本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒及其文庫的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：基因功能的篩選可以深入研究細(xì)胞內(nèi)生理過程，了解疾病發(fā)生和發(fā)展過程，具有重要的作用。這通常需要對細(xì)胞內(nèi)的基因進(jìn)行沉默或者刪除。最初研究者采用將轉(zhuǎn)座子插入到基因組或者通過化學(xué)突變的方式進(jìn)行基因突變[caretteje,guimaraescp,varadarajanm,etal.haploidgeneticscreensinhumancellsidentifyhostfactorsusedbypathogens[j].science,2009,326(5957):1231-1235.]。這種方式導(dǎo)致的突變基因的查找過程復(fù)雜，并沒有得到廣泛的應(yīng)用。之后，rna干擾(rnai)技術(shù)的出現(xiàn)，在一定程度上解決了上述方法的問題。rna干擾技術(shù)根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計一系列短鏈rna，使其在后轉(zhuǎn)錄過程中與目標(biāo)基因mrna互補(bǔ)結(jié)合，從而降解mrna或阻止其翻譯成蛋白質(zhì)[moffatj,gruenebergda,yangx,etal.alentiviralrnailibraryforhumanandmousegenesappliedtoanarrayedviralhigh-contentscreen[j].cell,2006,124(6):1283-1298.]。rna干擾技術(shù)的出現(xiàn)，使研究者幾乎可以干擾哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的所有基因。然而，該項(xiàng)技術(shù)仍存在一定的弊端。比如rnai技術(shù)只能在一定程度上降低目標(biāo)基因的表達(dá)水平，卻不能完全抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。另外，rna干擾作用依賴于短鏈rna與目標(biāo)mrna的互補(bǔ)配對，容易因不完全匹配產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，干擾目標(biāo)基因之外的其他基因表達(dá)水平，對最終結(jié)果造成不可預(yù)估的影響[kaelinjrwg.molecularbiology.useandabuseofrnaitostudymammaliangenefunction[j].science(newyork,ny),2012,337(6093):421-422.]。功能基因的篩選仍需要一種操作簡單、可以完全沉默基因表達(dá)的技術(shù)。由rna引導(dǎo)的crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)系統(tǒng)自2013年起已經(jīng)成為基因組編輯的新工具，并且由于其載體構(gòu)建過程相較于另外兩種編輯工具tale、鋅指蛋白更為方便，受到該領(lǐng)域研究者的追捧[doudna,jennifera.,andemmanuellecharpentier."thenewfrontierofgenomeengineeringwithcrispr-cas9."science346.6213(2014):1258096.]。crispr/cas9是最新出現(xiàn)的一種由rna指導(dǎo)cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定dna修飾的技術(shù)[mali,prashant,etal."rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9."science339.6121(2013):823-826.]。crispr/cas系統(tǒng)廣泛分布于細(xì)菌和古生菌基因組中,是在進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng),可以幫助降解入侵病毒或質(zhì)粒dna[b.wiedenheft,s.h.sternberg,j.a.doudna,nature482,331(2012).]。在這一系統(tǒng)中，crrna(crispr-derivedrna)通過堿基配對與tracrrna(trans-activatingcrrna)結(jié)合形成雙鏈rna，此tracrrna/crrna二元復(fù)合體指導(dǎo)cas9蛋白在crrna引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)剪切雙鏈dna，誘導(dǎo)細(xì)胞利用自身的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制(non-homologousendjoining,nhej)，引起切割位點(diǎn)的dna插入或缺失導(dǎo)致目標(biāo)基因功能失活[jinekm,chylinskik,fonfarai,etal.aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.science,2012,337(6096):816-821.]。在crisprii型系統(tǒng)中，cas9基因是參與crispr免疫系統(tǒng)的唯一必需基因，是目前最常用來工程改造人工核酸酶的系統(tǒng)。為了方便使用，在人工構(gòu)建的crispr/cas9系統(tǒng)中，將tracrrna和crrna融合為一條，稱為singleguiderna(sgrna)[mali,prashant,etal."rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9."science339.6121(2013):823-826.]。目前，已有研究者基于crispr/cas9技術(shù)開發(fā)高通量基因篩選、基因敲除技術(shù)，即針對目標(biāo)基因，設(shè)計一系列sgrna表達(dá)載體，利用慢病毒載體遞送到細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?，F(xiàn)有的基于crispr/cas9基因敲除技術(shù)中，每個載體僅表達(dá)一條sgrna。但是對于一些非編碼蛋白質(zhì)的dna片段，為了探究其生物學(xué)功能，需要表達(dá)兩條sgrna，進(jìn)行刪除以探究其相關(guān)功能。除了單個基因敲除篩選外，為了了解基因與基因間的相互作用，對于一個特定的基因集的隨機(jī)組合雙敲除可以很好的了解基因與基因間的遺傳相互作用。timothylu等人[wongasl,choigcg,cuich,etal.multiplexedbarcodedcrispr-cas9screeningenabledbycombigem[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences,2016:201517883.]通過酶切連接的方式，首先將barcode插入到單個sgrna中，然后通過酶切連接，將兩個sgrna串聯(lián)起來，這種方法雖然能夠構(gòu)建雙敲除文庫，但是過程較為繁瑣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體及雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法。