本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，涉及食品污染物遺傳毒性的評估，尤其是一種利用rpsl基因突變率檢測評估食品污染物遺傳毒性的方法。
背景技術(shù)：
食品污染物是在生產(chǎn)、加工、運輸和儲藏等過程中帶入食品中的污染物質(zhì)，黃曲霉毒素、丙烯酰胺、溴氰菊酯、二惡英及二惡英類多氯聯(lián)苯等，食品污染物經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)均具有致突變性，在食品安全性毒理學(xué)評價中，遺傳毒性試驗常采用細(xì)菌致突變試驗，即鼠傷寒抄門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗，即ames試驗
ames試驗廣泛應(yīng)用于致突變化學(xué)物的初篩，但是在實際應(yīng)用中仍存在以下幾個問題：
1、ames測試只能檢出引起少數(shù)幾個堿基變化導(dǎo)致突變，如堿基置換突變、移碼突變的致突變物，而對于導(dǎo)致dna鏈斷裂及染色體大段缺失而引發(fā)突變的致突變物，則無法檢測它們的致突變性，具有一定的局限性；
2、ames測試試驗程序比較繁瑣，方法不夠簡便，有待于創(chuàng)建新的更為快速靈敏、簡單易行的誘變劑短期生物測試法。
通過對現(xiàn)有公開專利文獻的檢索并未發(fā)現(xiàn)rpsl基因突變率檢測在評估食品污染物遺傳毒性的應(yīng)用，即沒有公開的專利文獻作為現(xiàn)有技術(shù)影響本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種利用rpsl基因突變率檢測評估食品污染物遺傳毒性的方法，該方法靈敏度高且簡便易行，可以測定農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素等諸多食品污染物的遺傳毒性，應(yīng)用這種技術(shù)所獲得的遺傳毒性資料將是食品有毒物質(zhì)資料庫的有力補充，對制定食品安全法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)具有重要理論指導(dǎo)價值。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種利用rpsl基因突變率檢測評估食品污染物遺傳毒性的方法，該方法包括如下步驟：
(1)提取質(zhì)粒pmol21：將分子量為3993bp，帶有375bp的rpsl基因序列，并帶有氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pmol21通過堿裂解法或質(zhì)粒提取試劑盒提取該質(zhì)粒dna；
(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞：采用cacl2法制備mf101感受態(tài)細(xì)胞，并將pmol21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞對鏈霉素敏感；
(3)食品污染物處理：液態(tài)食品污染物直接進行檢測，固態(tài)食品污染物配制成溶液，根據(jù)不同食品污染物的性質(zhì)加入水和有機溶劑進行溶解，并進行梯度稀釋；
(4)基因突變率的檢測：將帶有質(zhì)粒pmol21的大腸桿菌mf101培養(yǎng)至對數(shù)生長期，od600為0.5-0.7，以0.5-1.5：100稀釋至含有食品污染物的液體培養(yǎng)基中，于36-38℃進行振蕩培養(yǎng)，并且以550-650nm處的光吸收值測定細(xì)胞的生長曲線；
(5)食品污染物培養(yǎng)：食品污染物加入到培養(yǎng)基中，各組均培養(yǎng)10個小時后用于rpsl突變頻率的測定，將細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的平板上來確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)，涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素平板上以確定rpsl基因突變的總數(shù)，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于103個；
(6)食品污染物遺傳毒性的評估：選取rpsl基因突變克隆，提取質(zhì)粒dna，測定rpsl突變序列，采用dnaman軟件進行序列比對，對于突變序列進行堿基置換、移碼突變和大片段缺失統(tǒng)計分析，確定食品污染物導(dǎo)致的突變頻率、基因突變熱點和基因突變的主要類型。
而且，步驟(4)中帶有質(zhì)粒pmol21的大腸桿菌mf101培養(yǎng)至對數(shù)生長期，od600為0.6，以1：100稀釋至含有食品污染物的液體培養(yǎng)基中，于37℃進行振蕩培養(yǎng)，并且600nm處的光吸收值測定細(xì)胞的生長曲線。
而且，步驟(5)中含氨芐青霉素的平板與含氨芐青霉素和鏈霉素平板的濃度為50μg/ml。
而且，所述步驟(4)基因突變率的檢測還有另一種體外檢測方法，該方法步驟如下：
a采用帶有rpsl基因的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pmol21，利用scai酶切線性化質(zhì)粒，并利用生物素標(biāo)記的引物進行pcr反應(yīng)，體外擴增質(zhì)粒pmol21，pcr反應(yīng)體系中加入食品污染物；
