重的趨勢。近年來隨著我國大豆栽培面積的不斷擴大，大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)的分布也越來越廣，主要發(fā)生在東北和黃淮海等共14個省市自治區(qū)，是造成大豆低產(chǎn)田的主要原因之一。控制大豆胞囊線蟲病害目前沒有特別有效的方法，國內(nèi)常用的種衣劑中因含有克百威(呋喃丹)等有效的殺蟲成分對大豆胞囊線蟲有一定的防治效果，但隨著呋喃丹的禁用，尋找新的替代品成為必然。尤其是近20年來，隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)和有機農(nóng)業(yè)的發(fā)展，人們已將防治線蟲病害的工作重點轉(zhuǎn)向了生物防治。在微生物農(nóng)藥迅速發(fā)展的過程中，國際上一些新型生物技術(shù)公司，如Mycogen公司、Ecogen公司等應(yīng)運而生。一些全球性大型化學(xué)農(nóng)藥公司和生物技術(shù)公司，如美國的杜邦公司和孟山都公司、德國的拜耳公司、瑞士的先正達公司、日本的住友公司等也紛紛投巨資發(fā)展微生物農(nóng)藥。在目前發(fā)現(xiàn)的近萬種抗生素當中，約有70%是由放線菌產(chǎn)生的各種次生代謝產(chǎn)物。農(nóng)用抗生素作為生物農(nóng)藥中的重要類群，較其它生物農(nóng)藥具有更高效、快速、安全等優(yōu)點。放線菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，因此放線菌作為線蟲的生防因子展現(xiàn)出巨大的潛力。另外，PGI^R制劑是近年來在根瘤菌肥和復(fù)合生物肥的單一肥效研究基礎(chǔ)上開發(fā)研制的集促生、抗病生防為一體的新型活體接種劑。研究發(fā)現(xiàn)，PGI^R在植物根圍的聚集，它們旺盛的代謝作用加強了土壤中有機物質(zhì)的分解，促進了植物營養(yǎng)元素的礦化， 增強了對作物營養(yǎng)的供應(yīng)。某些PGH 菌株產(chǎn)生的植物激素可促進植物根系生長、增強根系吸收礦物營養(yǎng)和水分的能力，從而促進植物生長。同時PGI^R在根圍的定殖能在一定程度上抑制病原物的定殖和傳播，而促進菌根真菌的生長發(fā)育，并對受污染土壤也具有一定的生物修復(fù)能力。因此，本發(fā)明旨在利用放線菌的抗生素活性和PGI^R中的巨大芽孢桿菌對植物寄生線蟲的生物防治作用，形成多樣性微生物菌群從而有效控制大豆胞囊線蟲的危害，為我國植物寄生線蟲的生物防治開辟新的途徑。目前我國種衣劑市場比較薄弱，品種單一，原藥少?，F(xiàn)有種衣劑以農(nóng)藥劑型的種衣劑占多數(shù)，并且種衣劑中原藥品種以高毒農(nóng)藥呋喃丹為主來防治地下害蟲，新的殺蟲農(nóng)藥品種少。種衣劑配方中活性成分總含量偏低、成膜劑和助劑研究不夠，可選擇的品種少。隨著人們對各種安全因素的考慮，生物種衣劑正漸漸成為研究的熱點。通過生防菌株的篩選， 找到高效的菌株，再利用生物多樣性原理將多株生防菌株通過混配協(xié)同增效作用，應(yīng)用于生物種衣劑，從而達到增強作物抗逆能力、抗病蟲以及促生增產(chǎn)的效果。菌株Snea253是本研究組從土壤中分離出來的一株生防放線菌(專利號 ZL200810010465. X，菌種保藏號為CGMCC No. 2348)，已于2010年7月7日獲得國家發(fā)明專利授權(quán)，通過試驗發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液中的殺線蟲活性物質(zhì)能很好的抑制和殺死大豆胞囊線蟲；菌株Sneb207為本研究組分離出的一株促進大豆生長并可抑制大豆胞囊線蟲的PGPR， 為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium,已于2008年4月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2447。將這2菌株生防菌的發(fā)酵液進行混配，即達到抑制大豆胞囊線蟲的繁殖作用，又能促進大豆植株健康生長、提高產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一種可以抑制大豆胞囊線蟲病害促進大豆生長的生物種衣劑，依據(jù)生物多樣性原理，將多株具有殺線活性的菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，使用該菌的代謝產(chǎn)物與其他元素、助劑等混配處理，形成生物種衣劑，用以包衣大豆種子，達到有效控制大豆胞囊線蟲病害促進大豆幼苗生長的目的。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，土壤放線菌和細菌有很多種類都具有一定的殺線活性，從這些生防菌株中篩選出復(fù)配效果好的組合委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Sti^ptomyces venezuelae) Snea253和巨大芽孢桿菌(Bacillus)B207進行進一步的試驗。本發(fā)明的生防菌株委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Sti^ptomyces venezuelae) Snea253和巨大芽孢桿菌(Bacillus) Snel3207是通過試管菌種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，其具體方法如下1.試管菌種培養(yǎng)放線菌種子培養(yǎng)基配方可溶性淀粉20g，磷酸氫二鉀0. 5g，硝酸鉀lg，氯化鈉 0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，七水硫酸鎂0. 5g，瓊脂15-20g，加水至1000ml，pH為7. 2-7. 4。將接種于斜面上的Snea253置于恒溫培養(yǎng)5 7天。細菌培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，酵母浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂15g，加水至1000ml。將接種于斜面上的Sneb207置于25°C恒溫培養(yǎng)2d，獲得試管菌種。2.液體發(fā)酵培養(yǎng)放線菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉4%、葡萄糖2%、可溶性淀粉6%、硫酸銨 0. 4%、氯化鈉0. 2%、磷酸氫二鉀0. 