本發(fā)明所提供的構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法，是利用兩輪goldengate拼裝技術(shù)將預(yù)先設(shè)計好的用于表達(dá)雙sgrna的dna片段插入到出發(fā)載體中，具體可包括：(a1)利用goldengate拼裝方法，采用iis型限制性內(nèi)切酶a、iis型限制性內(nèi)切酶e、iis型限制性內(nèi)切酶d和iis型限制性內(nèi)切酶f將dna片段與出發(fā)載體1進(jìn)行拼裝，得到重組載體1；所述dna片段的序列自上游到下游依次含有：所述iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、名稱為sgrna1的sgrna的間隔rna(spacerrna，用于識別靶標(biāo)序列)的編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列、iis型限制性內(nèi)切酶c的識別序列、名稱為sgrna2的sgrna的間隔rna(spacerrna，用于識別靶標(biāo)序列)的編碼序列、所述iis型限制性內(nèi)切酶d的識別序列；所述出發(fā)載體1的序列自上游到下游依次含有啟動子1序列、所述iis型限制性內(nèi)切酶e的識別序列、篩選標(biāo)簽1的編碼序列、所述iis型限制性內(nèi)切酶f的識別序列、sgrna骨架1編碼序列；所述dna片段與所述出發(fā)載體1的目的片段中，所述iis型限制性內(nèi)切酶a切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶e切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶d切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶f切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶a切割產(chǎn)生的粘性末端overhang和所述iis型限制性內(nèi)切酶e切割產(chǎn)生的粘性末端overhang均不與所述iis型限制性內(nèi)切酶d切割產(chǎn)生的粘性末端overhang和所述iis型限制性內(nèi)切酶f切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；(a2)利用goldengate拼裝方法，采用iis型限制性內(nèi)切酶g、所述iis型限制性內(nèi)切酶b、iis型限制性內(nèi)切酶h和所述iis型限制性內(nèi)切酶c將所述重組載體1與出發(fā)載體2進(jìn)行拼裝，得到重組載體2，所述重組載體2即為所述雙sgrna表達(dá)載體；所述出發(fā)載體2的序列自上游到下游依次含有：所述iis型限制性內(nèi)切酶g的識別序列、sgrna骨架2編碼序列、篩選標(biāo)簽2的編碼序列、啟動子2序列、所述iis型限制性內(nèi)切酶h的識別序列；所述重組載體1與所述出發(fā)載體2的目的片段中，所述iis型限制性內(nèi)切酶g切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶b切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶h切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶c切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶g切割產(chǎn)生的粘性末端overhang和所述iis型限制性內(nèi)切酶b切割產(chǎn)生的粘性末端overhang均不與所述iis型限制性內(nèi)切酶h切割產(chǎn)生的粘性末端overhang和所述iis型限制性內(nèi)切酶c切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和所述iis型限制性內(nèi)切酶f均不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶b和所述iis型限制性內(nèi)切酶c。所述雙sgrna表達(dá)載體能表達(dá)含有所述sgrna1的完整的sgrna和含有所述sgrna2的完整的sgrna。在所述重組載體1含有所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶f的識別序列時，所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶f不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶g和所述iis型限制性內(nèi)切酶h；在所述重組載體1不含所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和所述iis型限制性內(nèi)切酶f的識別序列時，對于所述iis型限制性內(nèi)切酶g和所述iis型限制性內(nèi)切酶h是否與所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和所述iis型限制性內(nèi)切酶f是否相同沒有要求。所述dna片段滿足可被所述iis型限制性內(nèi)切酶a和所述iis型限制性內(nèi)切酶d酶切的條件。所述sgrna骨架1和所述sgrna骨架2均為完整sgrna中除去間隔rna的部分。上述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法中，所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和所述iis型限制性內(nèi)切酶f均可相同。所述iis型限制性內(nèi)切酶b、所述iis型限制性內(nèi)切酶c、所述iis型限制性內(nèi)切酶g和所述iis型限制性內(nèi)切酶h均可相同。上述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法中，所述sgrna骨架1和所述sgrna骨架2均可為含有完整sgrna中除間隔rna外的功能片段。上述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法中，所述iis型限制性內(nèi)切酶a、所述iis型限制性內(nèi)切酶d、所述iis型限制性內(nèi)切酶e和所述iis型限制性內(nèi)切酶f均可為bsai。所述iis型限制性內(nèi)切酶b、所述iis型限制性內(nèi)切酶c、所述iis型限制性內(nèi)切酶g和所述iis型限制性內(nèi)切酶h均可為esp3i。所述啟動子1可為u6啟動子。所述啟動子2可為h1啟動子。所述篩選標(biāo)簽1可為lacz。所述篩選標(biāo)簽2可為amp抗性篩選標(biāo)簽。所述sgrna骨架2編碼序列為序列2的第1278-1360位。所述出發(fā)載體1上還可含有獨(dú)立的篩選標(biāo)簽3的表達(dá)盒；所述篩選標(biāo)簽3具體可為spec(r)。更加具體的，所述出發(fā)載體1為pd408載體。所述出發(fā)載體2為pds143載體。所述pd408載體的核苷酸序列為序列表中序列1。所述pds143載體的核苷酸序列為序列表中的序列2。在步驟(a1)中，所述dna片段的5’端還可含有前向引物序列，3’端還可含有后向引物的結(jié)合序列。所述前向引物和所述后向引物可用于擴(kuò)增獲得所述dna片段。當(dāng)利用上述方法制備雙sgrna表達(dá)載體文庫時，步驟(a1)中dna片段可為dna片段庫(即為所述dna片段的集合，其中每種dna片段表達(dá)出來的兩種sgrna的間隔rna可相同可不同)。實(shí)踐中，為了便于操作，可將所述dna片段庫中的所有寡核苷酸鏈合成在生物芯片上。上述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法得到的重組載體可以表達(dá)所述sgrna1和所述sgrna2。