b將dna擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化、酶切、自連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞mf101，利用氨芐青霉素和鏈霉素篩選rpsl基因突變菌落；
c進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并計算rpsl基因突變率，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于106個；
而且，所述的食品污染物是指在生產(chǎn)、加工、運輸和儲藏過程中帶入食品中的污染物質(zhì)，主要包括農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素中的一種或多種。
本發(fā)明的優(yōu)點效果：
1、本發(fā)明利用rpsl基因突變與鏈霉素抗性篩選，同時用rpsl基因突變率的正向篩選系統(tǒng)進行檢測，正向篩選系統(tǒng)是指僅有質(zhì)粒rpsl基因突變的菌株才能夠檢出，而質(zhì)粒未突變的菌株不得檢出，由于鏈霉素抗性為隱性的遺傳表型，宿主菌mf101的rpsl基因是突變的，只有質(zhì)粒pmol21的rpsl基因同時被誘發(fā)突變才會最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞具備鏈霉素抗性，從而達到正向篩選質(zhì)粒中rpsl突變基因的目的，該正向篩選可以大大提高檢測時間，整個分析過程可以在24小時內(nèi)實現(xiàn)，
2、本發(fā)明所采用的rpsl基因分析背景較低，涉及微生物高溫培養(yǎng)的方法簡單易行，采用rpsl正向選擇系統(tǒng)進行致突變性的評價不需要復(fù)雜的實驗條件，tk基因的自發(fā)突變率在10-5，而rpsl的自發(fā)突變率低至10-6，遠低于同類正向篩選體系，節(jié)省人力物力，檢測快速高效。
3、本發(fā)明所采用體內(nèi)水平基因突變率檢測，利用rpsl基因突變檢測的mf101菌株代替鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株進行ames實驗，加入哺乳動物微粒體酶系，彌補體外實驗缺乏代謝活化系統(tǒng)的不足，并采用平板滲入法檢測食品污染物的致突變性。
4、本發(fā)明所涉及的rpsl基因突變選擇系統(tǒng)是一種靈敏度高且簡便易行的體外短期致突變實驗方法，可以為檢測食品加工過程中產(chǎn)生的潛在致癌物提供一種快速有效的分析方法，rpsl基因突變檢測技術(shù)是基于rpsl基因的復(fù)制保真性來定量檢測遺傳毒性的方法，應(yīng)用這種技術(shù)所獲得的遺傳毒性資料將是食品有毒物質(zhì)資料庫的有力補充，對制定食品安全法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)具有重要理論指導(dǎo)價值。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明提供一種利用rpsl基因突變率檢測評估食品污染物遺傳毒性的方法，該方法包括如下步驟：
(1)提取質(zhì)粒pmol21：將分子量為3993bp，帶有375bp的rpsl基因序列，并帶有氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pmol21通過堿裂解法或質(zhì)粒提取試劑盒提取該質(zhì)粒dna；
(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞：采用cacl2法制備mf101感受態(tài)細(xì)胞，并將pmol21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞對鏈霉素敏感；
(3)食品污染物處理：液態(tài)食品污染物直接進行檢測，固態(tài)食品污染物配制成溶液，根據(jù)不同食品污染物的性質(zhì)加入水和有機溶劑進行溶解，并進行梯度稀釋；
(4)基因突變率的檢測：將帶有質(zhì)粒pmol21的大腸桿菌mf101培養(yǎng)至對數(shù)生長期，od600為0.6，以1：100稀釋至含有食品污染物的液體培養(yǎng)基中，于37℃進行振蕩培養(yǎng)，并且600nm處的光吸收值測定細(xì)胞的生長曲線；
(5)食品污染物培養(yǎng)：食品污染物加入到培養(yǎng)基中，各組均培養(yǎng)10個小時后用于rpsl突變頻率的測定，將細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的平板上來確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)，涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素平板上以確定rpsl基因突變的總數(shù)，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于103個，氨芐青霉素的平板與含氨芐青霉素和鏈霉素平板的濃度為50μg/ml。
(6)食品污染物遺傳毒性的評估：選取rpsl基因突變克隆，提取質(zhì)粒dna，測定rpsl突變序列，采用dnaman軟件進行序列比對，對于突變序列進行堿基置換、移碼突變和大片段缺失統(tǒng)計分析，確定食品污染物導(dǎo)致的突變頻率、基因突變熱點和基因突變的主要類型。