02%、碳酸鈣0. 2%。細菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液態(tài)NA培養(yǎng)基，配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏 0.2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0.5%、蔗糖1%、余下為蒸餾水，pH為8。將試管菌種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，25°C 下， 搖床轉(zhuǎn)速以150r · miiT1 200r · mirT1、振蕩培養(yǎng)48h，獲得種子培養(yǎng)液。液體發(fā)酵的菌種可以通過大型發(fā)酵罐進行規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)品為發(fā)酵液或發(fā)酵液的制成品。
具體實施例方式為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實施例。
實施例1 生防菌的發(fā)酵委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Sti^ptomyces venezuelae) Snea253的液體培養(yǎng)的菌種接種到 50L-100L的發(fā)酵罐進行發(fā)酵，在下培養(yǎng)，初始pH為6，發(fā)酵120h_140h。巨大芽孢桿菌 (Bacillus) Sneb207的液體培養(yǎng)的菌種接種到50L-100L的發(fā)酵罐進行發(fā)酵，在25°C下培養(yǎng)，pH為8，發(fā)酵48h-72h。期間抽樣檢查發(fā)酵液對靶標線蟲的活性，按照活性標準曲線確定放罐時間。實施例2 元素用量的篩選所用試劑全部為分析純，包括磷酸二氫鉀、硫酸鉀、硫酸銅、硫酸錳、硫酸亞鐵、鉬酸銨、硼酸等。將各元素按照不同比例混合后研磨，加入粘結(jié)劑對大豆包衣，以大豆種子的發(fā)芽勢為篩選指標，選出促進大豆生長的大量元素和微量元素的組合。組合配比(按重量百分比計)CuS04 0 . 09%, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 18%, H3BO3 0. 04%, MnSO4 0. 3%, FeSO4 0. 04%, KH2PO4 1. 5%, K2SO4 1%。實施例3 控制大豆胞囊線蟲的生物種衣劑制備將各生防菌發(fā)酵液處理后，按本發(fā)明的比例進行復(fù)配后，再將各種元素按比例混合后粉碎研磨，再與助劑混合均勻加入蒸餾水攪拌成均勻的粘稠液，濕法研磨，振蕩混合均勻，制備出本發(fā)明的生物種衣劑。實施例4 生物種衣劑的田間應(yīng)用效果2010年在遼寧省康平縣和黑龍江省安達市進行田間小區(qū)播種試驗。小區(qū)試驗采取隨機區(qū)組5次重復(fù)的方法。每個處理5行區(qū)，2. 5m行長，行距0. 65m,處理間隔lm，小區(qū)面積 8. Im2,總面積450m2。以不包衣為空白對照，以商品種衣劑為種衣劑對照。通過計數(shù)大豆根上胞囊數(shù)和根內(nèi)線蟲數(shù)，田間考種結(jié)果顯示本發(fā)明的效果良好， 不但控制了大豆胞囊線蟲數(shù)量的增殖，而且也促進了大豆幼苗的生長以及大豆產(chǎn)量的增加。試驗結(jié)果如下表。表1大豆生物種衣劑處理大豆根外胞囊和根內(nèi)線蟲數(shù)量的變化
權(quán)利要求
1.一種生物種衣劑，它包含對植物無害的微生物次級代謝產(chǎn)物、微量元素和大量元素， 以及其他助劑，能抑制大豆胞囊線蟲病害并有促生增產(chǎn)作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑，其中次級代謝產(chǎn)物來自放線菌菌株Snea253(為委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Mi^ptomyces venezuelae，已于2008年1月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2348)和根際促生芽孢桿菌Sneb207 (為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium,已于2008年4月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2447)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的生物種衣劑，該生物種衣劑的微生物含量為IO8Cfu/ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑，其中微量元素和大量元素的配比為CuSO40. 09%, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 18%, H3BO3 0. 04%, MnSO4 0. 3%, FeSO4 0. 04%, KH2PO4 1. 5%, K2SO4 1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑，其中助劑包括成膜劑甲基纖維素占所述的生物種衣劑的重量比為4%-6%，分散劑木質(zhì)素磺酸占重量比為2%-4%，粘結(jié)劑羧甲基纖維素鈉占重量比為1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑按種子量的均勻包于大豆表面，晾干后即可播種， 適用于大豆胞囊線蟲的防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治大豆胞囊線蟲的生物種衣劑，它包含2種生防菌株的殺線活性物質(zhì)、按比例混配的元素和各種助劑。大量試驗證明，本發(fā)明生物種衣劑在理化性狀上都符合種衣劑的要求，包衣后明顯促進大豆苗期的生長，提高大豆產(chǎn)量，對大豆苗期胞囊線蟲病害的控制效果顯著。
文檔編號A01C1/06GK102308853SQ20111004923
公開日2012年1月11日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者萬傳浩, 朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 郭寧, 陳立杰 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)