利用上述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法制備得到的雙sgrna表達(dá)載體或雙sgrna表達(dá)載體文庫也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法，包括：(c1)利用goldengate拼裝方法，將dna片段庫中的dna片段與出發(fā)載體3進(jìn)行拼裝，得到重組載體庫3；利用goldengate拼裝方法，將所述dna片段庫中的dna片段與出發(fā)載體4進(jìn)行拼裝，得到重組載體庫4；所述dna片段庫中的每種dna片段均編碼一種sgrna的間隔rna(spacerrna，用于識別靶標(biāo)序列)，所述dna片段庫中的每種dna片段具有以下c11)或c12)的特征：c11)所述dna片段庫中的每種dna片段的兩端分別各含有一個粘性末端overhang，將上游粘性末端overhang命名為粘性末端overhang1，將下游粘性末端overhang2；c12)下述c12a)或c12b)：c12a)所述dna片段庫中的每個dna片段自上游到下游均依次含有iis型限制性內(nèi)切酶n1的識別序列、sgrna的間隔rna的編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶n2的識別序列；c12b)所述dna片段庫中的每個dna片段自上游到下游均依次含有iis型限制性內(nèi)切酶n3的識別序列、sgrna的間隔rna的編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶n4的識別序列；所述出發(fā)載體3自上游到下游依次含有iis型限制性內(nèi)切酶m1的識別序列、啟動子3序列、iis型限制性內(nèi)切酶m2的識別序列、篩選標(biāo)簽3的編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶m3的識別序列、sgrna骨架3編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶m4的識別序列；所述iis型限制性內(nèi)切酶m1和所述iis型限制性內(nèi)切酶m4均不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m2和所述iis型限制性內(nèi)切酶m3；所述出發(fā)載體4自上游到下游依次含有iis型限制性內(nèi)切酶m5的識別序列、啟動子4序列、iis型限制性內(nèi)切酶m6的識別序列、篩選標(biāo)簽4的編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶m7的識別序列、sgrna骨架4編碼序列、iis型限制性內(nèi)切酶m8的識別序列；所述iis型限制性內(nèi)切酶m5和所述iis型限制性內(nèi)切酶m8均不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和所述iis型限制性內(nèi)切酶m7；所述出發(fā)載體3的目的片段中，所述iis型限制性內(nèi)切酶m2切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m3切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述出發(fā)載體4的目的片段中，所述iis型限制性內(nèi)切酶m6切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m7切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述粘性末端overhang1與所述出發(fā)載體3目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m2切割產(chǎn)生的粘性末端overhang及所述出發(fā)載體4目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m6切割產(chǎn)生的粘性末端overhang均互補(bǔ)配對；所述粘性末端overhang2與所述出發(fā)載體3目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m3切割產(chǎn)生的粘性末端overhang及所述出發(fā)載體4目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m7切割產(chǎn)生的粘性末端overhang均互補(bǔ)配對；所述dna片段庫中dna片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶n1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述出發(fā)載體3目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m2切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述dna片段庫中dna片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶n2切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述出發(fā)載體3目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m3切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述dna片段庫中dna片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶n3切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述出發(fā)載體4目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m6切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述dna片段庫中dna片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶n4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述出發(fā)載體4目的片段中所述iis型限制性內(nèi)切酶m7切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述dna片段庫中的每種dna片段滿足c11)所述特征，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶m2和所述iis型限制性內(nèi)切酶m3將所述dna片段庫中的dna片段與所述出發(fā)載體3進(jìn)行拼裝，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和所述iis型限制性內(nèi)切酶m7將所述dna片段庫中的dna片段與所述出發(fā)載體4進(jìn)行拼裝；所述dna片段庫中的每種dna片段滿足c12)所述特征，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶m2、所述iis型限制性內(nèi)切酶m3、所述iis型限制性內(nèi)切酶n1和所述iis型限制性內(nèi)切酶n2將所述dna片段庫中的dna片段與所述出發(fā)載體3進(jìn)行拼裝，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶m6、所述iis型限制性內(nèi)切酶m7、所述iis型限制性內(nèi)切酶n3和所述iis型限制性內(nèi)切酶n4將所述dna片段庫中的dna片段與所述出發(fā)載體4進(jìn)行拼裝；(c2)利用goldengate拼裝方法，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶m1、所述iis型限制性內(nèi)切酶m4、所述iis型限制性內(nèi)切酶m5、所述iis型限制性內(nèi)切酶m8、iis型限制性內(nèi)切酶m7和iis型限制性內(nèi)切酶m8將重組載體庫3中的重組載體、重組載體庫4中的重組載體與出發(fā)載體5進(jìn)行拼裝，得到重組載體庫5，所述重組載體庫5即為所述雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫；所述出發(fā)載體5的序列自上游到下游依次含有所述iis型限制性內(nèi)切酶m9的識別序列、篩選標(biāo)簽5的編碼序列、所述iis型限制性內(nèi)切酶m10的識別序列；所述出發(fā)載體3、所述出發(fā)載體4和所述出發(fā)載體5的目的片段中滿足y1)、y2)和y3)以及x1)-x8)中的任一種：y1)所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；y2)所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；y3)所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x1)所