專利名稱：一種防治植物寄生線蟲的水生真菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毒殺植物寄生線蟲的水生真菌及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生線蟲的危害超過細(xì)菌和病毒，僅次于真菌。據(jù)Sasser & Freekman(1987)報道，植物寄生線蟲每年對全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失約1000億美元，成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素。由于抗線蟲育種難度較大，目前線蟲防治仍主要采用化學(xué)防治。盡管化學(xué)殺線蟲劑在保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，防治線蟲病中發(fā)揮了重要作用。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)殺線蟲劑均有副作用，危害人體健康。同時容易產(chǎn)生抗藥性，污染環(huán)境。目前生產(chǎn)上大量使用的鐵滅克雖然對線蟲有較好的防效，但毒性高，破壞土壤微生物區(qū)系。大多數(shù)危害農(nóng)作物的線蟲發(fā)生于作物根部，由于土壤環(huán)境的特殊性，必須大劑量施用才能保證其防效。而大量化學(xué)農(nóng)藥對地下水污染非常嚴(yán)重?；瘜W(xué)防治與保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人民健康形成了尖銳的矛盾，開發(fā)新型生物殺線蟲劑已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的重要問題。
水生真菌是指在生活周期中全部或部分依賴于水的真菌。多年來，由于我國對水生真菌缺乏系統(tǒng)研究，水生真菌成為一類鮮為人知的真菌。但國內(nèi)外相關(guān)研究表明，水生真菌是一類極具應(yīng)用前景的真菌，如在海洋真菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤化合物(Chika，et al.，1995；Xing Chungcheng，et al.，1994)；抗菌新化合物(Strongman，et al.，1986；Kerstin and Ulrike，1995))；從海洋真菌分離出的次級代謝產(chǎn)物中約70％-80％具有生物活性及部份專一性的裂解酶(方金瑞，黃維真.1996)。本發(fā)明人正是基于上述理論，以植物寄生線蟲為目標(biāo)，從水生真菌中進(jìn)行了大量篩選，擬為研究開發(fā)新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，通過對一種毒殺植物寄生線蟲的水生真菌研究，開發(fā)生物殺線蟲農(nóng)藥。
本發(fā)明篩選到的一株具有殺線蟲活性的水生真菌是Annulatascus triseptata ZD3，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2003年7月28日；保藏登記入冊的編號CGMCC N0.0984。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的首先對Annulatascus triseptata ZD3菌株進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)好的菌絲和代謝產(chǎn)物進(jìn)行殺線蟲活性試驗，確定其對線蟲的作用。
ZD3培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為改良馬鈴薯(PDA)瓊脂培養(yǎng)基，即1000毫升PDA培養(yǎng)基添加3克磷酸二氫鉀、2克酵母浸膏、1克碳酸鈣、pH自然。
將ZD3菌絲體接種到改良PDA培養(yǎng)基斜面上，18-26℃下培養(yǎng)6-12天，得試管種；2、液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為0.1-0.5％酵母浸膏；0.2-0.4％磷酸二氫鉀；0.02-0.06％硫酸鎂；0.1-0.6％碳酸鈣；10-20％糖蜜；余下為水；pH自然。
將試管種接種到250ml三角瓶(每瓶裝70ml)液體培養(yǎng)基中，20-30℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200-300rpm，培養(yǎng)時間5-8天。
將發(fā)酵液直接進(jìn)行殺線蟲活性試驗。
3、固體擴(kuò)大培養(yǎng)固體培養(yǎng)基配方為麩皮35-60％；米糠35-60％；0.2-1％碳酸鈣；大豆粉1-3％；硫酸氨0.2-1％；過磷酸鈣0.5-3％；pH自然，含水量為60％。
將培養(yǎng)基混均后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝700ml，120℃滅菌30分鐘后，接種后于22-26℃培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿。
將已長滿菌絲的培養(yǎng)基挖出，凍干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶劑浸提，浸提后濃縮，得總粗提物。將粗提物溶于少量二甲基亞砜(DMSO)，再用一定濃度的吐溫-20(Tween-20)溶液溶解，將所得乳濁液進(jìn)行殺線蟲活性試驗。
ZD3菌株殺線蟲活性試驗1、制備試驗用制劑(1)液體擴(kuò)大制備試驗用制劑按前述液體擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)ZD3菌株，取發(fā)酵液進(jìn)行殺線蟲活性試驗。以未接種的液體培養(yǎng)基作為對照。
(2)固體培養(yǎng)制備試驗用制劑按前述固體擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)ZD3菌株，按前述提取方法用氯仿和甲醇溶劑將殺線蟲活性部份提出，將所得的乳濁液進(jìn)行殺線蟲活性試驗。以未接種的固體培養(yǎng)基作為對照。
2、制備試驗用線蟲(1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
(2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養(yǎng)15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗方法取直徑6cm培養(yǎng)皿，滅菌后加入2ml試驗用藥劑，然后加入20μl線蟲懸浮液(300條)，置25℃培養(yǎng)，定時用解剖鏡檢查線蟲的死活。以針刺生理刺激，無反映則確定為線蟲死亡，計算出死亡率和殺線蟲藥效。


以未接菌的培養(yǎng)基的浸提液作對照，每處理重復(fù)三次。
4、試驗結(jié)果(1)制劑對Panagrellus redivivus線蟲的殺蟲效果表1 ZD3液體發(fā)酵產(chǎn)物對Panagrellus redivivus線蟲殺蟲效果