基因突變率的檢測還有另一種體外檢測方法，該方法步驟如下：
a采用帶有rpsl基因的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pmol21，利用scai酶切線性化質(zhì)粒，并利用生物素標(biāo)記的引物進行pcr反應(yīng)，體外擴增質(zhì)粒pmol21，pcr反應(yīng)體系中加入食品污染物；
b將dna擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化、酶切、自連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞mf101，利用氨芐青霉素和鏈霉素篩選rpsl基因突變菌落；
c進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并計算rpsl基因突變率，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于106個；
上述所述的食品污染物是指在生產(chǎn)、加工、運輸和儲藏過程中帶入食品中的污染物質(zhì)，主要包括農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素中的一種或多種。
本發(fā)明涉及方法的原理：
本發(fā)明是通過rpsl基因在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外復(fù)制中發(fā)生突變，引起微生物細(xì)胞鏈霉素抗性的表型變化，測定食品污染物影響rpsl基因的突變頻率，并通過測序的方法確定突變形式，從而達到的評估食品污染物遺傳毒性的目的。本發(fā)明主要利用rpsl基因突變率正向篩選系統(tǒng)，測定食品污染物在體內(nèi)外引發(fā)的rpsl基因突變率，是一種靈敏度高而且簡便易行的體外短期致突變評估方法，可以測定農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素等諸多食品污染物的遺傳毒性。
其中，利用rpsl基因的抗性主要是由rpsl基因編碼的核糖體蛋白s12可以與鏈霉素(sm,streptomycin)形成復(fù)合物，并增強鏈霉素與細(xì)菌16srrna結(jié)合的能力，從而阻止了轉(zhuǎn)錄的起始，這就是鏈霉素藥理作用的基礎(chǔ)。若rpsl基因發(fā)生突變，將破壞16srrna與鏈霉素的相互作用，從而導(dǎo)致微生物細(xì)胞對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性。
正向篩選系統(tǒng)是指僅有質(zhì)粒rpsl基因突變的菌株才能夠檢出，而質(zhì)粒未突變的菌株不得檢出。由于鏈霉素抗性為隱性的遺傳表型，宿主菌mf101的rpsl基因是突變的，只有質(zhì)粒pmol21的rpsl基因同時被誘發(fā)突變才會最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞具備鏈霉素抗性，從而達到正向篩選質(zhì)粒中rpsl突變基因的目的。
利用rpsl基因突變檢測的mf101菌株代替鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株進行ames實驗，加入哺乳動物微粒體酶系，彌補體外實驗缺乏代謝活化系統(tǒng)的不足，并采用平板滲入法檢測食品污染物的致突變性。
實施例1
采用rpsl測定體內(nèi)條件下納米材料對rpsl基因突變率的影響，評估食品污染物納米級食品保鮮材料的遺傳毒性。
本實驗選取兩種納米級食品保鮮材料進行突變率檢測，納米材料加入培養(yǎng)基，并加入哺乳動物微粒體酶系，檢測大腸桿菌mf101/pmol21的rpsl位點的誘導(dǎo)突變頻率。以溶劑組作為對照組，每組至少三次重復(fù)，并采用平板滲入法檢測食品污染物的致突變性，rpsl基因突變率結(jié)果見表1，其中材料1的突變率3.56×10-6高于對照組1.29×10-6。
表1.體內(nèi)條件下，兩種納米級食品保鮮材料對rpsl基因突變率的影響
實施例2
采用rpsl測定體外條件下納米材料對rpsl基因突變率的影響，評估食品污染物納米級食品保鮮材料的遺傳毒性。
本實驗選取兩種納米級食品保鮮材料進行突變率檢測，進行體外基因擴增質(zhì)粒pmol21，以溶劑組作為對照組，每組至少三次重復(fù)。將擴增產(chǎn)物進行連接和轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞mf101，統(tǒng)計rpsl基因突變率，突變率結(jié)果見表2，納米材料2的突變率為2.64％高于對照組。
表2.體外條件下，兩種納米級食品保鮮材料對rpsl基因突變率的影響
實施例3
采用rpsl測定體內(nèi)條件下，丙烯酰胺對rpsl基因突變率的影響，評估食品污染物丙烯酰胺的遺傳毒性。
本實驗將不同濃度的丙烯酰胺加入到培養(yǎng)基中，各組均培養(yǎng)10個小時后用于進行培養(yǎng)基平板涂布，測定不同濃度的丙烯酰胺對大腸桿菌mf101/pmol21的rpsl位點的誘導(dǎo)突變頻率。以溶劑蒸餾水作為對照組，總菌數(shù)不低于10-6，所得結(jié)果如表3所示，梯度濃度的丙烯酰胺下的突變頻率具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，1mg/ml的丙烯酰胺突變率達到28.11×10-6，遠高于對照組1.85×10-6。
表3.體內(nèi)條件下，丙烯酰胺對rpsl基因突變率的影響