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x2)所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x3)所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x4)所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x5)所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x6)所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x7)所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；x8)所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m10切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m5切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m4切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m8切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對，所述iis型限制性內(nèi)切酶m1切割產(chǎn)生的粘性末端overhang不與所述iis型限制性內(nèi)切酶m9切割產(chǎn)生的粘性末端overhang互補(bǔ)配對；所述iis型限制性內(nèi)切酶m2、所述iis型限制性內(nèi)切酶m3、所述iis型限制性內(nèi)切酶n1和所述iis型限制性內(nèi)切酶n2均不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m1和所述iis型限制性內(nèi)切酶m4；所述iis型限制性內(nèi)切酶m6、所述iis型限制性內(nèi)切酶m7、所述iis型限制性內(nèi)切酶n3和所述iis型限制性內(nèi)切酶n4均不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m5和所述iis型限制性內(nèi)切酶m8。所述雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫中的載體均能表達(dá)兩個含有隨機(jī)sgrna的完整的sgrna。所述dna片段庫中的每種dna片段滿足c12)所述特征時，所述dna片段庫中的每個dna片段還滿足可被所述iis型限制性內(nèi)切酶n1和所述iis型限制性內(nèi)切酶n2酶切或被所述iis型限制性內(nèi)切酶n3和所述iis型限制性內(nèi)切酶n4酶切的條件。所述sgrna骨架3和所述sgrna骨架4均為完整sgrna中除去間隔rna的部分。在所述重組載體庫3中的重組載體含有所述iis型限制性內(nèi)切酶m2和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶m3的識別序列時，所述iis型限制性內(nèi)切酶m2和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶m3不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m9和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶m10；在所述重組載體庫3中的重組載體不含所述iis型限制性內(nèi)切酶m2和所述iis型限制性內(nèi)切酶m3的識別序列時，對所述iis型限制性內(nèi)切酶m2和所述iis型限制性內(nèi)切酶m3是否同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m9和所述iis型限制性內(nèi)切酶m10沒有要求。在所述重組載體庫4中的重組載體含有所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶m7的識別序列時，所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶m7不同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m9和/或所述iis型限制性內(nèi)切酶m10；在所述重組載體庫4中的重組載體不含所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和所述iis型限制性內(nèi)切酶m7的識別序列時，對所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和所述iis型限制性內(nèi)切酶m7是否同于所述iis型限制性內(nèi)切酶m9和所述iis型限制性內(nèi)切酶m10沒有要求。上述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法中，所述iis型限制性內(nèi)切酶m2、所述iis型限制性內(nèi)切酶m3、所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和所述iis型限制性內(nèi)切酶m7均可相同。所述iis型限制性內(nèi)切酶m1、所述iis型限制性內(nèi)切酶m4、所述iis型限制性內(nèi)切酶m5、所述iis型限制性內(nèi)切酶m8、所述iis型限制性內(nèi)切酶m9和所述iis型限制性內(nèi)切酶m10均可相同。上述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法中，所述sgrna骨架3和所述sgrna骨架4均可為含有完整sgrna中除間隔rna外的功能片段。上述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法中，所述iis型限制性內(nèi)切酶m2、所述iis型限制性內(nèi)切酶m3、所述iis型限制性內(nèi)切酶m6和所述iis型限制性內(nèi)切酶m7均可為bsai。所述iis型限制性內(nèi)切酶m1、所述iis型限制性內(nèi)切酶m4、所述iis型限制性內(nèi)切酶m5、所述iis型限制性內(nèi)切酶m8、所述iis型限制性內(nèi)切酶m9和所述iis型限制性內(nèi)切酶m10均可為esp3i。所述啟動子3可為u6啟動子。所述啟動子4可為7sk啟動子。所述篩選標(biāo)簽3可為lacz。所述篩選標(biāo)簽4可為lacz。所述sgrna骨架3編碼序列可為序列3的第1443-1524位。所述sgrna骨架4編碼序列可為序列4的第1435-1517位。更加具體的，所述出發(fā)載體3為pdc007載體。所述出發(fā)載體4為pdc002載體。所述出發(fā)載體5為pdc005載體。所述pdc007載體序列為序列3。所述pdc002載體為序列4。所述pdc005載體為序列5。上述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法得到的重組載體庫中的重組載體可以表達(dá)兩個sgrna。所述重組載體庫5含有至少一個重組載體。利用上述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法制備得到的雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述雙sgrna表達(dá)載體或雙sgrna表達(dá)載體文庫或所述雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫在鑒定非編碼區(qū)基因的生物學(xué)功能中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述雙sgrna表達(dá)載體或雙sgrna表達(dá)載體文庫或所述雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫在鑒定基因與基因相互作用中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述p1)或p2)的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：p1)用于構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的成套試劑，由所述出發(fā)載體1、所述出發(fā)載體2、所述出發(fā)載體3、所述出發(fā)載體4和所述出發(fā)載體5中的至少兩種組成；p2)所述出發(fā)載體1、所述出發(fā)載體2、所述出發(fā)載體3、所述出發(fā)載體4或所述出發(fā)載體5。