表2 ZD3固體發(fā)酵產(chǎn)物對Panagrellus redivivus線蟲殺蟲效果

結(jié)果表明，ZD3菌株液體和固體發(fā)酵產(chǎn)物對Panagrellus redivivus線蟲具有良好的殺蟲活性，處理48小時后，線蟲的死亡率都達(dá)90％以上。其中固體發(fā)酵產(chǎn)物的殺線蟲活性優(yōu)于液體發(fā)酵產(chǎn)物，其24小時線蟲死亡就達(dá)95.7％。
(2)制劑對Panagrellus redivivus線蟲的殺蟲效果表3 ZD3液體發(fā)酵產(chǎn)物對松材線蟲殺蟲效果

表4 ZD3固體發(fā)酵產(chǎn)物對松材線蟲殺蟲效果

結(jié)果表明ZD3菌株液體和固體發(fā)酵產(chǎn)物對松材線蟲具有良好的殺蟲活性，其中以固體發(fā)酵尤其明顯，松材線蟲48小時平均死亡達(dá)97％。試驗結(jié)果同時表明，ZD3對線蟲的殺蟲作用多產(chǎn)生于24小時后，在12小時殺蟲效果不明顯。
通過對兩種線蟲殺蟲試驗結(jié)果表明，ZD3是一株極具潛在應(yīng)用價值的真菌，特別是對松材線蟲的殺蟲效果在一般陸生真菌極為少見，為今后研究開發(fā)生物殺線蟲劑提供了一個極好的來源。
具體實施例方式下面用實施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此實施例一將A.triseptata ZD3的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為改良馬鈴薯(PDA)瓊脂培養(yǎng)基，即1000毫升PDA培養(yǎng)基添加3克磷酸二氫鉀、2克酵母浸膏、1克碳酸鈣、pH自然。20℃下培養(yǎng)9天，獲得試管種。
再將試管種接種到250ml三角瓶(每瓶裝70ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為酵母浸膏0.3％、磷酸二氫鉀0.3％、硫酸鎂0.04％、碳酸鈣0.4％；18％糖蜜，余下為水，pH自然。將接好種的三角瓶于22℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)時間7天。將發(fā)酵液直接進(jìn)行殺線蟲藥效試驗。
實施例二試管種培養(yǎng)方法與實施例一相同。
將試管種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為麩皮45％、米糠50％、0.5％碳酸鈣、大豆粉2％、硫酸氨0.5％、過磷酸鈣2％、pH自然，含水量為60％。將培養(yǎng)基混均后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝700ml，120℃滅菌30分鐘后，接種后于22℃下培養(yǎng)18天，直到菌絲長滿。
將已長滿的菌絲挖出，凍干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶劑浸提，浸提后濃縮，得總粗提物。將粗提物溶于少量二甲基亞砜(DMSO)，再用一定濃度的吐溫-20(Tween-20)溶液溶解，將所得乳濁液進(jìn)行殺線蟲活性試驗。
實施例三基本同實施例一、和例二，不同之處是培養(yǎng)基配方，其配方為液體培養(yǎng)基配方，0.1％酵母浸膏；0.2％磷酸二氫鉀；0.02％硫酸鎂；0.1％碳酸鈣；10％糖蜜。
固體培養(yǎng)基配方，麩皮60％；米糠35％；1％碳酸鈣；大豆粉3％；硫酸氨0.5％；過磷酸鈣0.5％。
實施例四基本同實施例一、和例二，不同之處是培養(yǎng)基配方，其配方為液體培養(yǎng)基配方，0.5％酵母浸膏；0.4％磷酸二氫鉀；0.06％硫酸鎂；0.6％碳酸鈣；20％糖蜜。
固體培養(yǎng)基配方，麩皮35％；米糠60％；0.5％碳酸鈣；大豆粉1％；硫酸氨0.5％；過磷酸鈣3％。
權(quán)利要求
1.一種毒殺植物寄生線蟲的水生真菌，其特征在于該菌株為Annulatascustriseptata ZD3，ZD3菌株已于2003年7月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0984。
2.一種具有殺線蟲功能的水生真菌的制備方法，生產(chǎn)菌株經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵后制備殺線蟲制劑，其特征在于2.1該水生真菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為0.1-0.5％酵母浸膏、0.2-0.4％磷酸二氫鉀、0.02-0.06％硫酸鎂、0.1-0.6％碳酸鈣、10-20％糖蜜、余下為水、pH自然；2.2該水生真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮35-60％、米糠35-60％、0.2-1％碳酸鈣、大豆粉1-3％、硫酸氨0.2-1％、過磷酸鈣0.5-3％、pH自然，含水量為60％。
3.按權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種毒殺植物寄生線蟲的水生真菌，其特征在于對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可應(yīng)用于植物寄生線蟲生物防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毒殺植物寄生線蟲的水生真菌及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的水生真菌菌株Annulatascus triseptata ZD3已于2003年7月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0984。本發(fā)明的特征是，從水生真菌中分離篩選到一株對植物寄生線蟲具有良好毒殺作用的菌株ZD3，通過常規(guī)液體和固體發(fā)酵制備，該菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為0.1－0.5％酵母浸膏；0.2－0.4％磷酸二氫鉀；0.02－0.06％硫酸鎂；0.1－0.6％碳酸鈣；10－20％糖蜜；余下為水；pH自然；固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮35－60％；米糠35－60％；0.2－1％碳酸鈣；大豆粉1－3％；硫酸氨0.2－1％；過磷酸鈣0.5－3％；pH自然，含水量為60％。其代謝產(chǎn)物對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒力高，殺蟲效果明顯的突出優(yōu)點，具良好的潛在應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/14GK1580235SQ0313560
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者張克勤, 趙智嫻, 董錦艷, 周薇, 蔡磊 申請人:云南大學(xué)