下述q1)-q8)任一所述應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：q1)所述雙sgrna表達(dá)載體或雙sgrna表達(dá)載體文庫或所述雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫在鑒定非編碼區(qū)基因的生物學(xué)功能中的應(yīng)用；q2)所述雙sgrna表達(dá)載體或雙sgrna表達(dá)載體文庫或所述雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫在鑒定基因與基因相互作用中的應(yīng)用；q3)所述產(chǎn)品在構(gòu)建sgrna表達(dá)載體中的應(yīng)用：q4)所述產(chǎn)品在制備構(gòu)建sgrna表達(dá)載體產(chǎn)品中的應(yīng)用；q5)所述產(chǎn)品在鑒定非編碼區(qū)基因的生物學(xué)功能中的應(yīng)用；q6)所述產(chǎn)品在鑒定基因與基因相互作用中的應(yīng)用；q7)所述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法或所述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法在鑒定非編碼區(qū)基因的生物學(xué)功能中的應(yīng)用；q8)所述構(gòu)建雙sgrna表達(dá)載體的方法或所述構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)載體文庫的方法在鑒定基因與基因相互作用中的應(yīng)用。本發(fā)明中，所述粘性末端overhang是指粘性末端突出出來的單個核苷酸或含有2個或2個以上核苷酸的單鏈dna。下述y1或y2的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：y1、一種構(gòu)建雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒的方法，包括如下步驟：(a1)合成用于表達(dá)sgrna1和sgrna2的dna片段，所述dna片段自上游到下游依次含有iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、用于表達(dá)所述sgrna1上的間隔序列的dna序列、iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列、用于表達(dá)所述sgrna2上的間隔序列的dna序列、iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列；(a2)選擇符合如下條件的空載sgrna骨架載體作為出發(fā)質(zhì)粒1：自上游到下游依次含有啟動子1、所述iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、篩選標(biāo)簽序列1、所述iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、sgrna骨架序列1；(a3)基于goldengate拼裝技術(shù)，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶a將所述dna片段克隆到所述出發(fā)質(zhì)粒1中，得到重組質(zhì)粒1；(a4)選擇符合如下條件的空載sgrna骨架載體作為出發(fā)質(zhì)粒2：自上游到下游依次含有所述iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列、sgrna骨架序列2、篩選標(biāo)簽序列2、啟動子2、所述iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列；(a5)基于goldengate拼裝技術(shù)，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶b將所述重組質(zhì)粒1與所述出發(fā)質(zhì)粒2進(jìn)行重組，得到能夠同時表達(dá)所述sgrna1和所述sgrna2的重組質(zhì)粒2，所述重組質(zhì)粒2即為所述雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒；y2、一種構(gòu)建雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒的方法，包括如下步驟：(b1)合成用于表達(dá)sgrna1和sgrna2的dna片段，所述dna片段自上游到下游依次含有iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、用于表達(dá)所述sgrna1上的間隔序列的dna序列、iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列、用于表達(dá)所述sgrna2上的間隔序列的dna序列、iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列；(b2)選擇符合如下條件的空載sgrna骨架載體作為出發(fā)質(zhì)粒1：自上游到下游依次含有啟動子1、所述iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、篩選標(biāo)簽序列1、所述iis型限制性內(nèi)切酶a的識別序列、sgrna骨架序列1；(b3)基于goldengate拼裝技術(shù)，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶a將所述dna片段克隆到所述出發(fā)質(zhì)粒1中，得到重組質(zhì)粒1；(b4)選擇符合如下條件的空載sgrna骨架載體作為出發(fā)質(zhì)粒2：自上游到下游依次含有所述iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列、sgrna骨架序列2、loxp序列、篩選標(biāo)簽序列2、loxp序列、啟動子2、所述iis型限制性內(nèi)切酶b的識別序列；(b5)基于goldengate拼裝技術(shù)，采用所述iis型限制性內(nèi)切酶b將所述重組質(zhì)粒1與所述出發(fā)質(zhì)粒2進(jìn)行重組，得到能夠同時表達(dá)所述sgrna1和所述sgrna2且攜帶有“l(fā)oxp序列-篩選標(biāo)簽序列2-loxp序列”的重組質(zhì)粒2；(b6)通過cre/loxp位點(diǎn)重組將所述重組質(zhì)粒2中的所述篩選標(biāo)簽序列2刪除，得到重組質(zhì)粒3，所述重組質(zhì)粒3即為所述雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明基于goldengate拼接技術(shù)，開發(fā)了兩步同時串聯(lián)或隨機(jī)雙敲除sgrna文庫的構(gòu)建方法，與現(xiàn)有方法相比，操作更加簡便且大大縮短了構(gòu)建時間。本發(fā)明對于鑒定非編碼區(qū)基因的生物學(xué)功能以及鑒定基因與基因的相互作用具有重要意義。附圖說明圖1為實(shí)施例1構(gòu)建串聯(lián)雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的流程圖。圖2為實(shí)施例2構(gòu)建雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、串聯(lián)雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及鑒定本實(shí)施例設(shè)計了12000條dna片段，每條dna片段均含有兩條sgrna的間隔rna(spacerrna，即sgrna中用于識別靶標(biāo)序列的序列)編碼序列，利用goldengate無縫拼接技術(shù)，利用芯片合成oligo文庫，首先利用goldengate技術(shù)，將dna片段插入到缺少sgrna的間隔rna編碼序列的表達(dá)載體中，然后利用goldengate技術(shù)將第一個sgrna公用骨架和第二個sgrna的啟動子序列插入到載體中。最終實(shí)現(xiàn)了成功構(gòu)建出7908條sgrna對雙敲除質(zhì)粒文庫。具體流程見圖1。一、串聯(lián)雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的構(gòu)建1、pd408質(zhì)粒(plenti-u6-bsai-lacz-bsai-cmv-bla)的核酸序列為序列1，其中序列第1238-1497位核苷酸為啟動子u6的序列，第1504-1499位為第一個iis型限制性內(nèi)切酶bsai的識別序列，第1494-1497位為第一個iis型限制性內(nèi)切酶bsai酶切后產(chǎn)生的粘性末端overhang，第1507-1944位核苷酸為lacz序列，第1965-1970位為第二個iis型限制性內(nèi)切酶bsai的識別序列，第1972-1975位為第二個iis型限制性內(nèi)切酶bsai酶切后產(chǎn)生的粘性末端overhang，第2075-2705位核苷酸為cmv序列，第2796-3194位核苷酸為bla序列。該載體為空載的sgrna骨架載體。2、將設(shè)計的12000種寡核苷酸鏈合成在生物芯片上，其中10個寡核苷酸鏈的序列為序列表中序列6-序列15，以做示例。這12000種寡核苷酸鏈中，每種寡核苷酸鏈序列的第1-20位核苷酸為前向引物的序列，第21-26位核苷酸為第一個iis型限制性內(nèi)切酶bsai的識別序列，第28-31位為第一個iis型限制性內(nèi)切酶bsai酶切后產(chǎn)生的粘性末端overhang，第32-50位核苷酸為一個sgrna(sgrna1)的間隔rna(spacerrna)的編碼序列，第56-61位核苷酸為第一個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i(bsmbi)的識別序列，第51-54位為第一個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i酶切后產(chǎn)生的粘性末端overhang，第68-73位核苷酸為第二個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i的識別序列，第75-78位為第二個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i酶切后產(chǎn)生的粘性末端overhang，第79-98位核苷酸為另一個sgrna(sgrna2)的間隔rna(spacerrna)的編碼序列，第104-109位核苷酸為第二個iis型限制性內(nèi)切酶bsai的識別序列，第99-102位為第二個iis型限制性內(nèi)切酶bsai酶切后產(chǎn)生的粘性末端overhang，第110-129位核苷酸為反向引物的結(jié)合序列。這12000種寡核苷酸鏈的前向引物與反向引物共10對(如表1所示)，根據(jù)前向引物和反向引物的不同，將這12000種寡核苷酸鏈分為10個亞庫，從而分別進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，減少實(shí)驗(yàn)誤差。這12000種寡核苷酸鏈的區(qū)別僅在于：前向引物和反向引物的序列以及間隔rna的編碼序列。每個亞庫中寡核苷酸鏈的前向引物和反向引物均分別相同，每個亞庫中寡核苷酸鏈的不同之處僅在于每兩個寡核苷酸鏈間的間隔rna的編碼序列均不同。表1擴(kuò)增寡核苷酸鏈文庫的引物文庫序號前向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)1tggtgataggtaaggatggcgtaatcgcaatactgagccg2tcgacaccactatacaccactctttatactctcacgggcc3catgtagtgcagccattctctacttttgattgctgtgccc4tctaggtttcggcttcatgttatagttcctcccatgcacc5atactgctgggctggatatctcctgagagaatacggatgc6acccaaagaactcgattcctacctcctcactccatttagc7agtcttaggcttggagtgtcgggatcactactcagcctac8gctctccgctatcagtaacatgggtctagtgaacttcgtc9gcctatcctctagttctgcctcgagttagattgtcacccc10aacacacctacctctagcacgtctggtccctgtagtgttc11atgggaggtgatactaacgcactacgatccaatcccttgc3、洗脫生物芯片上的寡核苷酸鏈，利用表1中的前向引物和反向引物擴(kuò)增相應(yīng)亞庫寡核苷酸序列，得到12000種dna片段組成的dna片段文庫。4、利用goldengate技術(shù)，采用iis型限制性內(nèi)切酶bsai將dna片段文庫中的dna片段插入到pd408質(zhì)粒中，因?yàn)閜d408質(zhì)粒中含有l(wèi)acz序列，所以空載體在藍(lán)白篩選過程中顯藍(lán)色，而插入成功的重組載體中由于缺失lacz序列，因此刮取絕大多數(shù)白斑菌落進(jìn)行下一步反應(yīng)。5、取第4步的反應(yīng)所得重組質(zhì)粒，與pds143質(zhì)粒(sgrna-amp-h1)進(jìn)行第二步goldengate反應(yīng)，pds143質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中序列2，其中第1271-1276位為第一個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i的識別序列，第1278-1360位核苷酸為sgrna骨架編碼序列，第1529-2487位核苷酸為氨芐青霉素序列，第2591-2835位核苷酸為h1啟動子序列；第2837-2842位為第二個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i的識別序列。通過goldengate反應(yīng)拼裝，采用iis型限制性內(nèi)切酶esp3i將pds143質(zhì)粒中的sgrna骨架與h1啟動子插入到第4步反應(yīng)所得的重組質(zhì)粒中，因?yàn)閜ds143質(zhì)粒中含有amp抗性基因，因此重組正確的載體中攜帶有amp(r)所示的抗生素抗性基因，利用壯觀霉素(pd408質(zhì)粒中攜帶spec(r)表示的壯觀霉素抗性基因)和氨芐青霉素雙抗性篩選得到第二次goldengate重組正確質(zhì)粒文庫，即為串聯(lián)雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫。二、串聯(lián)雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的鑒定為了驗(yàn)證步驟一所構(gòu)建的文庫覆蓋度情況，因?yàn)殡psgrna表達(dá)體系兩條sgrna之間長度大于一般illumina高通量測序文庫要求的800bp，因此本發(fā)明采用了環(huán)化測序法驗(yàn)證文庫構(gòu)建情況。具體操作如下：選取pd408質(zhì)粒(plenti-u6-bsai-lacz-bsai-cmv-bla)，根據(jù)u6啟動子上游的agei酶切位點(diǎn)和cmv啟動子上游的xhoi酶切位點(diǎn)，對步驟一所得的質(zhì)粒文庫進(jìn)行agei和xhoi雙酶切。通過預(yù)先退火的linker寡核苷酸雙鏈與酶切片段進(jìn)行連接，連接片段不再有agei和xhoi酶切位點(diǎn)。表2為linker寡核苷酸鏈的序列。表2linker寡核苷酸鏈的序列正向核苷酸鏈序列(5’-3’)反向核苷酸鏈序列(5’-3’)tcgatatcctgatatgaataaattgcagtgccggcactgcaatttattcatatcaggata由于表1中的前向引物是根據(jù)h1啟動子的序列進(jìn)行設(shè)計的，后向引物是根據(jù)sgrna后的序列的序列進(jìn)行設(shè)計的，因此采用前向引物和后向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，前向引物結(jié)合在h1啟動上，反向引物結(jié)合在第一條sgrna后端，從而可以特異性擴(kuò)增兩條sgrna表達(dá)序列。將含有兩條sgrna的pcr片段進(jìn)行illumina高通量測序，得到設(shè)計的寡核苷酸文庫的豐度和覆蓋度。結(jié)果顯示：根據(jù)illumina高通量測序結(jié)果，成功的構(gòu)建了7908個雙sgrna文庫質(zhì)粒。因此，證明利用goldengate拼裝技術(shù)，可以有效的構(gòu)建串聯(lián)sgrna表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)施例2、雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及鑒定本實(shí)施例開發(fā)了雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的構(gòu)建方法，利用u6和7sk啟動子分別表達(dá)兩條sgrna，基于goldengate拼接技術(shù)，將兩個用于表達(dá)sgrna的間隔rna(spacerrna)的dna片段隨機(jī)連接到終載體中，從而得到雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒，成功的應(yīng)用于84個基因的雙敲除載體文庫構(gòu)建。具體流程見圖2。一、雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的構(gòu)建1、批量合成了84個基因每個三對共6種寡核苷酸鏈(每種寡核苷酸鏈均編碼sgrna的間隔rna)(84個基因共計504種寡核苷酸鏈)，以及40種作為對照的寡核苷酸鏈，共計544種寡核苷酸鏈。其中一個基因的6種寡核苷酸鏈的序列為序列表中序列16-21。這544種寡核苷酸鏈分為兩類：第一類的第1-4位為粘性末端overhang；第二類的第20-23位為粘性末端overhang，每類的粘性末端overhang可以與esp3i或bsai的粘性末端overhang兼容。2、將第一步合成的84個基因的504種寡核苷酸鏈，進(jìn)行退火和磷酸化，退火磷酸化后得到的每個dna片段(雙鏈dna)的兩端分別各含有一個粘性末端overhang。3、pdc007質(zhì)粒(esp3i-u6-bsai-lacz-bsai-sgrna-esp3i)的核酸序列為序列表中序列3，其中第738-743、1531-1536位核苷酸為兩個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i的識別序列，第747-1015位核苷酸為啟動子u6的表達(dá)序列，第1017-1022、1436-1441位核苷酸為兩個iis型限制性內(nèi)切酶bsai的識別序列，第1023-1435位核苷酸為lacz基因序列，第1443-1524位核苷酸為sgrna共用骨架編碼序列。pdc007質(zhì)粒中兩個iis型限制性內(nèi)切酶bsai切割產(chǎn)生的粘性末端overhang分別與步驟2得到的雙鏈dna的兩端的粘性末端overhang兼容(即兩個目的片段的粘性末端overhang互補(bǔ)配對)。首先將第2步的磷酸化產(chǎn)物，基于goldengate拼裝技術(shù)，采用iis型限制性內(nèi)切酶bsai連接到pdc007質(zhì)粒中。因?yàn)閜dc007質(zhì)粒中含有l(wèi)acz序列，所以空載體在藍(lán)白篩選過程中顯藍(lán)色，而連接成功的重組載體中由于缺失lacz序列，因此刮取絕大多數(shù)白斑菌落進(jìn)行以下反應(yīng)。4、pdc002質(zhì)粒(esp3i-7sk-bsai-lacz-bsai-sgrna-esp3i)的核酸序列為序列表中序列4，其中第743-738、1583-1588位核苷酸為兩個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i的識別序列，第749-1007位核苷酸為啟動子7sk的表達(dá)序列，第1009-1014、1428-1433位核苷酸為兩個iis型限制性內(nèi)切酶bsai的識別序列，第1016-1427位核苷酸為lacz基因序列，第1435-1517位核苷酸為sgrna共用骨架編碼序列。pdc002質(zhì)粒中兩個iis型限制性內(nèi)切酶bsai切割產(chǎn)生的粘性末端overhang分別與步驟2得到的雙鏈dna的兩端的粘性末端overhang兼容(即兩個目的片段的粘性末端overhang反向互補(bǔ))。首先將第2步的磷酸化產(chǎn)物，基于goldengate拼裝技術(shù)，采用iis型限制性內(nèi)切酶bsai連接到pdc002質(zhì)粒中。因?yàn)閜dc002質(zhì)粒中含有l(wèi)acz序列，所以空載體在藍(lán)白篩選過程中顯藍(lán)色，而連接成功的重組載體中由于缺失lacz序列，因此刮取絕大多數(shù)白斑菌落進(jìn)行以下反應(yīng)。5、pdc005質(zhì)粒(plenti-esp3i-lacz-esp3i-hef1a-eyfp-puro)的核酸序列為序列表中序列5，其中第1206-1211、1625-1630位核苷酸為兩個iis型限制性內(nèi)切酶esp3i的識別序列，第1212-1618位核苷酸為lacz基因序列，第1733-2825位核苷酸為hef1a啟動子序列，第2924-3640位核苷酸為eyfp序列，第3713-4312位核苷酸為puro序列。由于pdc007質(zhì)粒中u6上游的esp3i切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與pdc005質(zhì)粒中的第一個esp3i切割產(chǎn)生的粘性末端overhang兼容，pdc007質(zhì)粒中sgrna下游esp3i切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與pdc002質(zhì)粒7sk啟動子上游的esp3i切割產(chǎn)生的粘性末端overhang兼容，pdc002質(zhì)粒中sgrna下游的esp3i切割產(chǎn)生的粘性末端overhang與pdc005質(zhì)粒的第二個esp3i切割產(chǎn)生的粘性末端overhang兼容，因此可以基于goldengate拼接技術(shù)將步驟3和步驟4獲得的pdc007和pdc002重組產(chǎn)物連接進(jìn)入pdc005質(zhì)粒中。按照步驟2-5利用40種作為對照的寡核苷酸鏈進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。6、構(gòu)建成功的載體在藍(lán)白斑篩選下為白斑，刮取白斑菌落，得到雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫。二、雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫的鑒定通過對雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫進(jìn)行高通量測序，獲得不同子庫(共12個子庫，這12個子庫是將步驟一得到的雙隨機(jī)sgrna表達(dá)質(zhì)粒文庫隨機(jī)分為12部分得到的)的覆蓋度(覆蓋度是指能表達(dá)兩個sgrna的表達(dá)質(zhì)粒占測序總質(zhì)粒數(shù)的百分比)，見表3?？梢钥吹嚼帽緦?shí)施例的方法可以高覆蓋的構(gòu)建隨機(jī)雙sgrna敲除文庫。表3隨機(jī)雙敲除覆蓋度表庫名123456789101112覆蓋度81％77％64％77％76％80％81％78％80％80％80％79％<110>清華大學(xué)、北京合生基因科技有限公司<120>雙sgrna表達(dá)質(zhì)粒及其文庫的構(gòu)建方法<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>10144<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1caaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaac60aaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatat120gagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattagg180agtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaat240aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaat300gacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaattt360gctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagca420gctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggat480ttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggag540taataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaat600taacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaa660gaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacat720aacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggttt780aagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccatt840atcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaaga900agaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcg960tgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaagggggga1020ttggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaacta1080aagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagca1140gagatccagtttggttaattaacaactttgtatagaaaagttggctccgaatttctcgag1200gaattccaattgaccatgaccggtttgtcgacaagcttcccttcaccgagggcctatttc1260ccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaatta1320atttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttc1380ttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaa1440cttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgtga1500gaccgagagagggatccggcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgc1560aactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaaggg1620ggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgt1680aaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccggg1740ccccccctcgaggtcctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggc1800gtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaa1860catacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcac1920attaattgcgttgcgctcactgcccgctttccaccggtgtcgacggtctcagttttagag1980ctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgag2040tcggtgctttttttaaagaattctcgacctcgagacaaatggcagtaccgtattaccgcc2100atgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatgga2160gttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccg2220cccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattg2280acgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatca2340tatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgc2400ccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgc2460tattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactc2520acggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaa2580tcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtag2640gcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgcta2700gttaagggcccggcgcgcctaaggtacccccgggtaactgatcataattcgacccaagtt2760tgtacaaaaaagcaggctgaactctagatgccaccatggccaagcctttgtctcaagaag2820aatccaccctcattgaaagagcaacggctacaatcaacagcatccccatctctgaagact2880acagcgtcgccagcgcagctctctctagcgacggccgcatcttcactggtgtcaatgtat2940atcattttactgggggaccttgtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgctgcgg3000cagctggcaacctgacttgtatcgtcgcgatcggaaatgagaacaggggcatcttgagcc3060cctgcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtga3120aggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatg3180tgtgggagggctaatacccagctttcttgtacaaagtggtgaattccggcaattcgatat3240caagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattct3300taactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgc3360tattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctct3420ttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctga3480cgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgc3540tttccccctccctattgcc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